通过心内注射表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞，建立小鼠骨转移实验模型。利用生物发光成像和微型CT对肿瘤的发展及其导致的溶骨性病变进行纵向监测。
本文内容
摘要
摘要
将 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 细胞通过心内注射接种至 Nu/Nu 小鼠后，受体动物体内出现了系统性转移。采用 IVIS Spectrum 进行生物发光成像，以监测细胞接种后肿瘤细胞的分布与发展情况，包括使用 DLIT 重建技术来测定肿瘤信号及其位置。
转移性病灶累及骨组织后会引发溶骨性活性，本研究采用微型CT对胫骨和股骨的病灶进行纵向评估。成像使用Quantum FX微型CT系统，具有快速成像和低X射线剂量的特点。由于辐射剂量较低，可在累积X射线剂量远低于LD50的情况下进行多次成像。实验中使用小鼠成像转运装置，依次在IVIS Spectrum和Quantum FX系统中对小鼠进行成像，确保在生物发光成像和CT成像中均实现动物体位的精确定位。光学成像数据与CT数据集通过Living Image 4.1软件进行三维共配准。这种多模态方法可实现对肿瘤生长与发育过程的密切监测，同时同步评估溶骨性活性。
方案
在临床前研究中，纵向成像用于追踪疾病进展或评估治疗效果。在肿瘤学领域，光学方法提供了严格的工具，可用于监测肿瘤生长，并在研究的每个时间点对细胞增殖或基因表达进行精确定量。解剖结构的变化可通过高分辨率技术（如显微CT）进行测量，但进行纵向成像时必须使用低剂量X射线，以避免产生生物学伪影。光学成像与显微CT图像可进行共定位，从而结合功能信息与解剖信息，确保从动物模型中获取最大限度的数据。
1. 细胞制备
- Caliper 公司提供一系列表达荧光素酶的癌细胞系，用于小鼠模型中的临床前研究。
- MDA-MB-231-luc-D2H2LN 是一种表达荧光素酶基因的人乳腺肿瘤细胞系，可作为体内肿瘤发生的光学指示剂。该细胞系源自 D3H1 乳腺脂肪垫肿瘤自发产生的淋巴结转移灶，具有强烈的转移形成能力。
- 细胞以无病原体的冷冻培养物形式提供，在标准培养基中易于生长，无需使用筛选标记。
- 在将细胞注射入动物体内之前，为验证荧光素酶活性，可通过胰酶消化收获一个融合度达 90% 的培养瓶中的细胞。通过将 50,000 个细胞分配至微孔板中并进行系列稀释，来检测荧光素酶活性。
2. 动物体内细胞的心内注射
- 注射前，使用 3% 异氟烷对动物进行麻醉。
- 将 100 万至 300 万个细胞以 50 µL 体积注射至左心室。细胞悬液中含有 150 µg/mL D-荧光素酶底物，用于验证注射技术。
- 为确认心内注射是否正确，小鼠需在 IVIS 系统中进行成像。若生物发光成像（BLI）信号遍布全身，则表明注射正确；若信号局限于局部，则表明细胞未正确注入心脏。
3. 通过BLI成像监测转移灶
- 成像转运舱用于在 IVIS Spectrum 和 QuantumFX microCT 系统中对小鼠进行数据采集时提供支撑。
- 转运舱有助于在成像过程中保持动物体位一致，并集成了定位标记信号，以辅助自动共定位。舱体连接至异氟烷麻醉蒸发器，以维持麻醉状态。
- 使用 Living Image 软件 4.1 中的成像向导可自动选择曝光时间、光圈值（f-stop）和像素合并（binning）参数，确保定量数据的采集。
- 可根据实验性质，在数秒至数月的时间跨度内进行纵向研究，获取并比较多幅图像。
- 细胞注射后第6天，使用 IVIS Spectrum 进行生物发光成像（BLI），结果显示九只小鼠中有七只出现骨转移。
4. 使用微型CT对溶骨性病变进行纵向监测
- 通过生物发光成像（BLI）显示明显骨转移的小鼠，使用Quantum FX微型CT系统进行成像。
- Quantum FX微型CT系统可在X射线剂量足够低的条件下提供高质量图像，从而实现临床前研究中的真正纵向微型CT扫描。
- 该系统可在不到一分钟的时间内对双侧腿部的骨质破坏进行纵向监测。
- 小鼠使用3%异氟烷麻醉后，可直接从IVIS Spectrum系统转移至本系统。
- 通过拼接两张60 mm的图像，可获得完整动物体的视野。
- 30 mm的视场（FOV）非常适合对膝关节进行高分辨率成像。
- 单次扫描仅需18秒即可获得足够高的分辨率，用于测量和定量骨转移病灶，辐射剂量仅为13 mGy。
- 在36天内，小鼠最多接受了8次微型CT扫描，未对肿瘤生长或动物健康造成影响。
- 微型CT成像显示，骨病变在第10天即可被观察到，并迅速进展，与生物发光成像（BLI）信号的增强相一致。
5. 生物发光成像与微型计算机断层扫描的三维共配准与分析
- 在 IVIS Spectrum 和 Quantum FX micro CT 系统上完成图像采集后，可将数据进行共定位，生成三维重建图像。
- 将 microCT 图像导出为 DICOM 文件，并载入 Living Image 4.1 三维多模态分析工具中。
- 在 Living Image 软件中运行 DLIT 程序，对光学信号进行三维重建。
- 利用软件中的基准标记工具，将光学生物发光成像（BLI）信号与 micro CT 图像进行共定位配准。
- 共定位配准后的数据集可进行定量分析，用于监测疾病进展过程中的多个参数；在此示例中，我们同时追踪转移性肿瘤的生长以及骨组织中溶骨性病变的发展。
