无菌实验技术：使用血清移液管和微量移液器进行体积转移

摘要

在实验室工作时，必须尽量减少污染源。无菌技术是指在转移培养物和试剂时，避免其接触非无菌表面的操作方法。血清移液管和微量移液器可用于精确量取液体体积，同时确保实验中所用溶液的无菌性不受影响。

摘要

微生物无处不在——存在于空气、土壤、人体以及实验室台面和计算机键盘等无生命物体表面。微生物的普遍存在为实验室带来了大量潜在的污染物。为了确保实验成功，必须尽量减少设备和工作表面上的污染物数量。微生物学的许多实验中普遍涉及对含有细菌细胞或病毒颗粒的培养物进行测量和转移的操作。为避免接触非无菌表面或污染无菌培养基，需要做到以下几点：（1）准备一个无菌的工作空间；（2）精确设定并准确读取仪器，以实现液体的无菌转移；（3）在无菌区域内正确操作仪器、培养瓶、瓶子和试管。掌握这些操作需要培训和练习。起初，动作应缓慢、有意识且受控，目标是使无菌操作在实验台工作中变得自然熟练。本文将介绍在本生灯火焰所形成的无菌区域内，使用血清移液管和微量移液器测量液体体积的步骤。根据所用仪器的不同，体积范围从微升（μl）到毫升（ml）不等。常见的转移液体包括无菌肉汤或化学溶液，以及细菌培养物和噬菌体储备液。通过遵循这些操作步骤，学生应能够：•在本生灯火焰所形成的无菌区域内进行操作；•使用血清移液管时不破坏仪器的无菌状态；•使用血清移液管吸取液体时，通过将液体形成的弯月面与移液管上的刻度线对齐，精确读取标定体积；•在液体转移过程中保持培养瓶、培养瓶、试管及其相应瓶盖的无菌状态；•识别塑料与玻璃血清移液管的不同应用场景；•说明微量移液器的准确度限制；•精确且准确地设定微量移液器的体积；•掌握如何正确使用微量移液器的第一档和第二档来吸取和转移准确体积的液体。

方案

1. 准备无菌工作区

1. 开始工作区域内的任何灭菌操作前，需用抗菌皂和温水彻底清洗双手。
   • 一旦怀疑实验操作过程中手部受到污染，应立即重新洗手。
2. 清理实验台工作区域上所有杂乱的物品。从容器中取出一张预湿润的消毒湿巾，擦拭整个台面。让消毒剂自然蒸发，切勿擦干！
   • 可使用酒精（异丙醇或70%乙醇）或酚类化合物（邻苯基苯酚）等消毒剂。
   • 为防止产生含有细菌细胞的细小气溶胶（即气溶胶化）并扩散微生物污染物，请避免使用挤压瓶倾倒消毒剂。
   • 使微生物干燥失水是表面去污染最有效的方法之一。
   • 即使此前有人使用过实验台且台面已用消毒剂擦拭过，开始实验前也必须重新擦拭台面。
3. 待消毒剂完全干燥后，使用点火器点燃本生灯。调节火焰，使火焰中央可见蓝色锥形部分。此时火焰产生上升气流，即热空气从火焰处向上流动形成的对流（图1）。随着热空气上升，微生物和灰尘颗粒被推离工作区域。在整个操作过程中，本生灯应始终保持开启状态，并始终在此形成的无菌区域（即无菌区）内缓慢、谨慎且有条不紊地操作。
   • 蓝色锥体的顶端是火焰温度最高的部分。
   • 注意避免因快速移动而扰乱上升气流，从而显著改变实验台周围的空气流动。利用本生灯产生上升气流，可最大限度减少微生物和灰尘落入工作区的开放瓶、试管或烧瓶中。
4. 将实验所需的所有物品有序放置在靠近无菌区的实验台上，并确保所有材料均已正确标记。
   • 所需物品可能包括血清移液管和微量移液器、无菌培养管、无菌烧瓶、含液体培养基的培养基瓶、无菌微量离心管、移液器吸头、试管架、细菌培养物以及噬菌体储备液。
   • 液体培养基应在高压灭菌锅中于121 °C、液体模式下灭菌至少15分钟。较大体积的培养基（> 1L）需要更长的灭菌时间。实验器具应在高压灭菌锅中于121 °C、重力（干燥）模式下灭菌至少30分钟。
   • 通常情况下，无菌溶液可在4 °C下保存长达5个月。但含有不稳定成分（如抗生素）的溶液保存时间显著缩短，应始终参考生产商的建议。

