无菌实验技术：使用血清移液管和微量移液器进行体积转移

摘要

在实验室工作时，必须尽量减少污染源。无菌技术是指在转移培养物和试剂时，避免其接触非无菌表面的操作方法。血清移液管和微量移液器可用于精确量取液体体积，同时确保实验中所用溶液的无菌性不受影响。

摘要

微生物无处不在——存在于空气、土壤、人体以及实验室台面和计算机键盘等无生命物体表面。微生物的普遍存在为实验室带来了大量潜在的污染物。为了确保实验成功，必须尽量减少设备和工作表面上的污染物数量。微生物学的许多实验中普遍涉及对含有细菌细胞或病毒颗粒的培养物进行测量和转移的操作。为避免接触非无菌表面或污染无菌培养基，需要做到以下几点：（1）准备一个无菌的工作空间；（2）精确设定并准确读取仪器，以实现液体的无菌转移；（3）在无菌区域内正确操作仪器、培养瓶、瓶子和试管。掌握这些操作需要培训和练习。起初，动作应缓慢、有意识且受控，目标是使无菌操作在实验台工作中变得自然熟练。本文将介绍在本生灯火焰所形成的无菌区域内，使用血清移液管和微量移液器测量液体体积的步骤。根据所用仪器的不同，体积范围从微升（μl）到毫升（ml）不等。常见的转移液体包括无菌肉汤或化学溶液，以及细菌培养物和噬菌体储备液。通过遵循这些操作步骤，学生应能够：•在本生灯火焰所形成的无菌区域内进行操作；•使用血清移液管时不破坏仪器的无菌状态；•使用血清移液管吸取液体时，通过将液体形成的弯月面与移液管上的刻度线对齐，精确读取标定体积；•在液体转移过程中保持培养瓶、培养瓶、试管及其相应瓶盖的无菌状态；•识别塑料与玻璃血清移液管的不同应用场景；•说明微量移液器的准确度限制；•精确且准确地设定微量移液器的体积；•掌握如何正确使用微量移液器的第一档和第二档来吸取和转移准确体积的液体。

方案

1. 准备无菌工作区

1. 在开始工作区域内的任何灭菌操作前，须用抗菌皂和温水彻底清洗双手。
   • 每次怀疑实验操作中可能造成污染时，务必重新洗手。
2. 清理实验台上所有杂乱的物品。从容器中取出一张预先浸湿的消毒湿巾，彻底擦拭整个台面。让消毒液自然蒸发，切勿擦干！
   • 使用酒精（异丙醇或70%乙醇）或酚类化合物（邻苯基苯酚）等消毒剂。
   • 为防止 气溶胶化，或产生含有细菌细胞的细微气雾并导致微生物污染物扩散，应避免从挤压瓶中倾倒消毒剂。
   • 微生物的干燥处理是使表面去污染最有效的方法之一。
   • 即使有人最近使用过实验台，并且台面已经用消毒剂擦拭过，开始实验前也务必先再次擦拭实验台。
3. 消毒剂完全干燥后，使用点火器点燃本生灯。调节火焰，使火焰中央可见蓝色锥形。此时火焰正在产生一个 上升气流，或热空气从火焰上升起并远离所形成的空气对流图1）。随着热空气上升，微生物和灰尘颗粒被向上推离本生灯形成的即时工作区域。在此工作区域内——即所谓的 无菌区域在整个实验过程中保持本生灯开启。
   • 蓝色锥形部分的尖端是火焰最热的区域。
   • 注意避免快速移动，以免剧烈改变实验台周围气流而干扰上升气流。使用本生灯产生上升气流可最大限度减少微生物和灰尘落入工作区的开放瓶、试管或烧瓶中。
4. 将该操作所需的所有用品放置在靠近无菌区域的实验台面上，确保所有材料均已正确标记。
   • 耗材可能包括血清移液管和微量移液器、无菌培养管、无菌烧瓶、含有肉汤的培养基瓶、无菌微量离心管、微量移液器吸头、试管架、细菌培养物以及噬菌体储备液。
   • 液体培养基应在高压灭菌器中于 121 °C 至少在液体档位运行15分钟。较大体积的培养基（> 1 L）需要更长的高压灭菌时间。实验器具应在高压灭菌器中于 121 °C 至少30分钟，重力干燥模式。
   • 通常，无菌溶液可保存于 4 °C 最长可保存5个月。请注意，含有不稳定成分（如抗生素）的溶液保存时间会显著缩短——请务必查阅生产商的建议说明。

