石蜡包埋材料中DNA的提取用于遗传学和表观遗传学分析

摘要

本视频演示了从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取DNA的实验方案。该过程需耗时数天，包括使用二甲苯脱蜡、乙醇再水化，并用蛋白酶K处理组织切片，以纯化和分离DNA，用于后续的基因特异性或全基因组分析。

摘要

疾病的发生和发展通常伴随着频繁的遗传和表观遗传异常，包括染色体重排、拷贝数增益与缺失以及DNA甲基化。高通量、全基因组范围的分析技术（如微阵列）的进步显著提高了我们识别和检测这些特定改变的能力。然而，随着技术的持续发展，样本质量和可获得性仍是一个限制因素。此外，随访的临床信息和疾病结局通常在初始样本采集数年后才被收集。这些样本通常为福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）标本，可在医院档案中保存数年甚至数十年。若采用适当的提取方法，可高效且有效地从石蜡包埋标本中回收DNA。从妥善保存和储存的标本中提取的高质量DNA可用于定量分析，以比较正常与病变组织，并生成遗传和表观遗传特征¹。为从石蜡包埋样本中提取DNA，需将组织芯或显微切割的组织进行二甲苯处理，以溶解组织中的石蜡，随后通过一系列乙醇洗涤进行再水化。接着使用蛋白酶K消化蛋白质及核酸酶等有害酶类。加入含有变性剂（如十二烷基硫酸钠（SDS））的裂解缓冲液可促进消化过程²。通过缓冲液饱和的苯酚处理和高速离心，从组织裂解液中纯化核酸，从而形成两相溶液。DNA和RNA保留在上层水相中，而蛋白质、脂质和多糖则分别被分离至界面层和有机相。保留水相并重复苯酚抽提可获得纯净的样本。苯酚抽提后，加入RNase A以去除污染的RNA。在RNase A孵育后进一步进行苯酚抽提，以去除任何残留的酶。加入乙酸钠和异丙醇使DNA沉淀，再通过高速离心将DNA形成沉淀并促进异丙醇的去除。沉淀过程中残留的过量盐分可能干扰后续的酶促反应，但可通过70%乙醇洗涤DNA沉淀，再经离心重新收集DNA来去除³。DNA最终重悬于蒸馏水或选定缓冲液中，定量后于-20°C保存。纯化后的DNA可用于多种下游应用，包括但不限于PCR、阵列比较基因组杂交⁴（array CGH）、甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）以及测序，从而实现对组织/肿瘤样本的整合分析。

方案

1. 操作注意事项

• 二甲苯和苯酚为有毒化学品，应在通风橱中操作。使用前请参阅材料安全数据表（MSDS）。
• 二甲苯可溶解某些塑料；应使用聚丙烯管，因其可耐受这些化合物。
• 可购买带有内置活性炭阻隔器的特殊移液枪头，以防止二甲苯溶解移液器中的橡胶部件。也可使用滤芯枪头。

2. 脱蜡

1. 在通风橱中，向含有样本的已标记试管中加入 800 μl 二甲苯（VWR, CABDH6216-4），置于摇床上轻轻振荡 5 至 15 分钟，以溶解石蜡。
2. 将样本在微量离心机中以最高速度（14,000 rpm 或 16,000 × g）离心 3 分钟，使样本沉淀。小心吸除上清液中的二甲苯，并将其弃入聚丙烯管中，作为二甲苯废液处理。注意不要扰动沉淀物。
3. 重复步骤 1 和 2 的二甲苯洗涤操作，直至石蜡完全溶解。通常需要洗涤两到三次，具体次数取决于组织样本的大小。完全溶解的样本会显得柔软，有时会失去原有的结构完整性。可用移液器吸头轻轻评估样本的完整性。

3. 乙醇复水

1. 加入 800 μl 分子生物学级 100% 乙醇（v/v），涡旋混匀，然后在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 3 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。
2. 加入 800 μl 70% 乙醇（用去离子水（dH₂O）稀释 100%（v/v）乙醇配制），涡旋混匀，然后以 14,000 rpm 离心 3 分钟。小心弃去乙醇上清液。
3. 加入 800 μl 50% 乙醇（用去离子水（dH₂O）稀释 100%（v/v）乙醇配制），涡旋混匀，然后以 14,000 rpm 离心 5 分钟。用移液器尽可能彻底吸除乙醇，操作时需格外小心，避免扰动沉淀，因为充分水合的组织比脱水组织更难形成紧密沉淀。
4. 弃去乙醇上清液后，将沉淀在空气中干燥 5 分钟，注意避免过度干燥。

4. 组织消化

1. 加入 200–500 μl 裂解缓冲液（配方见下文）。使用移液器吸头或涡旋振荡器重悬沉淀。在此步骤中充分重悬组织可实现更彻底的消化，从而获得更高的 DNA 产量。
2. 将样品置于水浴或加热块中，在 56°C 下孵育。
3. 对于组织芯样本，每天早晚各加入 20 μl 蛋白酶 K（20 mg/ml 储存液，Invitrogen，AM2548）。
4. 重复上述消化步骤 2 至 5 天，直至组织完全溶解。