2. 使用血清移液管转移液体

1. 移液管有多种规格和类型：塑料或玻璃材质，一次性或可重复使用，带棉塞或不带棉塞。其标定容量范围从 0.1 ml 到 25 ml。
   • 常见的移液管规格为 5 ml、10 ml 和 25 ml，适用于 0.1 ml 及以上体积的无菌液体转移（图2 面板 A）。也有更大容量的移液管，最大可输送 100 ml 的液体；但本实验方案主要关注更常用的小型移液管。
   • 微生物学和组织培养实验需使用带棉塞的预灭菌移液管。棉塞不应从移液管顶部移除，其设计目的是防止液体过度吸入移液管内。
   • 不同应用需选择塑料或玻璃移液管。有机溶剂操作必须使用玻璃移液管。在实验台面上进行 BSL-1 实验时，两种材质均可使用。在生物安全柜中处理 BSL-2 生物材料且无法使用本生灯时，只能使用塑料移液管。此外，转移熔融琼脂的操作也推荐使用塑料移液管。
   • 移液管分为两类：TC（“容纳式”，to contain）和 TD（“输送式”，to deliver）。TC 移液管需将全部液体（包括尖端残留）完全排出，必须“吹出”或冲洗以获得标定体积。TD 移液管已校准为尖端保留微量液体，该部分不应排出。务必检查移液管上端管体上的标签以确认其类型（图3）。最常用的是 TD 移液管，其顶部标有双环标记。
2. 取一支无菌塑料移液管（也称为体积转移移液管），小心撕开带棉塞一端的纸质外包装，操作方式如同剥香蕉皮——不要完全移除外包装，以保护将接触待转移液体的移液管尖端。仅用手接触移液管上部（刻度线以上部分）。
   • 切勿使用已使用过的移液管插入无菌溶液中，即使已极其小心地保持其无菌状态。
   • 玻璃移液管通常存放在金属筒形容器中（图2 面板 B）。松开容器盖后小心取下，并用火焰灼烧盖子和容器开口端。将盖子侧放于已消毒的实验台面。手持容器水平放置，轻轻晃动使一两支移液管顶部露出约 2.5 cm，便于抓取。将容器侧放后取出一支移液管，注意不要触碰容器内其他移液管。切勿用手接触移液管底部尖端，避免尖端接触其他非无菌表面。
3. 在移液管上端安装移液辅助装置，如吸球、泵或移液枪。移除塑料移液管的纸质外包装。用右手握住移液辅助装置。
   • 若使用玻璃移液管，将移液管底部三分之一部分通过本生灯火焰的蓝色锥形区域 1–3 秒，并在通过火焰时旋转 180°。塑料移液管和塑料管不可灼烧。
   • 若为左利手，用左手握住移液辅助装置，并用右手操作培养瓶和试管等后续操作。
   • 使用塑料移液管时，当从外包装中抽出最后几厘米时容易发生污染，因为无菌的尖端会接触到被手触碰过的包装部分。
4. 取下装有无菌培养基的瓶子的瓶盖。不要将瓶盖放置在实验台上，而应将其夹持在右手无名指与掌心之间，同时用同一只手的拇指、食指和中指操作移液辅助装置（图4）。将瓶子倾斜约 45°，使瓶口通过本生灯火焰，从而在敞口瓶周围形成无菌区域。
   • 尽管应尽量避免，若必须放置瓶盖，应将其内面朝下置于已消毒的表面上。若瓶盖朝上放置，物体或手部移动产生的气流更易导致微生物和灰尘颗粒沉降到瓶盖内表面。
   • 灼烧的主要目的并非灭菌，而是加热瓶口并产生向上的对流气流（即上升气流），热空气上升有助于防止灰尘颗粒和其他污染物进入瓶内。
   • 应尽可能缩短无菌容器的敞口时间。在整个操作过程中，尽量减少空气微生物进入的机会至关重要。
   • 当无菌容器处于敞口状态时，避免咳嗽、打喷嚏、说话及其他无意的动作。
   • 一旦瓶口、试管口、瓶盖内侧等无菌区域经过本生灯火焰处理后，切勿将手或手指从其上方越过。
   • 打开无菌试管或瓶子时，必须使用明火操作。实验台上任何时候不得同时打开超过一个试管、瓶子或烧瓶。在打开和关闭试管、瓶子或烧瓶时，应立即进行火焰灼烧处理。
5. 将移液管尖端插入装有无菌培养基的瓶子中，然后吸取液体样本。使用移液辅助装置控制液体流入移液管的速度。通过将液柱弯月面与移液管上的刻度线对齐，精确读取吸入的液体体积（图5）。
   • 严禁用口吸液！ 必须始终使用移液辅助装置（泵、吸球或移液枪）。
   • 读取体积时需注意数字的排列顺序。数字可能从尖端向顶部排列，或相反，有时两种方向均有标注。
   • 读数时，始终将移液管垂直持握，与地面垂直，并在眼睛水平位置正视液面弯月面。
   • 移液管的精度仅限于最小刻度单位，通常 5 ml 和 10 ml 移液管为 0.1 ml，25 ml 移液管为 0.2 ml。若需要更高精度，可将移液管与微量移液器联合使用。
6. 再次将瓶口通过本生灯火焰灼烧，然后盖上瓶盖。将培养基瓶放置一旁。
   • 关闭瓶子时切勿因匆忙而被本生灯烫伤。
7. 用左手持握试管或烧瓶。按步骤 #4 所述方法取下并持握瓶盖。通过本生灯火焰灼烧试管或烧瓶口，建立无菌区域。
8. 将移液管中的培养基排入试管或烧瓶中。控制液体流速，防止液体溅出试管或烧瓶。
   • 可采用完全排空方式输送全部体积，使移液管自然排尽；也可采用点对点转移方式（从一个刻度到另一个刻度）实现特定体积的转移。
9. 再次将试管或烧瓶口通过本生灯火焰灼烧，然后盖上瓶盖。将试管或烧瓶放置一旁。取下移液辅助装置，并将移液管丢弃至指定的废弃物容器中。
   • 塑料移液管为一次性使用，而玻璃移液管可灭菌后重复使用。正确处理方式为：塑料移液管应放入指定的锐器容器（内衬塑料垃圾袋的硬质盒子）；玻璃移液管应先浸入含 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以消毒内外表面，随后用实验室洗涤剂彻底清洗，用去离子水冲洗干净，并在高压灭菌器中灭菌。
10. 在将细菌培养物或噬菌体原液接种至培养基，或进行系列稀释操作时，也应遵循上述相同步骤。

