限制性稀释细胞移植实验用于测定肿瘤传播细胞的频率。本方案描述了一种生成同基因型斑马鱼的方法，这些斑马鱼可发育出荧光标记的白血病，并详细说明如何分离这些白血病细胞，并以限制性稀释方式将其移植至成年斑马鱼的腹腔内。
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摘要
摘要
具有自我更新能力的癌细胞是肿瘤中唯一能够无限促进肿瘤生长的细胞类型，因此被称为肿瘤传播细胞或肿瘤起始细胞。人们认为，靶向并清除这些自我更新的细胞将能够阻断肿瘤进展并防止复发，从而显著改善患者的预后1。确定肿瘤中自我更新细胞频率的最常用方法是极限稀释细胞移植实验，该实验将肿瘤细胞以递增的剂量移植到受体动物体内；通过计算产生肿瘤的动物比例，来推算原始肿瘤样本中自我更新细胞的数量2, 3。理想情况下，每次极限稀释实验应使用大量动物，以准确测定肿瘤传播细胞的频率。然而，涉及小鼠的大规模实验成本较高，大多数极限稀释实验每次仅使用10至15只小鼠。
斑马鱼作为一种癌症模型已日益受到重视，这主要归功于其易于进行遗传操作，以及能够以较低成本开展大规模实验。此外，斑马鱼中建立的癌症类型被发现与其对应的人类疾病高度相似4。尽管可通过亚致死剂量照射受体动物，将肿瘤细胞从一条鱼移植到另一条鱼，但受体免疫系统在21天后通常会再生，从而导致肿瘤消退5。近年来建立的同源性斑马鱼品系极大促进了肿瘤移植研究6-8。由于这些个体在遗传上完全相同，移植的肿瘤细胞可在受体鱼体内稳定植入，并能长期监测肿瘤的生长情况。同源性斑马鱼特别适用于限制性稀释移植实验，因为肿瘤细胞无需适应异源微环境中的生长，从而避免了对自我更新细胞频率的低估9, 10。此外，研究人员已成功利用同源性斑马鱼完成单细胞移植8，并且可一次性高效、经济地完成数百只动物的移植，这些优势均有助于更准确地估算自我更新细胞的频率。
本文介绍了一种在同源性斑马鱼中建立原发性荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL），并通过极限稀释法将这些肿瘤移植到成年斑马鱼中以测定自我更新细胞频率的方法。尽管以白血病为例进行说明，但该方案适用于利用斑马鱼中的任何癌症模型来测定肿瘤传播细胞的频率。
方案
1. 斑马鱼胚胎的DNA显微注射
- 线性化 rag2::cMyc 和 rag2::GFP11 通过消化制备DNA构建体 10μg 每种质粒与NotI酶切 37°C 过夜。
- 酚:氯仿抽提并沉淀质粒，然后将每份质粒重悬于 20μL H2O.
- 通过在1%琼脂糖凝胶上电泳分析各消化质粒的1:1、1:5和1:10稀释液，测定DNA浓度 20μL, 10μL 和 5μL 高分子量DNA标准品。这种定量方法通常比分光光度计读数更准确。
- 将 DNA 稀释至终浓度为 60 ng/μL 在1M KCl + 0.5X TE中，用于通过30ng/注射至CG1品系（或其他同源品系）斑马鱼胚胎μL rag2::cMyc + 30 ng/μLμL rag2::GFP.
- 注射操作应按照先前演示的方法进行12, 13简而言之，雄性和雌性斑马鱼在注射前一晚被放置于交配室中。注射当天，将DNA注入注射针头，调节压力，使产生一个气泡，其体积约为 50μm 直径被排出（30皮克DNA），通过目镜测微尺进行测量。随后，在单细胞阶段对胚胎进行显微注射，将DNA直接注入细胞内，而非卵黄中。注射后的CG1胚胎及幼体存活率通常较低，仅有约5%的鱼能够成功整合外源转基因；因此， >应注射600枚胚胎，以确保部分鱼只会发生白血病。
- 将已注射的胚胎保存于 28.5°C，24小时后移除死亡的胚胎。随后在生命第5天将动物转移至大型水箱，并按先前所述方法进行培育14.
