用于增强保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官细胞结构的振动切片法

摘要

本文描述了一种简单的振动切片机切取耳蜗柯蒂器官组织，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦显微镜观察的实验方法。该方法可更好地保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官精细的细胞结构，从而实现对不同类型细胞的准确定量分析。

摘要

哺乳动物的柯蒂氏器是由机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞构成的高度有序的细胞镶嵌结构
（详见文献^1,2）。要观察这种细胞排列结构，通常需要对柯蒂氏器进行横切。特别是柱细胞和德伊特尔细胞等非感觉细胞，其细胞核位于毛细胞的基底部，若不横切柯蒂氏器则无法观察到。然而，哺乳动物柯蒂氏器精细的细胞结构，包括柱细胞和德伊特尔细胞纤细的细胞质突起，很难通过常规组织学方法（如石蜡切片和冷冻切片）得以完好保存，而这些方法通常需与标准免疫组织化学染色技术相兼容。

本文描述了一种简单且可靠的实验流程，包括耳蜗的振动切片、这些振动切片的整体免疫组织化学染色，以及随后的共聚焦显微镜观察。该方法已广泛用于多种器官的免疫组织化学分析，包括小鼠肢芽、斑马鱼肠道、肝脏、胰腺和心脏（参见^3-6中的部分示例）。此外，该方法在胚胎和成年小鼠的柯蒂氏器突变体与对照组中，均成功实现了支柱细胞成像及数量定量分析⁷。然而，目前该方法尚未被广泛应用于哺乳动物柯蒂氏器的研究。本文阐述了该方法在更好地保存成年柯蒂氏器精细细胞结构以及实现多种细胞类型定量方面的潜力。

方案

1. 内耳的分离与固定

1. 为分析耳蜗柯蒂氏器中的细胞排列模式，需对适当发育阶段的胚胎或成年个体实施安乐死。
2. 解剖取出包含膜性内耳的耳囊。在小鼠中，此操作可在胚胎第14.5天（E14.5）及更晚阶段进行，其中E0.5表示检测到阴道栓的日期。解剖耳囊时，首先进行断头并在颅骨中线处打开颅腔，移除脑组织以暴露双侧耳结构（图1A）。使用镊子（如Dumont #5，图1B）可完整取出内耳。若仅需成像柯蒂氏器，则无需仔细去除与耳囊相关的所有神经和结缔组织。
3. 将完整内耳浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4°C条件下轻轻振荡固定过夜，使用1.8 ml螺口NUNC冷冻管或其他合适容器。PFA溶液应使用ddH₂O新鲜配制，随后储存于-20°C备用。
4. 次日，用1X磷酸盐缓冲液（PBS）更换三次溶液以洗去固定剂。组织可在无菌1X PBS中保存数天至数月，直至准备进行后续处理。对于成年组织，需在4°C条件下用10% EDTA（0.27 M）脱钙5天，随后用1X PBS冲洗并储存。

