一种微创方案，用于稳定小鼠脊柱并进行重复性操作 体内 使用双光子显微镜进行脊髓成像的方法被描述。该方法结合了脊髓稳定装置和麻醉方案，以最小化呼吸引起的运动，从而获得无需对齐或其他后处理的原始成像数据。
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本文内容
摘要
摘要
利用双光子显微镜对经基因工程改造、可在特定细胞类型中表达荧光蛋白的小鼠进行体内成像1，已显著拓展了我们对多种组织在体内生理与病理过程的认识2-34-7。在中枢神经系统（CNS）的研究中，体内成像技术已广泛应用于大脑研究，获得了大量关于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等细胞在生理或病理条件下行为的新发现，其中许多结果出乎意料8-17。然而，由于主要存在技术上的困难，体内成像在活体小鼠脊髓研究中的应用仍受到限制。特别是脊髓与肺和心脏在解剖位置上邻近，会产生显著的运动伪影，使活体脊髓成像成为一项具有挑战性的任务。
我们开发了一种新方法，通过稳定脊柱并减少呼吸引起的运动，克服了脊髓成像的固有局限，从而便于利用双光子显微镜对小鼠脊髓进行成像 体内通过结合定制的脊柱稳定装置与深度麻醉方法，显著减少了由呼吸引起的身体运动。本视频方案展示了如何暴露活体脊髓的一小部分区域，并通过最大限度地减少组织损伤和出血，使该区域在较长时间内保持稳定的生理状态。所获取的代表性原始图像 体内 高分辨率地详细展示小胶质细胞与血管系统之间的紧密关系。时间序列成像显示了活体小鼠脊髓中小胶质细胞突起的动态行为。此外，对同一 z 平面进行连续扫描，展示了该方法所能达到的卓越稳定性，可生成无需在采集后进行图像对齐的图像序列或延时电影。最后，我们展示了如何利用该方法在后续时间点重复观察和成像脊髓的同一区域，从而实现对持续进行的生理或病理过程的纵向研究 体内.
方案
1. 构建脊柱稳定装置
- 订购Narishige STS-A紧凑型脊髓夹和Narishige MA-6N头部固定适配器。
- 自行设计并制作一块不锈钢底板，用于将两个Narishige部件对齐固定，以便在夹紧动物脊柱和尾部的同时支撑其头部。需注意整个装置应能置于显微镜物镜下方，通常需放置在降低的显微镜载物台上。
2. 动物手术
- 使用空气加热装置预热显微镜腔室，并维持在 37 °C。
- 称量动物体重，并按每公斤体重 100 mg 氯胺酮、15 mg 赛拉嗪和 2.5 mg 乙酰丙嗪的比例配制麻醉混合液，在无菌条件下用 0.9% NaCl 溶液稀释。
- 通过腹腔注射麻醉混合液（KXA）对动物进行麻醉。实验过程中应定期进行足趾夹捏测试，以确保麻醉深度。每小时或根据需要追加初始剂量的一半。
- 在手术过程中使用小动物加热垫提供体温支持。
- 在眼睛上涂抹人工泪液软膏，以防止角膜脱水和损伤。
- 先用修毛器、再用锋利刀片剃除动物背部毛发，彻底清除切口周围区域的毛发。
- 清除剃除的毛发，并用酒精棉片消毒剃毛后的皮肤表面。
- 在目标脊髓节段（本例显示为胸椎）上方的皮肤做一小段约 1.5 cm 的纵向切口。
- 小心牵拉皮下结缔组织，暴露背部肌肉。
- 在目标节段小心....
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讨论
本文所述方法利用双光子显微镜，可在麻醉小鼠的脊髓中对密集分布的荧光标记细胞结构进行稳定且可重复的体内成像。所实现的成像稳定性得益于一种自制的脊柱稳定装置以及可减少呼吸运动伪影的麻醉方案。该脊柱稳定装置在小鼠身体下方留有呼吸空间，可使用市售的脊柱夹具和头部固定部件组装而成（图1）。该方法具有高度可重复性、微创性，且能持续获得原始数据，无需进行大量图像后期处理即可用于实验分析（图2和视频1）。因此，该技术可用于研究大量市售荧光标记小鼠品系中的细胞间相互作用（图1-3及视频1）。该方法不仅能解析密集分布的细胞结构，还可捕捉快速发生的细胞功能或反应（视频1、2）。例如，可用于定量测量小胶质细胞突起随时间的动态变化及其在趋化行为中移动的距离。定量分析方法可参照我们先前对活体脑组织中小胶质细胞反应成像的研究中所描述的方法8。此外，该方法还可与其他实验技术联合使用，例如结合荧光标记微球来在体内测量脊髓中小胶质细胞的吞噬功能。
能够在不同时间点对同一动物脊髓的完全相同区域进行重复的体内成像，使得研究生物现象的进展过程以及解.......
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国家多发性硬化症协会资助项目号 RG4595A1/T（授予 DD）以及美国国立卫生研究院/神经疾病与中风研究所资助项目号 NS051470、NS052189 和 NS066361（授予 K.A.）的支持。图片和视频改编和/或重印自 Davalos et al., J Neurosci Methods. 2008 Mar 30;169(1):1-7 版权所有 © 2008，经 Elsevier 出版社许可。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 罗丹明B-葡聚糖 | Invitrogen | D1841 | 70 kDa，用 ACSF 溶液稀释（3% w/v） |
| 盐酸氯胺酮 | Bioniche Pharma | NDC 编号：67457-001-10 | 注射用，50 mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA 编号：139-236 | 注射用赛拉嗪 20 mg/ml |
| 乙酰丙嗪 | Vedco, Inc. | NADA 编号：117-531 | 注射用，10 mg/ml |
| 人工泪液软膏 | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 编号：57319-760-25 | 润滑剂 |
| 聚维酮碘 | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott 剪刀 | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | 弯曲型钝头剪刀 |
| 直型镊子 | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | 带齿尖镊子 |
| 小血管电凝器 | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| 明胶海绵 | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| 紧凑型脊髓夹具 | Narishige International | STS-A | |
| 头部固定适配器 | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| 乳酸林格氏液 | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| 布托啡诺注射液 | Reckitt Benckiser | NDC 编号：12496-6757-1 | 布托啡诺，注射用 |
| 拜耳喹诺 | Bayer AG | NADA 编号：140-913 | 恩诺沙星 抗菌注射液 2.27% (20 ml) |
| 加热垫 - 大号 | Fine Science Tools | 21060-10 |
参考文献
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
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