2. 使用血清学移液管转移液体

1. 移液管有多种规格和类型：塑料或玻璃材质，一次性或可重复使用，带或不带棉塞。其标定可输送的体积范围从 0.1 ml 到 25 ml。
   • 常见的移液管规格为 5 ml、10 ml 和 25 ml，适用于 0.1 ml 及以上体积的无菌液体转移（图 2 面板 A）。也有更大的移液管，可输送高达 100 ml 的体积；但本方案主要关注更常见、较小尺寸的移液管。
   • 微生物学和组织培养实验需使用带棉塞的预灭菌移液管。棉塞不应从移液管顶部移除，其设计目的是防止液体过度吸入移液管内。
   • 不同应用需选择塑料或玻璃移液管。有机溶剂必须使用玻璃移液管。在实验台面上进行 BSL-1 实验时，两种材质均可使用。在生物安全柜中操作 BSL-2 生物材料且无法使用本生灯时，只能使用塑料移液管。此外，转移熔融琼脂时也建议使用塑料移液管。
   • 移液管分为两种类型：TC（“容纳式”）和 TD（“输送式”）。TC 移液管可将全部液体（包括尖端残留）完全排出，必须通过“吹出”或冲洗以获得标定体积。TD 移液管已校准，尖端残留少量液体，应不得排出。务必检查移液管上端管身上的标签以确认其类型（图 3）。最常用的是 TD 移液管，其顶部标有双环标记。
2. 取一支无菌塑料移液管（也称为体积转移移液管），小心地从带棉塞的一端撕开纸套，像剥香蕉皮一样轻轻剥离——不要完全取下纸套，以保护将接触待转移液体的移液管尖端。仅用手接触移液管上部（刻度线以上部分）。
   • 切勿使用已用过的移液管插入无菌溶液中，即使已尽最大努力保持其无菌状态。
   • 玻璃移液管通常存放在金属筒形容器中（图 2 面板 B）。松开容器盖子，小心取下盖帽，并用火焰灼烧盖子和容器的开口端。将盖子侧放于已消毒的实验台面上。水平握住容器，轻轻摇动使一两支移液管顶部露出约 2.5 cm，便于抓取。将容器侧放后取出一支移液管，注意不要触碰容器内的其他移液管。切勿用手接触移液管底部尖端，避免尖端接触其他非无菌表面。
3. 在移液管上端安装移液器辅助装置，如吸球、泵或移液枪。取下塑料移液管的纸套。用右手握住移液器辅助装置。
   • 若使用玻璃移液管，将移液管底部三分之一部分穿过本生灯火焰的蓝色锥形区域 1–3 秒，并在通过火焰时旋转 180°。塑料移液管和试管不可灼烧。
   • 若为左利手，可用左手握住移液器辅助装置，并用右手操作培养瓶和试管。
   • 使用塑料移液管时，当从纸套中抽出最后几厘米时容易发生污染，因为无菌的尖端会接触到被手触碰过的纸套部分。
4. 取下装有无菌培养基的瓶子的瓶盖。不要将瓶盖放在实验台上，而应将其夹在右手无名指与手掌之间，同时用同一只手的拇指、食指和中指操作移液器辅助装置（图 4）。将瓶子倾斜约 45° 角，使瓶口通过本生灯火焰，从而在敞口瓶周围形成无菌区域。
   • 尽管应尽量避免，若必须放置瓶盖，应将其内面朝下置于已消毒的表面上。若瓶盖朝上放置，由于物体或手的移动可能产生气流，导致微生物和灰尘颗粒沉降到瓶盖内表面，增加污染风险。
   • 灼烧的目的并非灭菌，而是加热瓶口并产生向上的空气对流（即上升气流）。温暖上升的空气有助于防止灰尘颗粒和其他污染物进入瓶内。
   • 应尽可能缩短无菌容器的敞口时间。在整个操作过程中，必须尽量减少空气微生物进入的途径。
   • 当无菌容器处于敞口状态时，应避免咳嗽、打喷嚏、说话及其他无意的动作。
   • 一旦瓶口、试管口、瓶盖内侧等无菌区域已通过本生灯火焰处理，切勿将手或手指从其上方越过。
   • 打开无菌试管或瓶子时，应始终使用明火。实验台上一次只能打开一个试管、瓶子或烧瓶。在打开和关闭试管、瓶子或烧瓶时，应立即进行灼烧处理。
5. 将移液管尖端插入装有无菌培养基的瓶中，然后吸取液体，以无菌方式从瓶中吸取样品。使用移液器辅助装置控制液体流入移液管的流速。通过将液柱弯月面与移液管上的刻度线对齐，准确读取吸入的液体体积（图 5）。
   • 严禁口吸移液！ 必须始终使用移液器辅助装置（泵、吸球或移液枪）。
   • 读取体积时应注意刻度数字的顺序。数字可能从尖端向顶部排列，或相反，有时两个方向均有标注。
   • 读取体积时，应始终垂直持握移液管（与地面垂直），并在与视线齐平的高度正视液体弯月面。
   • 移液管的精度仅限于最小刻度单位，通常 5 ml 和 10 ml 移液管为 0.1 ml，25 ml 移液管为 0.2 ml。若需要更高精度，可将移液管与微量移液器配合使用。
6. 再次将瓶口通过本生灯火焰灼烧，然后盖上瓶盖。将培养基瓶放置一旁。
   • 关闭瓶盖时切勿因匆忙而被本生灯烫伤。
7. 用左手握住一支试管或烧瓶。按上述第 4 步所述方法取下并持握瓶盖。通过本生灯火焰灼烧试管或烧瓶口，建立无菌区域。
8. 将移液管中的培养基排入试管或烧瓶中。控制液体流速，避免液体溅出试管或烧瓶。
   • 可测量体积，使全部液体完全排出并排空移液管；也可通过点对点转移（从一个刻度到另一个刻度）实现特定体积的转移。
9. 再次将试管或烧瓶口通过本生灯火焰灼烧，然后盖上瓶盖。将试管或烧瓶放置一旁。取下移液器辅助装置，并将移液管丢弃至指定的废弃物容器中。
   • 塑料移液管为一次性使用，而玻璃移液管可灭菌后重复使用。正确处理方式为：塑料移液管应放入指定的锐器容器（内衬塑料垃圾袋的硬质盒子）；玻璃移液管应先浸入含 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以消毒内外表面，随后用实验室洗涤剂彻底清洗，用蒸馏水冲洗，并在高压灭菌器中灭菌。
10. 在将细菌培养物或噬菌体原液接种至培养基，或进行连续稀释时，也应遵循上述相同步骤。