2. 切割振动切片机切片

1. 在1× PBS中配制4%低熔点琼脂糖。将低熔点琼脂糖加入1× PBS中，微波加热至琼脂糖完全溶解。注意防止溶液沸腾溢出，加热过程中应定期取出并轻轻旋转混匀。将溶液置于55°C水浴中保温，待用。
2. 用镊子将内耳从1× PBS溶液中取出，放置于Peel-A-Way包埋模具底部。用移液器吸除模具中多余的1× PBS。加入足量液态4%低熔点琼脂糖，完全覆盖组织（图2A）。
3. 将内耳调整至合适的切片平面。为获得良好的柯蒂氏器横切面，可参照耳囊在头内原位的位置进行定位，并在横断面上进行切片。对于E14.5胚胎至成年样本，应将内耳侧向放置，使外半规管可见（图2B）。调整内耳角度，使耳囊后侧边缘形成的直线与预期切面大致呈45度角（图2A、B）。当耳囊背侧朝上时，耳蜗基底回应位于下方（箭头所示，图2B），前半规管（asc）应位于上方（图2B）。
4. 琼脂糖在室温下30分钟内即可凝固。将含有包埋组织的Peel-A-Way模具转移至4°C冰箱中，待切片前使用。若需次日切片，应在模具中加入1× PBS覆盖琼脂糖，并将模具置于含有浸湿1× PBS滤纸的盒子中保存。
5. 剥去塑料模具。用剃刀片切割出包含内耳组织的琼脂糖块。注意确保切面平整，并与琼脂糖块另一侧平行，该侧面将作为琼脂糖块粘附固定的表面。由于琼脂糖不会渗入组织内部，因此不应过度修剪组织周围的琼脂糖，以保证组织得到充分支撑。
6. 使用速干胶将琼脂糖块粘附于切片台表面。
7. 使用振动切片机以40至100 μm厚度进行切片。将切下的组织片保存于盛有1× PBS、0.1% Triton X-100的组织培养皿中。图2C显示了耳蜗螺旋结构的代表性切面。
8. 用镊子小心剥离组织表面的琼脂糖。琼脂糖不会进入组织内部，仅附着于内耳外表面。
9. 如需要，可用带有大孔口的移液器吸头收集无琼脂糖残留的切片组织，以避免组织过度剪切损伤。若需对多个不同组织进行多种抗体染色，可将切片分置于16孔或24孔组织培养板中进行管理。

3. 抗体染色振动切片

继续进行抗体染色。将组织切片置于溶液中以整体装片、自由漂浮的方式处理。以下是以耳蜗柯蒂氏器支柱细胞的S100标记物为例的抗体染色方案，但该方案适用于任何抗体。除非另有说明，所有洗涤步骤均在室温下进行。

1. 在多孔组织培养皿中，将游离切片置于 PBT（1X PBS，1% 牛血清白蛋白，0.1% Triton X-100）中，轻轻振荡孵育 30 分钟。
2. 吸除旧溶液，将游离切片在含正常山羊血清的 PBT（50 μl NGS / 1 ml PBT）中，轻轻振荡封闭 30 分钟。
3. 吸除旧溶液，加入用 PBT + NGS 稀释的一抗（S100 抗体按 1:200 比例稀释），于 4°C 轻轻振荡孵育过夜。
4. 吸除一抗溶液，用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟，随后再用 PBT 洗涤 4 次，每次 30 分钟。
5. 用 PBT + NGS 封闭 30 分钟。
6. 加入用 PBT + NGS 稀释的荧光标记二抗（山羊来源），于 4°C 轻轻振荡孵育过夜，或在室温下孵育数小时，同时保持轻柔振荡。
7. 吸除二抗溶液，用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟，随后再洗涤 4 次，每次 30 分钟。
8. 吸除最后一次 PBT 洗涤液，替换为含有核复染剂的合适水溶性封片介质。

4. 将切片固定在载玻片上并进行共聚焦显微镜观察

为防止盖玻片压碎厚切片，在封片单个切片时，必须在载玻片与盖玻片之间插入一个间隔物。以下是两种厚切片振动切片机切片的封片方法：

1. 1. 可通过在组织切片周围用真空脂画一个方形环来创建间隔层。这样，当放置盖玻片时，其边缘将被真空脂密封。用拇指按压盖玻片边缘，使其牢固地粘附在载玻片上。若真空脂在盖玻片所有边缘均匀且整齐地分布，则密封效果足以满足倒置共聚焦显微镜的使用要求。
   2. 也可使用已知网目尺寸的琼脂糖层析树脂（如 Affi-Gel Blue Gel，Bio-Rad）来创建间隔层。在显微镜载玻片上盖玻片四角的位置各加 1 μl 树脂。在四个树脂点中间滴加一份组织切片及封片介质。加盖盖玻片。若使用倒置共聚焦显微镜，需用指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。
2. 利用共聚焦显微镜获取染色后振动切片的光学切片图像。为定量分析耳蜗柯蒂氏器内的不同细胞类型，应以特定步长（1.5 至 3 μm 之间）获取 z 轴层扫图像（z-stack）。切片应使用核染料进行复染（步骤 3.8）。共聚焦图像采集完成后，可在任意计算机屏幕上观察图像。通过在 z 轴层扫序列中逐层观察细胞核的出现与消失，可手动计数细胞数量。

