本文描述了一种从不同脊椎动物物种制备单个活感光细胞以进行荧光成像的方法。该方法可用于对内源性荧光团（如NADH或维生素A）或外源添加的对Ca2+或其他因素敏感的荧光染料的荧光进行成像。
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摘要
摘要
在脊椎动物的视网膜中，光转导——即光信号转换为电信号的过程——由视杆细胞和视锥细胞完成1-4。视杆细胞负责弱光下的视觉，视锥细胞则负责强光下的视觉。光转导发生在光感受器细胞的外段，这是一个特化的区室，含有高浓度的视觉色素，即主要的光感受分子。视觉色素由一种生色团11-cis 视黄醛与一种蛋白质视蛋白结合而成。当视觉色素吸收一个光子后，生色团从11-cis 异构化为全-trans 构型。这种光异构化引起视觉色素的构象变化，从而启动一系列反应，最终导致膜电位的改变，实现将光刺激转化为电信号。细胞从光刺激中恢复的过程包括失活被光激活的中间产物，并重建膜电位。Ca2+ 调控光转导中多个酶的活性，且在光刺激下其浓度会降低。因此，Ca2+ 在细胞从光刺激中恢复以及对背景光的适应过程中发挥着重要作用。
恢复过程的另一个关键环节是视觉色素的再生，这种色素在光检测过程中因其发色团从11-cis发生光异构化转变为全-trans5-7而被破坏。该再生过程始于光激活后的色素释放全-trans视黄醛，留下脱辅基蛋白视蛋白。释放出的全-trans视黄醛在利用NADPH的反应中迅速被还原为全-trans视黄醇，同时视蛋白与进入外节段的新鲜11-cis视黄醛结合，重新形成视觉色素。随后，全-trans视黄醇通过特化的载体——视网膜间感光细胞类视黄醇结合蛋白（IRBP）被转运出外节段，进入邻近细胞。
单个感光细胞的荧光成像可用于研究其生理学和细胞生物学特性。利用对 Ca2+ 敏感的荧光染料，可详细研究外段 Ca2+ 变化与光反应之间的相互作用8-12，以及内段 Ca2+ 储存库在 Ca2+ 稳态中的作用13,14。荧光染料还可用于测量 Mg2+ 浓度15、pH 值，以及作为水相和膜区室的示踪剂16。最后，全-trans 视黄醇（维生素 A）的内在荧光可用于监测其在单个感光细胞中生成与清除的动力学过程17-19。
方案
1. 准备涂有Sylgard的培养皿、实验腔室和剃须刀片
- 需要使用涂有Sylgard弹性体的35 mm Falcon培养皿，以正确切割分离的视网膜，从而获得单个的感光细胞。根据供应商的说明制备弹性体，并将少量弹性体倒入每个培养皿中，使其底部形成一层覆盖。涂覆后盖上培养皿盖并储存。数天后弹性体硬化，培养皿即可使用。
- 分离的感光细胞需要黏附在实验腔室的底部，以便在成像实验过程中保持固定。这可通过在腔室底部涂覆多聚-L-赖氨酸或多聚-L-鸟氨酸实现。每个腔室加入200 μL 0.01%的上述溶液，并用纸巾覆盖腔室以防止灰尘污染。待溶液干燥后，用蒸馏水清洗腔室，并存放于密闭盒中。请在两周内使用。
- 实验结束后清洁腔室时，需用100%乙醇清洗，以去除浸油物镜上的油渍及细胞碎片。为清除细胞碎片，可使用带棉头的涂抹棒轻轻擦洗腔室底部。随后用蒸馏水冲洗，并让腔室干燥后再重新涂覆。
- 使用金属切割器将双面剃须刀片切成小段（每片刀片切成8段）。
2. 溶液的配制
- 溶液的组成因物种而异。对于两栖类动物，任氏液（Ringer's）的成分为（单位：mmol/L）：110 NaCl、2.5 KCl、1.6 MgCl2、1 CaCl2、5 HEPES，pH = 7.55。pH 应用 NaOH 调整至最终值。对于哺乳类动物，任氏液的成分为（单位：mmol/L）：130 NaCl、5 KCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、25 半钠盐-HEPES，pH = 7.40。任氏液密封良好时可在室温下保存数月。