3. 使用微量移液器转移液体

1. 精确测量和分配微量液体体积可使用微量移液器（也称为 Pipetman；图 A） 图6）。这些仪器有不同的规格，每种规格对应特定的体积范围：P2 用于 0.2–2 μl ，P10 用于 1-10 μl，P20 用于 2-20 μl，P200 用于 20-200 μl，以及用于200-的P10001000 μl.
   • 小心使用微量移液器，因其为精密仪器。切勿将其无人看管地放置在实验台上，以免被碰落而损坏。避免移液器接触腐蚀性化学品。
   • 对于体积大于 1000 μl，使用血清移液管。
   • 尽管在本生灯所创建的无菌区域内操作，但不要对移液器、试管和塑料吸头进行灼烧。试管和吸头应预先灭菌。移液器可在使用前用预先浸润的消毒湿巾擦拭。
2. 通过旋转调节旋钮可设置显示已分配体积的数字容积计。调节体积 之前 进入步骤 #3。
   • 切勿将调节旋钮旋转至预定范围以上！
   • 为获得最高精度，在减小微量移液器体积设定值时，应缓慢转动拇指轮，确保不要超过刻度标记。
   • 为获得最大准确性，在增加微量移液器体积设定时，先向上旋转拇指转轮，超过目标刻度线约1/3圈，然后缓慢向下旋转拇指转轮至所需体积，注意不要超过目标刻度线。
   