5. 代表性结果：

通过染色显示存在于柱细胞和德特尔斯细胞中的S100蛋白，并用核染料进行复染，获得振动切片机切片的代表性共聚焦z轴层扫图像（图3A-F）。每幅图像是以3 μm为步长采集的共聚焦图像，其中图A为最接近振动切片表面的图像，图F为位于切片最深层的图像。耳蜗柯蒂器官的形态结构基本保持完整，特别是柱细胞的胞质突起未见断裂。通过观察z轴层扫图像中柱细胞核的出现与消失（图3A至3F），可分别计数内柱细胞和外柱细胞的数量（见图中标注的计数结果，图3A-F）。由于每张共聚焦图像中各类细胞数量较少，该方法可用于对柯蒂器官内大多数细胞类型的精确计数。

图1. 包裹在耳囊中的完整成年小鼠内耳，年龄为15周。（A）从颅腔内部视角观察的右侧耳囊（用方括号标示），在移除脑组织后可见；图示方向为前侧朝右。（B）从颅骨中分离出的完整15周龄内耳。左侧内耳的外侧面可见，右侧内耳的内侧面可见。标签标注了前半规管（asc）、耳蜗（co）和前庭窗（ow）的位置。

图2. (A) 来自一名15周龄成年个体的完整内耳，置于琼脂糖中，并位于Peel-Away模具中央。图中所示为预期的切面方向。(B) 15周龄完整内耳在包埋前的放大图像。部分周围骨组织已被解剖移除，以便更清晰地观察膜迷路。图中描出了外半规管（lsc）、前半规管（asc）和耳蜗（co）（白色曲线）。耳蜗基回（箭头）及预期切面方向（虚线）已标出。(C) 耳蜗的代表性横切面。在一个耳蜗导管的横切面上，柯蒂器官（oC）用方框标出，血管纹（sv）用括号标出，前庭膜（Rm）已指明。

图3. 野生型小鼠在出生后21天（P21）的柯蒂氏器。（A-F）通过S100抗体标记的柯蒂氏器进行连续共聚焦成像，层厚为3 μm，以显示支柱细胞和迪特细胞。从系列图像起始到结束处的内、外支柱细胞计数已编号。缩写：IHC（内毛细胞）、aIHC（相邻内毛细胞）、OHC（外毛细胞）、PC（支柱细胞）、DC（迪特细胞）。

讨论

使用振动切片机切片，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦成像，可实现耳蜗柯蒂氏器的可视化观察，同时将组织损伤降至最低。显然，从振动切片内部区域获取的共聚焦图像显示出优异的细胞形态保存效果，其局限性仅来源于固定过程中产生的假象。尽管偶尔可观察到细胞结构的破坏（如柱细胞胞质突起的断裂，未展示），但靠近振动切片两个切割表面区域所获得的共聚焦图像通常与内部区域的图像难以区分。该方法操作简便，所需主要设备——振动切片机和共聚焦显微镜——均为大多数研究人员普遍可及的常规仪器。此外，该方法适用于任何在柯蒂氏器中能产生特异性染色的抗体。实际上，该方法的主要限制因素正是抗体的特异性，因此可能需要对本方案的第3步进行适当调整，以确保特定抗体能够产生特异性染色信号。综上所述，本文介绍了一种简便且通用的方法，适用于各类抗体，可最大限度地保存并分析柯蒂氏器的细胞组织结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica VT1000S 振动刀片切片机	Leica Microsystems
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.
Student Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	91150-20
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-050
Peel-A-Way 包埋模具	Polysciences, Inc.	18986 或 18646A
牛血清白蛋白	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
山羊血清	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG	Invitrogen	A-11036	1:1000 稀释
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
真空润滑脂	Fisher Scientific	S41718
Affi-Gel Blue Gel	Bio-Rad	153-7301