- 储存用葡萄糖溶液，1 mol/L，置于 -20 °C 保存以防止细菌生长。
- 实验当天，将葡萄糖加入任氏液中，使其终浓度为 5 mmol/L。当日实验结束后，应丢弃含葡萄糖的任氏液，因其可能滋生细菌。
3. 视网膜的分离
- 为正确切除视网膜，动物在处死前必须在暗室中适应黑暗环境至少2-3小时。动物应在暗室中置于合适的通风容器内进行暗适应。
- 将两个35 mm的培养皿各装入一半的林格氏液。
- 在微弱红光下处死动物并取出眼睛。此后所有操作均在红外光下进行，使用解剖显微镜或配备视频监视器的摄像系统。
- 清除眼球外表面残留的组织。剪开并移除前部结构，然后将眼杯转移至其中一个盛有林格氏液的培养皿中。
- 去除玻璃体，并通过夹断或剪断连接处，小心地将视网膜与眼杯其余部分分离。轻轻提起视网膜，使其完全脱离眼杯。
- 使用塑料移液管将视网膜转移至第二个培养皿中。将盛有视网膜的培养皿置于避光盒内保存。
4. 视觉感受器细胞的单细胞分离
- 所有操作均在红外光下进行。剪取一小块视网膜组织，用塑料移液器将其转移至涂有Sylgard的培养皿中。含有视网膜组织的溶液总体积应约为250 μL。
- 用刀片夹持器夹取一小段刀片，使刀片边缘与夹持器成约45°角。将视网膜组织平铺在Sylgard层上，并用刀片在保持组织贴附于Sylgard层的同时将其精细切碎。
- 将含有细胞的溶液200 μL转移至实验用样品池中——剩余的视网膜组织留在涂有Sylgard的培养皿内。将含有分离细胞的样品池置于避光盒中保存。
- 静置10分钟使细胞沉降，然后加入2–3 mL任氏液（Ringer's solution）。在此阶段，可根据荧光染料负载方案，对分离的细胞加载特定的荧光染料（例如Fura-2）。
- 现在可将细胞转移至显微镜载物台上进行实验。
5. 荧光成像
- 将样品室转移至落射荧光显微镜的载物台上。调节灌流液、温度探针、红外照明等。
- 拉上窗帘并开始实验。打开显微镜防护罩内的红外光源，聚焦到实验样品室底部，并移动载物台寻找细胞。
6. 代表性结果：
图1展示了采用本方案从蝾螈（Ambystoma tigrinum）视网膜中分离得到的健康杆状和视锥光感受器的形态。由于蝾螈细胞体积较大，且在从视网膜分离后可存活数小时，因此被广泛用于单细胞荧光成像研究。此外，从蝾螈视网膜中通常可稳定获得杆状和视锥两种光感受器细胞。
细胞健康的一个重要标准是存在完整的椭球体（图1），即线粒体聚集的细胞区域。在DAPI光学条件下观察细胞时，由于NADH的存在，该区域的线粒体聚集会产生强烈的荧光信号（图2）。缺乏完整椭球体是细胞受损的标志，通常不适合用于实验。图3显示了一个受损的蝾螈视杆光感受器，其细胞体肿胀，细胞核凝聚。此类细胞在DAPI光学条件下荧光信号明显减弱，但在FITC光学条件下可观察到椭球体区域有强烈的FAD信号（来源于氧化型黄素核苷酸和黄素蛋白）。分离光感受器细胞健康的另一个标准是其在外段受到光刺激后生成全-trans 视黄醇（维生素A）的能力。维生素A的生成需要大量NADPH，这依赖于完整的代谢机制。图4和图5分别展示了完整青蛙和小鼠视杆光感受器外段中维生素A的形成过程。
图1. 健康的单个视杆细胞和视锥细胞。 这些细胞分离自虎纹蝾螈的视网膜。光转导过程发生在外段，椭球部则富含线粒体。视杆细胞负责弱光视觉，视锥细胞负责强光视觉。