   容积计显示三个数字。根据移液器的不同，这些数字的读取方式也不同。请注意，每支移液器的准确度仅能达到最小刻度值。
   P2: 0.2–0.2-2.0 μl上方数字表示微升体积，第二个数字表示十分之一微升0.1 μl），第三个数字代表微升的百分之一（0.01 μl）。每个刻度标记代表两千分之二的增量（0.002 μl微升的量。
   P10: 对于体积在1.0-10.0 μl上方数字代表十微升；通常应设为“0”，仅在分配液体且其余两个数字均设为“0”时才设为“1” 10.0 μl中间的数字表示以微升为单位的体积。第三个数字表示十分之一微升。0.1 μl）。每个刻度代表百分之二的增量（0.02 μl微升（μL）
   P20: 对于体积在 2.0-20.0 μl黑色上方的数字表示十微升；分配液体时，该数字应设为“2”，其余两个数字设为“0” 20.0 μl黑色的第二个数字表示微升体积。红色的第三个数字表示十分之一微升。0.1 μl）。每个刻度代表百分之二的增量（0.02 μl微升（μL）的量。
   P200: 对于体积在20.0-200 μl上方数字表示数百微升；分配时，该数字应仅设置为“2”，其余两个数字均设置为“0” 200 μl中间的数字表示以十微升为单位的分配体积，第三个数字表示以微升为单位的体积。每条刻度线代表增加两个十分之一（0.2 μl微升（μL）的量。
   P1000: 对于200-之间的体积1000 μl上方数字代表数千微升；通常应设为“0”，仅在分配液体且其余两个数字均设为“0”时才设为“1” 1000 μl中间的数字代表数百微升，底部的数字代表数十微升。每条刻度线代表增加2微升。2 μl微升。
   
   • 性能检查： 这些仪器应每年校准一次，以确保准确性和精密度维持在规格的±5%范围内。使用分析天平称量水时，需确保其最小和最大量程与预期体积相对应。例如，使用P1000移液器进行转移 200 μl 将水加入天平上的称量皿中。由于水的密度为1，因此1毫升（ml）水相当于1克（g）。因此， 200 μl 0.2 ml 的水应等于 0.2 g。同时，确保移液器吸头无泄漏，并能通过活塞系统将目标体积维持至完全排出。
3. 微量移液器必须始终与一次性塑料吸头配合使用。将吸头紧密套在微量移液器筒管末端，向下按压并轻微旋转，以确保形成气密性密封。
   • 吸头通常装在可经高压灭菌的塑料盒中。打开吸头盒取用吸头后，应立即关闭吸头盒，以尽量减少与空气中污染物的接触。
   • 一些吸头带有类似于血清移液管上棉塞的过滤器。这类吸头通常比普通吸头更昂贵，因此仅用于特定用途。例如，在测量氯仿等挥发性化学品或放射性液体时使用 ³²使用滤芯吸头有助于防止放射性磷标记的DNA污染微量移液器的枪管。
4. 将微量移液器保持在垂直位置。
   • 保持移液器竖直向上，可防止液体流入内部，污染移液器的枪管。
5. 移液器有三个位置：（1）静止位，（2）第一档，（3）第二档图6，图B）。该仪器具有双档位活塞系统。第一档位具有两个功能：第一个功能是在将活塞从第一档位释放至静止位置时，吸取所需体积的液体进入吸头；第二个功能是在将活塞从静止位置按压至第一档位时，将大部分液体从吸头中排出。进一步将活塞按压至第二档位可排出吸头中残留的全部液体。
   将活塞推杆上的按钮从静止位置按压至第一停点。排出的空气体积等于设定体积。
6. 将吸头浸入液体中，同时按压按钮至第一停点。
   • 切勿将移液器本体接触瓶、管或烧瓶的内壁，否则这些容器的内表面会被污染。只有移液器吸头是无菌的。
7. 缓慢松开按钮，使液体吸入吸头。当按钮恢复至初始位置时停止。稍等片刻，使液体完全吸入吸头。
   • 移液器吸头中的液体体积将等于移液器设定的体积。
   • 含有甘油等黏性液体需要更长时间才能进入吸头。
8. 从液体中取出吸头，目视检查吸头，确认吸入的液体已达到吸头内预期的液面高度，且吸头内无气泡。
   • 如有必要，排出液体，并手动将吸头紧固在微量移液器上。吸取液体后再次检查。
9. 将吸头倾斜放置10 ° 至 45 °将吸头紧贴接收液体的管壁。缓慢下压移液器推杆按钮至第一停点以排出液体，稍等片刻，再将按钮按至第二停点，以排出吸头尖端残留的液体。
   • 过快按压推杆可能导致液体喷溅或在试管中产生不期望的气泡。
10. 在将移液器活塞释放至静止位置之前，先将吸头从液体中取出。
11. 将移液器上的吸头弹射按钮按下，把吸头弃置入指定的锐器废弃物容器中。