3. 使用微量移液器转移液体

1. 使用微量移液器（也称为 Pipetman；图6 的 A 面板）可以精确测量和分配微小体积的液体。这些仪器有不同规格，每种具有特定的体积范围：P2 用于 0.2–2 μl，P10 用于 1–10 μl，P20 用于 2–20 μl，P200 用于 20–200 μl，P1000 用于 200–1000 μl。
   • 微量移液器为精密仪器，需小心操作。切勿将其随意放置在实验台上无人看管，以免被碰落损坏。切勿让移液器接触腐蚀性化学品。
   • 对于大于 1000 μl 的体积，应使用刻度移液管。
   • 尽管操作在本生灯产生的无菌区域内进行，但切勿对微量移液器、试管或塑料吸头进行火焰灭菌。试管和吸头应预先灭菌。使用前可用预浸润的消毒湿巾擦拭微量移液器表面。
2. 通过旋转调节旋钮可设定显示分配体积的数字量程器。在进入第 3 步之前，务必先 调节体积。
   • 切勿将调节旋钮旋转至超出其指定范围！
   • 当在微量移液器上减小设定体积以获得最大精度时，应缓慢向下旋转拇指轮，确保不越过刻度标记。
   • 当在微量移液器上增大设定体积以获得最大精度时，先向上旋转拇指轮，超过目标刻度标记约 1/3 圈，然后缓慢向下旋转至目标体积，确保不越过刻度标记。
   