图2. 活体蝾螈视杆细胞和视锥细胞的荧光特性。 这些细胞经过暗适应处理，其相应的椭球体中显示出强烈的NADH荧光，而在外节段中未见显著的维生素A荧光。荧光图像的采集是这些细胞在暗适应后首次暴露于可见光下的结果。
图3. 受损的蝾螈视杆光感受器。 肿胀的细胞体和浓缩的细胞核表明存在损伤。该细胞已被氧化，在DAPI光学通道中NADH信号极弱，但在FITC光学通道中FAD信号较强。
图4. 含NADH和视黄醇的青蛙视杆细胞。 这是一个健康的青蛙视杆光感受器，其椭球区显示出强烈的NADH荧光。在光照之前，外节区域的荧光极弱。光照后，由于维生素A的形成，外节区域的荧光显著增强。
图5. 含视黄醇的小鼠视杆细胞。 该图像显示一只健康小鼠的视杆光感受器在光照后因维生素A的形成而在外节段表现出显著的荧光信号。小鼠视杆光感受器的椭球区未显示强荧光信号。
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讨论
如果未能获得健康的分离细胞，问题可能出在视网膜的分离与健康状况，或切碎过程。通常在去除眼球前部和玻璃体后，视网膜会很容易从色素上皮层脱离。如果无法脱离，可尝试从眼杯的周边开始剥离。若仍然难以分离，可能的原因是动物未经过足够时间的暗适应，或所用红光过亮。应确保动物充分暗适应，并调暗红光。可通过观察分离后视网膜的颜色来快速判断其中是否存在视杆光感受器：剪下一小片视网膜并转移至另一个培养皿中，在室内光线下观察。含有视杆光感受器的视网膜组织呈鲜红色（源于视紫红质），且颜色会迅速褪去。无色的组织则表明缺乏视紫红质，因而也缺乏视杆光感受器。这可能是由于视网膜与色素上皮层分离不当，或视网膜本身不健康所致。在此情况下，应确保动物健康并完成正确的暗适应。若已获得健康的视网膜，但未能获得健康的分离细胞，则问题很可能出在切碎步骤。精细的切碎至关重要：若切碎过于粗糙，或视网膜在操作中移位脱落，最终将主要得到视网膜组织碎片而非分离的单个细胞。良好的切碎操作通常会在溶液中形成明显的“云雾状”细胞悬浮物。
单个感光细胞的荧光成像可利用内源性细胞荧光分子，如NADH、FAD或维生素A，以及对不同因素敏感的荧光染料...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由 NEI 基金 EY014850 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 暗室（100-150 ft2) | |||
| 红灯19 | 在线商店 | ||
| 红外光源与红外图像观察仪 | FJW光学系统公司 | ||
| 解剖显微镜19 | 配备红外观察仪 | ||
| 封闭在避光罩内的落射荧光显微镜19 | |||
| 解剖工具（剪刀、镊子、刀片架） | Roboz外科器械公司 | ||
| Sylgard 弹性体 | 夏洛特（北卡罗来纳州） | Sylgard 184 弹性体试剂盒 | |
| 聚-L-鸟氨酸（0.01%） | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| 聚-L-赖氨酸（0.1%） | Sigma-Aldrich | P8920 | 稀释至 0.01% |
| 实验腔室 | Warner Instruments | D3512P | |
| 培养皿，塑料移液管 | Fisher Scientific |
参考文献
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