4. 清理工作区

1. 完成需要无菌技术的实验后，关闭本生灯，然后将所有用品和试剂收好。使用预先浸湿的消毒擦拭巾清洁实验器具（瓶子、移液器、移液器吸头盒）的外表面，以确保不会将污染物带入储存区域。
2. 将受污染的玻璃器皿和危险废物放入指定的废弃物容器中。实验室废弃物包括手套、移液器、吸头和离心管等实验耗材。使用非致病性生物体（生物安全等级1级，BSL-1）进行实验时产生非感染性危险废物，而使用致病性生物体（生物安全等级2级或以上，BSL-2及以上）时则产生感染性危险废物。感染性废物在丢弃前必须经过高压灭菌或消毒处理。请遵循《微生物和生物医学实验室生物安全手册》（BMBL，第5版）中描述的实验室安全指南。^th Ed.) 以及美国职业安全与健康管理局（OSHA）和各机构环境健康与安全部门提供的指南。
3. 用容器中的预浸消毒湿巾擦拭实验台的整个工作区域，再次让消毒剂自然蒸发。
4. 使用抗菌皂和温水彻底洗手，然后离开实验室。

5. 代表性结果

使用血清移液管转移液体的示例应用如图所示 图7这些移液管常用于微生物学实验室，以制备用于接种细菌培养物的培养基。例如，先将无菌烧瓶加入特定体积的培养液（本例中为Luria肉汤（LB）），然后加入少量细胞（如 E. coli加入培养基中。使用血清移液管，首先必须将肉汤从培养基瓶无菌转移至锥形瓶中。本实验中，使用25 ml血清移液管将25 ml LB加入125 ml无菌锥形瓶中。接下来，需将肉汤接种 E. coli 细胞。此处， 10 μl 将之前培养的细胞从培养瓶中使用P20移液器无菌转移至含有25 ml新鲜LB培养基的培养瓶中。将该培养瓶置于培养箱中孵育一定时间，使细胞得以增殖（本示例中为 E. coli 细胞在过夜孵育于 37 °C 在摇床平台上振荡）。结果得到一管浑浊的细菌培养液，可用于后续实验。

血清移液管也可用于将最初装在瓶中的培养基转移至试管，或在试管之间相互转移，例如在对细菌培养物进行稀释时即采用此种操作。若在整个培养基操作过程中未能保持无菌技术，则培养物将被污染，后续使用这些培养物的实验将被迫延迟，因为必须重新制备新鲜且未被污染的培养物。错误的发生通常是由于操作过程中未能维持无菌环境所致。例如，您可能忘记对实验台面进行消毒，或未对培养瓶或试管的瓶口进行灼烧灭菌；可能触碰了移液管的尖端，或将瓶盖或试管盖放置在实验台面上而非握在手中。正确的操作规程对于最大限度地减少培养基和培养物的污染至关重要。 图8A 提供了一个纯培养与污染培养的示例 E. coli 在含有5 ml LB的离心管中。左侧面板显示培养物呈现均匀的细微浑浊，这是纯培养物的典型特征 E. coli 培养。相比之下，右图显示的是受污染的培养物，其生长特征偏离了该细菌菌株应有的预期特征。

在操作血清移液管时可能会出现技术性错误，导致在试管之间转移的培养基体积不准确。例如，您可能错误地读取了移液管上的体积（即读取了弯月面顶部而非底部），或者将TD移液管中的液体完全排出，而TD移液管的设计本应使极少量液体残留在管尖，不应排出。在进行点对点转移培养基时，可能使用了错误的刻度标记，从而分配了不正确的体积。图8B展示了含有正确与错误培养基体积的试管示例。左侧试管中含有3.5 ml LB培养基，使用5 ml血清移液管量取。该学生进行了点对点转移操作，将LB培养基吸取至5.0 ml刻度线，然后排出至1.5 ml刻度线。右侧试管中含有2.5 ml LB培养基，同样使用相同规格的移液管量取，但由于该学生在点对点转移操作中错误地从5.0 ml刻度线排至2.5 ml刻度线，导致体积偏少。这一错误将导致细菌培养物浓度高于预期，从而使后续的稀释步骤出现偏差。此类误差的累积可能导致实验失败，必须使用正确的细胞浓度重新进行实验。