   量程器显示三位数字。根据不同的微量移液器，数字的解读方式有所不同。请注意，每支微量移液器的精度仅能达到最小刻度标记的水平。
   P2： 适用于 0.2–2.0 μl 之间的体积。第一位数字表示微升数；第二位数字表示十分之一微升（0.1 μl），第三位数字表示百分之一微升（0.01 μl）。每个刻度标记代表千分之二（0.002 μl）的增量。
   P10： 适用于 1.0–10.0 μl 之间的体积。第一位数字表示十微升位，通常设为“0”，仅当分配 10.0 μl 且其余两位数字均为“0”时才设为“1”。中间数字表示微升数，第三位数字表示十分之一微升（0.1 μl）。每个刻度标记代表百分之二（0.02 μl）的增量。
   P20： 适用于 2.0–20.0 μl 之间的体积。黑色的第一位数字表示十微升位，仅当分配 20.0 μl 且其余两位数字均为“0”时才设为“2”。第二位黑色数字表示微升数，第三位红色数字表示十分之一微升（0.1 μl）。每个刻度标记代表百分之二（0.02 μl）的增量。
   P200： 适用于 20.0–200 μl 之间的体积。第一位数字表示百微升位，仅当分配 200 μl 且其余两位数字均为“0”时才设为“2”。中间数字表示十微升位，第三位数字表示微升数。每个刻度标记代表十分之二（0.2 μl）的增量。
   P1000： 适用于 200–1000 μl 之间的体积。第一位数字表示千微升位，通常设为“0”，仅当分配 1000 μl 且其余两位数字均为“0”时才设为“1”。中间数字表示百微升位，末位数字表示十微升位。每个刻度标记代表 2 μl 的增量。
   
   • 性能检查： 这些仪器应每年校准一次，以确保准确性和精密度维持在规格的 ±5% 以内。使用分析天平测量水的重量，确认最小和最大设定值对应预期体积。例如，使用 P1000 将 200 μl 水转移至天平上的称量皿中。由于水的密度为 1，1 ml 水相当于 1 克（g）。因此，200 μl（0.2 ml）水应等于 0.2 g。同时，确保吸头无泄漏，并能通过活塞系统在分配前保持目标体积。
3. 微量移液器必须始终配合一次性塑料吸头使用。将吸头紧密套在移液器筒管末端，向下按压并轻微旋转，以确保形成气密性密封。
   • 吸头通常装在可高压灭菌的塑料盒中。打开吸头盒取用吸头后，应立即关闭盒盖，以减少与空气中污染物的接触。
   • 某些吸头带有类似刻度移液管中棉塞的过滤层。这类吸头通常比普通吸头更昂贵，因此用于特殊应用。例如，在测量氯仿等挥发性化学品或 ³²P 标记的 DNA 等放射性液体时，使用带滤芯吸头有助于防止微量移液器筒管被污染。
4. 以垂直方向持握微量移液器。
   • 保持移液器直立可防止液体流入内部，避免筒管被污染。
5. 微量移液器具有三个位置：（1）静止位，（2）第一停点，和（3）第二停点（图6，B 面板）。该仪器采用双停点活塞系统。第一停点具有两个功能：其一是当从第一停点释放活塞回到静止位时，将目标体积的液体吸入吸头；其二是当从静止位按压活塞至第一停点时，将吸头中大部分液体排出。进一步将活塞按压至第二停点，可排出吸头中残留的液体。
   从静止位将活塞推钮按压至第一停点，此时将排出等于设定体积的空气。
6. 在保持推钮按压至第一停点的同时，将吸头浸入液体中。
   • 切勿让移液器本体接触瓶、管或烧瓶的内壁，否则这些容器的内表面将被污染。只有吸头是无菌的。
7. 缓慢释放推钮，将液体吸入吸头。当推钮回到静止位时停止操作，并稍作等待，使液体完全进入吸头。
   • 吸头中的液体体积应等于微量移液器的设定体积。
   • 含有甘油等粘稠液体需要更长时间才能完全进入吸头。
8. 将吸头从液体中取出，目视检查吸头，确认吸入的液体已达到预期液面高度，且吸头内无气泡。
   • 如有必要，排出液体并手动重新拧紧吸头，再次吸取液体并检查。
9. 将吸头以 10° 至 45° 角倾斜靠在接收液体的试管内壁上。为排出液体，缓慢按压活塞推钮至第一停点，稍等片刻后继续按压至第二停点，以排出吸头中残留的液体。
   • 过快按压活塞可能导致液体飞溅，或在试管中产生不希望的气泡。
10. 在将活塞释放回静止位之前，先将吸头从液体中移出。
11. 通过按压微量移液器上的弹射按钮，将吸头弃入指定的锐器废弃物容器中。