2. 在斑马鱼幼体中筛选原发性T细胞急性淋巴母细胞白血病
- 注射后约28天，在培养皿中向25mL鱼系统水中加入200μL浓度为4ng/mL的Tricaine-S，麻醉幼年斑马鱼。
- 使用落射荧光显微镜在20倍放大倍数下观察幼鱼体内荧光标记的T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）发育情况，激发波长为485/20，发射滤光片为530/25，用于检测GFP荧光（图1）。
- 将肿瘤阳性的幼鱼与阴性幼鱼分开。阴性幼鱼可在后续时间点再次检查，待肿瘤可能增大后重新评估，以确保未遗漏任何T-ALL阳性个体。
- 至少每周一次使用落射荧光显微镜监测T-ALL阳性鱼，追踪肿瘤生长情况。
3. 荧光标记的原代白血病细胞的分离与纯化
- 当GFP阳性白血病细胞完全占据 >将50%的动物置于含有9 mL鱼系统水的培养皿中，加入1 mL浓度为4 ng/mL的Tricaine-S，处死鱼类。
- 将鱼放入新的培养皿中，加入1 mL 0.9X PBS（含5%胎牛血清）以缓冲细胞。用刀片研磨鱼体，用移液器吹打混合物以分散大的细胞团块，然后将细胞悬液通过一个 40μm 将筛网过滤器放入50 mL离心管中。无需将所有组织团块完全解离为单细胞。
- 移液器 500μL 将细胞转移至4 mL聚苯乙烯管中。加入 1μL 1 mg/mL 碘化丙啶（PI），用于标记死细胞。涡旋混匀后，将细胞置于冰上保存。
- 处死一只野生型 CG1 鱼，按上述方法研磨并过滤，以收集正常细胞，用于移植时作为肿瘤细胞的载体。向 50 mL 离心管中加入 4 mL 含 5% FBS 的 0.9X PBS，总体积为 5 mL。
- 计数正常细胞，稀释至 3x105 细胞/mL，置于含5% FBS的0.9X PBS中，然后用移液器吸取 100μL/well 96孔板
- 使用荧光激活细胞分选仪（FACS），将GFP阳性、PI阴性的肿瘤细胞（图2A,B）分选至含有血细胞的96孔板中，分选剂量如下：每孔10个细胞分选至48个孔，每孔100个细胞分选至24个孔，每孔1000个细胞分选至12个孔，每孔10,000个细胞分选至6个孔。此外，另将10,000个细胞分选至不含正常血细胞的孔中，随后使用FACS重新分析，以评估分选细胞的纯度和活力（图2C）。
4. 成年斑马鱼的极限稀释移植
- 通过在 2000×g 条件下离心 96 孔板 10 分钟，使细胞沉淀。
- 移除 95 μL 上清液，并将细胞重悬于剩余的 5 μL 液体中。
- 握住一条成年（>60 天龄）同源性斑马鱼，使其腹部朝上，使用 26G/2” 微量注射器将细胞悬液注入腹腔。移植前无需对斑马鱼进行麻醉。通常，45 条鱼注射 10 个白血病细胞，20 条鱼注射 100 个细胞，7 条鱼注射 1,000 个细胞，5 条鱼注射 10,000 个 T-ALL 细胞。
5. 分析确定白血病起始细胞频率
- 移植后约28天，使用485/20 nm激发波长和530/25 nm发射滤光片的落射荧光显微镜检查移植鱼，检测GFP荧光。记录每批注射鱼中呈阳性的鱼的数量与总鱼数的比例。
- 此后每14天重新检查一次鱼类，持续至90天，记录阳性鱼的数量。当发现肿瘤阳性鱼进入濒死状态时，采用过量Tricaine-S处死动物。
- 将结果填入表格，如图3D所示。将数据上传至基于网页的ELDA（极限稀释分析）统计软件：http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html15，该软件利用各移植剂量下肿瘤阳性与阴性动物的频率，计算出原发性T细胞急性淋巴细胞白血病中具有自我更新能力的白血病细胞频率。
6. 典型结果：
同源鱼类胚胎的DNA显微注射通常会导致注射后胚胎的存活率较低， <24小时后有60%的胚胎存活。此外，注射后的同系鱼在幼体发育期间的存活率通常较低，常出现 <28天存活率为20%。因此，为了获得能够发育出T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的转基因鱼，注射大量胚胎显得尤为重要。
以CG1品系胚胎为例，将其注射 rag2::cMyc+rag2::GFP转基因在发育中的胚胎中共分离，因此表达GFP的每个细胞也会表达cMyc。在注射后28天对幼鱼进行原发性T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的筛选（图1）。先前的研究表明，约5%的注射鱼在其胸腺中会出现GFP阳性的T细胞（图1），而这些鱼将100%发展为白血病，随着T细胞发生转化11尽管在第28天时，少数斑马鱼可能已发展出较晚期的白血病，易于检测，但大多数个体仅表现为GFP阳性胸腺（图1），因此需在高倍镜下逐个检查幼鱼，以确保筛选出所有阳性个体。GFP阳性的T-ALL细胞将逐渐占据 >在第45至70天期间，动物存活率为50%。
在本示例中，斑马鱼在出生后65天被处死，分离白血病细胞并通过FACS进行有限稀释移植分选。将碘化丙啶阴性且GFP阳性（图2）的单个细胞分选至96孔板中。对10,000个已分选细胞进行重新分析，以评估细胞活力（理想情况下>95%）和纯度（理想情况下>92%，图2）。移植后的T-ALL通常在28天内出现，但部分肿瘤可能需要超过60天才能形成。在本示例中，第28天时，早期肿瘤表现为注射部位附近出现GFP阳性细胞区域（图3B），而部分T-ALL进展更明显，已扩散至腹腔（图3C）。图3D展示了来自三种不同原发性T-ALL的有限稀释细胞移植实验数据。在这些实验中，共移植了超过220只动物，单人可在数小时内轻松完成。使用ELDA软件进行数据分析显示，平均每135个T-ALL细胞中即有一个具有自我更新能力的白血病起始细胞（图3E）。