使用微量移液器转移液体的一个示例应用如图9所示。这些移液器广泛用于分子生物学和微生物学的多种实验中，包括为PCR和凝胶电泳准备样品，或用小体积（小于1.0 ml）的细菌细胞或噬菌体颗粒接种无菌培养基或缓冲液。在本示例中，学生将12.5 μl TE缓冲液转移至一个1.8 ml的微量离心管中（A图左管；注意缓冲液中已加入染料，以便于在透明的微量离心管中观察液体）。该操作要求学生首先选择正确的微量移液器，本例中为P20，然后将体积调节至正确数值（B图）。所使用的吸头末端带有棉絮塞，以防止可能从移液器枪管中喷出的污染物进入吸头中的缓冲液样品。如果在将液体吸入吸头时操作谨慎，缓慢按压活塞以避免液体飞溅进入移液器枪管，则此预防措施并非必需。操作中可能出现技术性错误，导致转移体积不准确。例如，可能选择了错误的微量移液器，或在正确的移液器上设置了错误的体积（B图）。在将吸头浸入缓冲液之前，若将活塞按压超过第一停点，释放活塞时会吸入过量的缓冲液。或者，若吸头未充分浸入缓冲液中，空气将被吸入吸头而非缓冲液。在向微量离心管中分配缓冲液时，若忘记将活塞按至第二停点，则从吸头释放的液体体积将少于预期。图9中A图的右管显示了一个含有错误体积缓冲液的微量离心管，与左管相对比。学生本应分配12.5 μl缓冲液，实际却分配了125 μl。在此情况下，尽管体积调节显示的数字相同，但选择了错误的移液器（学生使用了P200而非P20；B图），导致分配的缓冲液体积显著增大。如果该溶液用于配制PCR等应用的试剂混合物，则此错误将改变后续加入该管中所有试剂的最终浓度。因此，实验很可能无法成功，因为PCR等分子生物学操作要求所有组分均处于特定浓度，反应才能正常进行。

由于确保微量移液器（尤其是枪筒内部）无菌并不总是可行，储存液可能会被污染，导致实验过程中即使进行故障排查也无法成功。如果使用微量移液器转移无菌溶液，强烈建议采用无菌技术，用血清移液管对储存液（培养基、缓冲液、水）进行分装。通常将工作用储存液保存在15 ml或50 ml的无菌锥形管中。这些容器在操作微量移液器时更易于操控，且若在体积转移过程中发生污染，可随时更换为新的储存液分装样品。

图 1. 本生灯火焰上升气流形成的无菌区域。为最大限度减少对无菌溶液和培养物的污染，所有操作必须在无菌区域内进行。玻璃培养管和烧瓶的瓶口应通过蓝色锥形火焰顶端，即火焰最热的部位进行灼烧。塑料管和枪头不可灼烧——使用前应通过其他方法预先灭菌。

图2. 用于液体无菌转移的血清移液管。（A）从左到右依次为25 ml、10 ml和5 ml移液管的示意图。（B）血清移液管可以是塑料或玻璃材质。塑料移液管为一次性使用，通常 individually wrapped in paper and plastic sleeves，内部所有表面均为无菌状态（左侧）。玻璃移液管可在使用后经清洗和灭菌重复使用；这类移液管通常存放在金属罐中（右侧）。

图3. 血清学移液管分为两种类型：TC（“容纳”）和 TD（“排出”）。图中所示为一支 TD 5 mL 移液管上的说明标签。

图4. 无菌操作技术。从带盖的瓶子、烧瓶或试管中吸取液体时，切勿将瓶盖放在实验台面上。应将瓶盖始终握在持移液辅助器的同一只手中，同时用另一只手操作盛有液体的容器，如图所示。

图5. 将液体吸入血清移液管时形成的弯月面。体积对应于移液管上与弯月面底部对齐的刻度线。在此示例中，弯月面与2.5 ml刻度线对齐。

图6. 单通道微量移液器。（A）图示为一支带有塑料吸头的微量移液器样本，吸头连接在枪筒式吸头架的底部。图中标明了体积调节器、用于调节体积设定的拇指旋钮、枪筒式吸头架、吸头弹出按钮以及用于推动活塞的按钮的位置。（B）微量移液器上的双档位活塞系统。