4. 清理工作区

1. 完成需要无菌技术的实验后，关闭本生灯，然后将所有用品和试剂收好。使用预先浸湿的消毒擦拭巾清洁实验器具（如瓶子、移液器、移液器吸头盒）的外表面，以确保不会将污染物带入储存区域。
2. 将受污染的玻璃器皿和危险废物放入指定的废弃物容器中。实验室废弃物包括手套、移液器、枪头和离心管等实验耗材。使用非致病性生物体（生物安全等级1级，BSL-1）进行实验时产生非感染性危险废物，而使用致病性生物体（生物安全等级2级或以上，BSL-2及以上）时则产生感染性危险废物。感染性废物在丢弃前必须经过高压灭菌或消毒处理。请遵循《微生物和生物医学实验室生物安全手册》（BMBL，第5版）中描述的实验室安全指南。^th （编辑）以及美国职业安全与健康管理局（OSHA）和机构环境健康与安全部门提供的指南。
3. 用容器中的预浸消毒湿巾擦拭实验台上的整个工作区域，并再次让消毒剂自然蒸发。
4. 使用抗菌皂和温水彻底洗手，然后离开实验室。

5. 代表性结果

使用血清移液管转移液体的一个示例应用如下所示 图7这些移液管常用于微生物学实验室，以制备用于接种细菌培养物的培养基。例如，无菌烧瓶首先加入特定体积的培养液，此处为LB培养基（Luria Broth），然后加入少量细胞（如 大肠杆菌) 加入培养基中。使用血清移液管，首先须将肉汤从培养基瓶无菌转移至锥形瓶中。本实验中，使用 25 ml 血清移液管将 25 ml LB 加入 125 ml 无菌锥形瓶中。接下来，须用菌种接种肉汤 E. coli 细胞。此处，10 μ将之前培养的细胞培养瓶中的细胞，用P20移液器无菌转移至25 ml新鲜LB培养基中。将培养瓶置于培养箱中孵育一定时间，使细胞得以增殖（本示例中， E. coli 细胞在37℃下孵育过夜 °在摇床平台上振荡）。结果得到浑浊的细菌培养液，可用于后续实验。

血清移液管也可用于将最初装在瓶中的培养基转移至试管，或在试管之间转移，例如在对细菌培养物进行系列稀释时的操作。若在整个培养基操作过程中未能保持无菌技术，则培养物将被污染，后续使用这些培养物的实验将被迫延迟，因为必须重新制备新鲜且未被污染的培养物。错误通常源于操作过程中未能维持无菌环境。例如，可能忘记对实验台面进行消毒，或未对培养瓶或试管的瓶口进行灼烧灭菌。也可能不慎触碰移液管的尖端，或将瓶盖或试管帽放置在实验台上而非握在手中。正确的操作规程对于最大限度减少培养基和培养物的污染至关重要。 图 8A 提供了一个纯培养与污染培养的示例 E. coli 在含有5 ml LB的试管中。左侧面板显示培养物呈现均匀的细微浑浊，这是纯培养的典型特征 E. coli 培养。相比之下，右侧面板显示的是受污染的培养物，其生长特征偏离了该细菌菌株预期的生长特性。

操作血清移液管时可能出现技术性错误，导致在试管之间转移的培养基体积不准确。例如，您可能错误地读取了移液管上的体积（如将弯月面顶部与底部混淆），或完全排空了设计为尖端需保留少量液体不排出的“排出式”（TD）移液管中的培养基。在进行点对点转移培养基时，可能使用了错误的刻度标记，从而分配了不正确的体积。图8B展示了含有正确与错误培养基体积的试管示例。左侧试管中含有3.5 ml LB培养基，使用5 ml血清移液管量取：该学生采用点对点转移方式，将LB培养基吸取至5.0 ml刻度线，再排出至1.5 ml刻度线。右侧试管中含有2.5 ml LB培养基，同样使用相同规格的移液管量取，但由于该学生在点对点转移过程中操作错误，将液体从5.0 ml刻度线排出至2.5 ml刻度线。此错误将导致细菌培养物浓度高于预期，从而使后续的稀释步骤不准确。此类误差的累积可能导致实验失败，必须使用正确的细胞浓度重新进行实验。