讨论
利用微型CT进行的小动物成像已被应用于监测病理条件下（如肿瘤发展）的溶骨性病灶（Cowey等，2007；Labrinidis等，2009）。由于荧光素酶标记肿瘤的生物发光成像已在临床前研究中被广泛采用，生物发光与微型CT图像的联合配准可更清晰地界定生物发光信号的解剖位置（Kaijzel等，2007）。既往研究表明，使用荧光素酶标记的乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231-luc-D3H2LN，经心内注射后可转移至骨骼并形成溶骨性病灶（Jenkins等，2005；Minn等，2005）。在本研究中，我们采用MDA-MB-231-luc-D3H2LN系统性转移模型，结合光学成像与低辐射剂量微型CT成像，对肿瘤转移及溶骨活性进行了纵向研究。我们依次使用IVIS Spectrum和Quantum FX微型CT系统进行成像，并利用新开发的Living Image 4.1软件实现了生物发光与CT图像的配准（Heng等，2010）。IVIS系统的生物发光成像具有高灵敏度，可无创检测肿瘤细胞，使肿瘤在早期阶段即可被发现。Quantum FX成像可实现骨病灶的精确三维重建，并提供详细的解剖信息。Quantum FX系统具备低辐射剂量成像能力，适用于对疾病进展进行长期纵向监测。在配准图像中清晰展示了骨病灶与肿瘤转移之间的关联，充分体现了多模态成像在纵向追踪病灶发展过程中的优势。
披露
作者是Caliper Life Sciences的员工，该公司生产本文所介绍的仪器。
参考文献
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent Human Breast Cancer Cell Lines that Permit Rapid and Sensitive in vivo Detection of Mammary Tumors and Multiple Metastases in Immune Deficient Mice. Breast Cancer Research. 7, R444-R454 (2005).
- Cowey, S., Szafran, A. A., Kappes, J., Zinn, K. R., Siegal, G. P., Desmond, R. A., Kim, H., Evans, L., Hardy, R. W. Breast Cancer Metastasis to Bone: Evaluation of Bioluminescent Imaging and MicroSPECT/CT for Detecting Bone Metastasis in Immunodeficient Mice. Clinical and Experimental Metastasis. 24, 389-401 (2007).
- Labrinidis, A., Hay, S., Liapis, V., Ponomarev, V., Findlay, D. M., Evdokiou, A. Zoledronic Acid Inhibits Both the Osteolytic and Osteoblastic Components of Osteosarcoma Lesions in a Mouse Model. Clinical Cancer Research. 15, (2009).
- Kaijzel, E. L., Pluijm, G. vander, Lowik, C. W. G. M. Whole-Body Optical Imaging in Animal Models to Assess Cancer Development and Progression. Clinical Cancer Research. 13, 3490-3497 (2007).
- Minn, A. J., Kang, Y., Serganova, I., Gupta, G. P., Giri, D. D., Doubrovin, M., Ponomarev, V., Gerald, W. L., Blasberg, R., Massague, J. Distinct Organ-Specific Metastatic Potential of Individual Breast Cancer Cells and Primary Tumors. The Journal of Clinical Investigation. 115, (2005).
- Xu, H., Christensen, A., Kuo, C., Nilson, D., Lim, E., Whalen, J., Kim, J. B., Zhang, N., Singh, R., Oldfield, S., Troy, T., Rice, B. Co-registration of in vivo Optical Tomography and Micro-CT for Longitudinal Studies. Word Molecular Imaging Congress. , (2010).
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