图 7. 使用刻度移液管将培养基转移至无菌的 125 ml 锥形瓶中。左侧锥形瓶中仅含有 25 ml 培养基（LB），而右侧锥形瓶是将细胞接种于LB培养基并在37 °C下过夜培养后得到的 E. coli 培养物。注意观察右侧锥形瓶中的培养基由于细胞生长而变得浑浊。

图8. 使用血清学移液管将培养基转移至无菌试管中。（A）左侧试管含有5 ml纯E. coli菌液，右侧试管含有5 ml被污染的细菌细胞培养物。注意两种培养物在生长特性上的差异。尽管两者均呈浑浊状，但右侧培养物已被真菌或其他空气来源的微生物污染，导致其颜色和质地与E. coli细胞预期的特征不同。（B）左侧培养管中含有3.5 ml LB培养基，而右侧试管仅含2.5 ml LB培养基。该体积差异是由于在向试管进行点对点加样时操作失误所致。

图9. 使用微量移液器将缓冲液转移至无菌微量离心管中。（A）左侧微量离心管中仅含有12.5 μl TE缓冲液，右侧管中含有125 μl。注意：已在缓冲液中加入染料，以便于在透明微量离心管中观察液体。（B）左侧体积刻度来自P20微量移液器，右侧体积刻度来自P200微量移液器。常见错误之一是选用了错误的微量移液器。尽管P20和P200的体积设定数值相同，但若选用错误的移液器，将导致转移体积不准确。

图10. 用于防止溶液和培养物污染的层流罩。图中所示为适用于BSL-2级生物体操作的生物安全柜。

讨论

无菌技术是指为防止实验室中无菌溶液和培养物被不需要的微生物污染而采取的一系列常规操作步骤。这类技术对于需要进行细胞培养的实验至关重要。尽管无法实现实验环境的完全无菌，但通过消毒实验台面、使用本生灯创建无菌区域、尽量减少未加盖的培养物和培养基暴露于空气中的时间、对瓶子、试管和玻璃移液管等材料进行灭菌，以及避免无菌器械与非无菌表面接触等操作，可显著降低实验中溶液和培养物被污染的可能性。这些预防性操作的目标是使其成为操作者的习惯性行为，而这需要在实验室工作中通过训练和实践逐步养成。

使用血清学移液管和微量移液器等仪器，对无菌溶液和培养物进行体积转移，是实验室中常见的常规技术之一。不同的实验应用需要使用能够精确、准确地转移特定体积的仪器。血清学移液管常用于微生物学实验室中，以制备需要毫升体积培养基的细胞培养物；而微量移液器则在分子生物学实验中至关重要，因其仅需微升级别的溶液。当使用这些仪器操作时遵循无菌技术，便可最大限度地减少液体转移过程中的污染，无论液体体积大小或实验类型如何。

尽管本方案中未作讨论，但另一种常用的防止污染的方法是在层流罩内进行操作（图10）。该设备对于组织培养以及生物安全等级为BLS-2或更高级别的微生物实验至关重要。层流罩配备有高效微粒空气（HEPA）过滤器，可去除进入罩内的气流中的空气传播污染物，同时防止实验室内的未过滤空气进入工作区域。需要注意的是，不得在层流罩内使用本生灯，因为火焰产生的热量会破坏维持罩体正常功能所必需的气流。

在进行实验时，检查无菌操作技术的质量通常很有帮助。为了确认溶液和培养基在实验操作过程中未被污染，务必准备一个阴性对照。例如，在准备用于细菌培养的液体培养基试管时，留出其中一管不接种，仅含有无菌培养基。将该未接种的培养基与已接种的试管一同培养，随后检查该对照管是否有污染迹象，例如因非目标细胞意外进入试管并生长而导致的浑浊现象。如果对照管出现污染，则实验组试管很可能也已被污染，实验需要重新进行。每次实验都应采取此类预防措施。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 培养基	Difco Laboratories	244620	配方亦见参考文献6
TE 缓冲液：
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	消毒剂
乙醇	Fisher Scientific	A406	用作消毒剂时，用蒸馏水配制成70%(v/v)