使用微量移液器转移液体的示例应用如图所示 图9这些移液器用于分子生物学和微生物学中的多种实验，包括为PCR和凝胶电泳制备样品，或用小体积（小于1.0 ml）的细菌细胞或噬菌体颗粒接种无菌培养基或缓冲液。在所提供的示例中，学生转移了12.5 μ将TE缓冲液加入1.8 ml微量离心管中（图A左管；注意缓冲液中已加入染料以便于在透明微量离心管中观察液体）。该操作要求学生首先选择正确的微量移液器，本例中为P20，然后将体积调节至正确数值（图B）。所用吸头末端带有棉絮塞，以防止移液器枪管内可能存在的污染物随操作进入吸头中的缓冲液样品。若在吸取液体时操作谨慎，缓慢按压活塞以避免液体溅入移液器枪管，则此预防措施并非必需。操作中可能出现技术性错误，导致转移体积不准确。例如，可能选用了不合适的微量移液器，或在正确的移液器上设置了错误的体积。在将吸头浸入缓冲液前，若将活塞按压超过第一停点，松开时会导致过量缓冲液被吸入吸头。或者，吸头浸入缓冲液深度不足，可能导致空气被吸入而非缓冲液。在向微量离心管中 dispensing 缓冲液时，若未将活塞按至第二停点，将导致释放体积少于预期。图A右管中的 图9 显示一个微量离心管，其中缓冲液体积与左侧试管相比不正确。未加入12.5 μ缓冲液，该学生分装了125 μL μl. 在此情况下，尽管容积计上的数值设置相同，但选择了错误的微量移液器（该学生使用了P200而非P20；图B），导致缓冲液体积显著过量。如果该溶液用于配制PCR等实验所需的试剂混合液，则此错误将改变后续加入同一管中的所有试剂的最终浓度。因此，实验很可能失败，因为PCR等分子生物学实验要求各组分均处于特定浓度，反应才能正常进行。

由于确保微量移液器（尤其是枪管内部）无菌并不总是可行，储存液可能会被污染，导致实验过程中即使进行故障排查也无法成功。如果使用微量移液器转移无菌溶液，强烈建议采用无菌技术，用血清移液管对储存液（培养基、缓冲液、水）进行分装。通常将工作用储存液保存在15 ml或50 ml的无菌锥形管中。这些容器在操作微量移液器时更易于操控，且在体积转移过程中若发生污染，可随时更换为新的储存液分装样品。

图1. 本生灯火焰上升气流形成的无菌区域。为最大限度减少无菌溶液和培养物的污染，所有操作必须在无菌区域内进行。玻璃培养管和烧瓶的瓶口应通过蓝色锥形火焰的顶端，即火焰最热的部位。塑料试管和枪头不可灼烧，使用前应通过其他方法预先灭菌。

图2. 用于液体无菌转移的血清学移液管。（A）从左到右依次为25 ml、10 ml和5 ml移液管的示意图。（B）血清学移液管可以是塑料或玻璃材质。塑料移液管为一次性使用，通常单独包裹在纸和塑料套管中，其所有内表面均为无菌状态（左侧）。玻璃移液管可在使用后经清洗和灭菌重复使用，通常保存在金属罐中（右侧）。

图3. 血清移液管有两种类型：TC（“容纳式”）和 TD（“排出式”）。图中显示的是一个5 ml TD移液管的说明标签。

图4. 无菌操作技术。使用移液器从带盖的瓶子、烧瓶或试管中吸取液体时，切勿将瓶盖放置在实验台面上。应将瓶盖握在持移液器辅助装置的同一手中，同时用另一只手操作盛有液体的容器，如图所示。

图5. 将液体吸入刻度吸管时形成的弯月面。体积对应于弯月面底部与吸管刻度线对齐的位置。在此示例中，弯月面底部与2.5 ml的刻度线对齐。

图6. 单通道微量移液器。（A）图示为一支带有塑料吸头的微量移液器，吸头安装在枪头套筒底部。图中标注了体积计、用于调节体积计读数的拇指滚轮、枪头套筒、吸头弹出按钮以及推动推杆的按钮位置。（B）微量移液器上的双档位推杆系统。