裂解缓冲液

• 10 mM Tris-HCl pH 8.0
• 100 mM EDTA pH 8.0
• 50 mM NaCl
• 0.5% SDS
• 200 μg/ml 蛋白酶K（使用前加入）

5. DNA 纯化

1. 加入等体积的缓冲液饱和酚（Fisher, BP1750I-400），通过倒置混匀。在微量离心机中以14,000 rpm转速离心至少5分钟。
2. 将水相转移至新离心管中。注意观察中间相：是否存在大量白色物质？
3. 对水相部分重复步骤1和2，直至中间相清晰（通常需3次或更多次）。当中间相模糊时进行反向萃取*，以提高最终得率。
4. 当中间相清晰后，向样品的萃取后水相中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（Fisher, BP1752I-400）。混匀5分钟，然后在14,000 rpm下离心5分钟。此步骤可减少残留酚含量，并进一步使中间相清晰，便于水相的提取。
5. 将水相转移至新离心管中，加入RNase A至终浓度100 μg/ml，在37°C处理1小时。
6. 重复步骤1至4，以去除任何残留的RNase A，并收集水相部分。此时仅需1至2次缓冲液饱和酚处理，因为相比初始裂解液，需去除的蛋白质含量已显著减少。

*进行反向萃取时，向含有中间层和有机相的样品管中加入50-100 μl的dH₂O。倒置混匀管子，在微量离心机中以14,000 rpm离心5分钟。收集水相，并将其加入之前获得的水相提取物中。持续进行反向萃取，直至中间层变得澄清。

6. DNA 沉淀

1. 估算所收集的水相层的体积。
2. 加入1/10体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）和1体积的分子生物学级100%异丙醇（v/v）（或2.5体积的100%乙醇）。
3. 充分混匀，置于冰上或-20°C冰箱中30分钟或过夜。
4. 在4°C下，以最大速度（14,000 rpm）在微量离心机中离心10分钟。
5. 弃去上清液。
6. 用70%预冷乙醇洗涤沉淀，以去除不需要的盐分。
7. 将沉淀重悬于所选缓冲液中（通常为dH₂O）。

7. DNA 定量

1. 测定DNA的浓度，A260:A280比值应约为1.8。对于微量DNA，建议使用NanoDrop分光光度计进行测量。
2. 定量后，应进行凝胶电泳以检测样本DNA的质量，并确定污染的RNA是否已完全降解。
3. 高质量的提取DNA现已适用于下游应用，或可于-20°C保存以备后续使用。若样本中仍存在RNA，请重复DNA纯化和沉淀步骤，并重新定量和评估样本质量。

讨论

用于组织病理学分析和诊断的活检或手术切除组织通常经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）后长期保存。随着人们对疾病遗传基础研究兴趣的日益增长，能够从这些样本中提取DNA，已成为一种宝贵的诊断材料来源，可用于基因组分析和转化医学研究。传统上，FFPE样本被认为不适合用于分子分析，因为核酸可能因蛋白质-核酸交联以及蛋白质-蛋白质交联而受到严重修饰⁶。然而，研究发现蛋白酶消化可释放出适合后续分析（包括PCR、阵列CGH、测序和甲基化谱分析）的片段化核酸，这使得这些珍贵的样本得以用于遗传学分析⁶。

从石蜡包埋组织中提取DNA是一种基于差异溶解度来纯化DNA的可靠方法。提取所得DNA的质量和数量，以及后续DNA扩增的成功与否，取决于提取前、提取过程中及提取后多个参数。这些参数包括但不限于：组织类型和组织量、用于组织保存的固定剂类型、固定时间、石蜡块的存放时间及储存条件，以及目标扩增DNA片段的长度^1,7。从组织中彻底去除石蜡是成功提取DNA最关键的步骤，因为未完全溶解的石蜡会导致样本质量下降，并抑制PCR扩增。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲苯	VWR international	CABDH6216- 4	-
1.7 ml SafeSeal 微量离心管	Sorenson BioScience	11510	-
Spectrafuge 16M 微量离心机	Labnet International	C0160-B	-
裂解缓冲液			10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml 蛋白酶K
蛋白酶K储存液	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
蛋白酶K储存液
缓冲饱和酚 pH 6.6/7.9	Fisher Scientific	BP1750I-400	-
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher Scientific	BP1752I-400	-
RNase A	Roche Group	10109169001	100 mg
3M 乙酸钠 pH 5.2			40.81 g NaOAc 溶于 80 ml 用冰乙酸调节 pH 至 5.2 加 dH2O 定容至 100 ml 高压灭菌
ND 3300 分光光度计	NanoDrop	-	-