图1. 在单细胞阶段注射了rag::-cMyc+rag::-eGFP的斑马鱼幼鱼，在注射后28天筛选原发性白血病的生长情况。其中一条鱼（*）胸腺内出现GFP阳性的T细胞；该鱼将随T细胞逐渐转化而发展为T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）。此阶段在第28天非常常见。另一条鱼（**）已出现进展期T-ALL，并已扩散至软组织。其余两条鱼未见肿瘤生长。图像拍摄放大倍数为16倍。
图2. 从患病动物中分选出荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞，并用于极限稀释细胞移植实验。首先设定门控以选择单细胞（左上图），然后选择碘化丙啶（propidium iodide）阴性细胞（左中图）。最后设定门控以仅分选GFP阳性的白血病细胞（左下图）。分选后的细胞在移植前应重新分析以评估其活力和纯度（右图）。
图3. 在细胞移植后28天检测斑马鱼白血病的生长情况。鱼类样本表现为白血病阴性（A），或在注射部位出现小肿瘤（B），或呈现进展性白血病（C）。图像以7倍放大倍数拍摄。每个稀释度下白血病阳性鱼的数量与总移植鱼数量的比值记录如（D）所示。数据输入基于网络的ELDA程序，用于计算具有自我更新能力的白血病细胞数量以及上下95%置信区间（E）。
讨论
在癌症研究中使用斑马鱼的一个主要优势是，可以在相对较低的成本下使用大量动物。这一点在极限稀释细胞移植实验中尤为重要，因为该实验通过计算移植后发生肿瘤的动物比例来确定肿瘤起始细胞的频率。在本文所介绍的方法中，每次实验使用的移植受体动物超过70只，从而能够准确估算肿瘤传播细胞的数量。所使用的动物数量和移植的肿瘤细胞剂量应根据特定的癌症模型进行优化；例如，如果初步实验表明肿瘤起始细胞较为稀少，则有效的移植剂量可分别为每次移植100,000、50,000、10,000和1,000个细胞。
同源型斑马鱼品系在极限稀释分析中具有重要用途。然而，这些品系尚未在所有实验室中广泛使用，且某些斑马鱼癌症模型仅存在于异源性鱼类中。在经过免疫消融的野生型品系中也可进行极限稀释细胞移植实验，但所计算出的自我更新细胞频率可能比使用同源型斑马鱼时高出10至100倍8。需要注意的是，在向非免疫匹配且经辐照的受体进行移植时，应使用更高剂量的细胞，因为部分肿瘤细胞在移植至异源微环境后无法存活。此外，当受体动物的免疫系统在21天后恢复时，许多肿瘤将开始消退，因此应在移植后每隔7天对动物进行一次肿瘤生长评估。
本文所述方法适用于任何斑马鱼癌症模型，目前已用于测定T细胞急性淋巴母细胞白血病8以及实体瘤模型横纹肌肉瘤16中的肿瘤起始细胞频率。这些肿瘤通过将致癌基因和荧光标记物共同注射到胚胎中而实现荧光标记；由于DNA共同分离，任何表达致癌基因的细胞也将同时表达荧光蛋白17。推荐使用荧光标记，因为它无需处死动物即可追踪肿瘤生长，并可通过FACS简单地分离肿瘤细胞；但也可使用针对肿瘤特异性标志物的抗体对肿瘤细胞进行标记以促进其纯化，尽管在斑马鱼中进行抗体染色可能需要优化。
最后，一旦确定了特定肿瘤类型中肿瘤传播细胞的发生率，就可以利用这些检测方法来鉴定调控其细胞频率的机制。例如，可以在进行极限稀释移植前，用通路特异性抑制剂处理原代肿瘤细胞，或者直接对移植的斑马鱼个体进行药物处理。此外，还可以通过在受精卵单细胞阶段向斑马鱼注射目的基因，从而操控肿瘤本身的遗传特性，使所形成的原代肿瘤过表达该基因。在这些实验中，任何对自我更新细胞频率的影响都将在极限稀释实验中被观察到。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为5T32CA09216-26（J.S.B.）、K01 AR055619-01A1和3 K01 AR055619-03S1（D.M.L.），以及亚历克斯柠檬水义卖基金会、哈佛干细胞研究所和美国癌症协会的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NotI 限制性内切酶 | New England Biolabs | R0189 | |
| 苯酚:氯仿 | EMD Millipore | 6805-OP | |
| 5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| 高分子量 DNA Marker | Fermentas | R0621 | |
| 同源性斑马鱼 | 参考文献6-8 | ||
| 胎牛血清 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 16000-036 | |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| 26G/2" 微量注射器 | Hamilton Co | 80366 | |
| 40μm 细胞滤网 | BD Biosciences | 352340 |
参考文献
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