图7. 使用移液管将培养基转移至无菌的125 ml三角瓶中。左侧三角瓶中仅含有25 ml培养基（LB），而右侧三角瓶则是将细胞接种至LB培养基并在37 °C过夜培养后得到的E. coli菌液。注意观察右侧三角瓶中培养基因细胞生长而变得浑浊。

图8. 使用血清移液管将培养基转移至无菌试管中。（A）左侧试管含有5 ml纯大肠杆菌（E. coli）培养物，右侧试管含有5 ml被污染的细菌细胞培养物。注意两种培养物在生长特性上的差异。尽管两者均呈浑浊状，但右侧培养物已被真菌或其他空气传播的微生物污染，导致其颜色和性状与大肠杆菌（E. coli）细胞预期的特征不同。（B）左侧培养管中含有3.5 ml LB培养基，而右侧试管仅含2.5 ml LB培养基。该体积差异是由于在向试管进行定点定量转移培养基时操作失误所致。

图9. 使用微量移液器将缓冲液转移至无菌微量离心管中。（A）左侧微量离心管中仅含有12.5 μl TE缓冲液，而右侧管中含有125 μl。注意：已在缓冲液中加入染料，以便于在透明的微量离心管中观察液体。（B）左侧体积显示装置来自P20微量移液器，右侧体积显示装置来自P200微量移液器。常见的错误是选用了错误的微量移液器。尽管P20和P200的体积显示装置上设定的数字相同，但选用错误的微量移液器会导致转移的液体体积不准确。

图10. 用于防止溶液和培养物污染的层流罩。图中所示为适用于生物安全二级（BSL-2）生物体操作的生物安全柜。

讨论

无菌技术是指为防止实验室中无菌溶液和培养物被不需要的微生物污染而采取的一系列常规操作步骤。这类技术对于需要进行细胞培养的实验至关重要。尽管无法实现实验环境的完全无菌，但通过消毒实验台面、使用本生灯创建无菌区域、尽量减少未加盖的培养物和培养基暴露于空气中的时间、对瓶子、试管和玻璃移液管等材料进行灭菌，以及避免无菌器械与非无菌表面接触等操作，可显著降低实验中溶液和培养物被污染的可能性。这些预防性操作的目标是使其成为操作者的习惯性行为，而这需要在实验室工作中通过训练和实践逐步养成。

使用血清学移液管和微量移液器等仪器，对无菌溶液和培养物进行体积转移，是实验室中常见的常规技术之一。不同的实验应用需要使用能够精确、准确地转移特定体积的仪器。血清学移液管常用于微生物学实验室中，以制备需要毫升体积培养基的细胞培养物；而微量移液器则在分子生物学实验中至关重要，因其仅需微升级别的溶液。当使用这些仪器操作时遵循无菌技术，便可最大限度地减少液体转移过程中的污染，无论液体体积大小或实验类型如何。

尽管本方案中未作讨论，但另一种常用的防止污染的方法是在层流罩内进行操作（图10）。该设备对于组织培养以及生物安全等级为BLS-2或更高级别的微生物实验至关重要。层流罩配备有高效微粒空气（HEPA）过滤器，可去除进入罩内的气流中的空气传播污染物，同时防止实验室内的未过滤空气进入工作区域。需要注意的是，不得在层流罩内使用本生灯，因为火焰产生的热量会破坏维持罩体正常功能所必需的气流。

在进行实验时，检查无菌操作技术的质量通常很有帮助。为了确认溶液和培养基在实验操作过程中未被污染，务必准备一个阴性对照。例如，在准备用于细菌培养的液体培养基试管时，留出其中一管不接种，仅含有无菌培养基。将该未接种的培养基与已接种的试管一同培养，随后检查该对照管是否有污染迹象，例如因非目标细胞意外进入试管并生长而导致的浑浊现象。如果对照管出现污染，则实验组试管很可能也已被污染，实验需要重新进行。每次实验都应采取此类预防措施。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 培养基	Difco Laboratories	244620	配方亦见参考文献6
TE 缓冲液：
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	消毒剂
乙醇	Fisher Scientific	A406	用作消毒剂时，用蒸馏水配制成70%(v/v)