本文描述了一种简单的振动切片机切取耳蜗柯蒂器官组织，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦显微镜观察的实验方法。该方法可更好地保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官精细的细胞结构，从而实现对不同类型细胞的准确定量分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物的柯蒂氏器是由机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞构成的高度有序的细胞镶嵌结构
（详见文献1,2）。要观察这种细胞排列结构，通常需要对柯蒂氏器进行横切。特别是柱细胞和德伊特尔细胞等非感觉细胞，其细胞核位于毛细胞的基底部，若不横切柯蒂氏器则无法观察到。然而，哺乳动物柯蒂氏器精细的细胞结构，包括柱细胞和德伊特尔细胞纤细的细胞质突起，很难通过常规组织学方法（如石蜡切片和冷冻切片）得以完好保存，而这些方法通常需与标准免疫组织化学染色技术相兼容。
本文描述了一种简单且可靠的实验流程，包括耳蜗的振动切片、这些振动切片的整体免疫组织化学染色，以及随后的共聚焦显微镜观察。该方法已广泛用于多种器官的免疫组织化学分析，包括小鼠肢芽、斑马鱼肠道、肝脏、胰腺和心脏（参见3-6中的部分示例）。此外，该方法在胚胎和成年小鼠的柯蒂氏器突变体与对照组中，均成功实现了支柱细胞成像及数量定量分析7。然而，目前该方法尚未被广泛应用于哺乳动物柯蒂氏器的研究。本文阐述了该方法在更好地保存成年柯蒂氏器精细细胞结构以及实现多种细胞类型定量方面的潜力。
方案
1. 内耳的分离与固定
- 为分析耳蜗器官中的细胞排列模式，处死相应发育阶段的胚胎或成年个体。
- 解剖取出包含膜迷路内耳的耳囊。在小鼠中，该操作可于胚胎第14.5天（E14.5）及以后阶段轻松完成，其中E0.5定义为检测到阴道栓的当天。耳囊的解剖首先通过断头并在中线处打开颅骨实现。移除脑组织以暴露双侧耳结构（图1A）。使用镊子（如Dumont #5，图1B）可完整地将内耳壳出。若需对耳蜗器官进行成像，则无需仔细去除与耳囊相关的所有神经和结缔组织。
- 将完整的内耳组织浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4°C条件下轻轻振荡固定过夜，使用1.8 ml带螺帽的NUNC Cryo-tube管或其他适当大小的容器。PFA溶液应使用ddH20新鲜配制，然后储存于-20°C备用。
- 次日，用1X磷酸盐缓冲液（PBS）更换三次溶液以洗去固定剂。组织可在无菌1X PBS中保存数天至数月，直至进行后续处理。对于成年组织，需在4°C条件下用10% EDTA（0.27 M）脱钙5天，随后用1X PBS冲洗并储存。
2. 切割振动切片机切片
- 在1× PBS中配制4%低熔点琼脂糖。将低熔点琼脂糖加入1× PBS中，微波加热至琼脂糖完全溶解。注意防止溶液沸腾溢出，加热过程中应定期取出并旋转混匀。将溶液置于55°C水浴中保温，待用。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
使用振动切片机切片，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦成像，可实现耳蜗柯蒂氏器的可视化观察，同时将组织损伤降至最低。显然，从振动切片内部区域获取的共聚焦图像显示出优异的细胞形态保存效果，其局限性仅来源于固定过程中产生的假象。尽管偶尔可观察到细胞结构的破坏（如柱细胞胞质突起的断裂，未展示），但靠近振动切片两个切割表面区域所获得的共聚焦图像通常与内部区域的图像难以区分。该方法操作简便，所需主要设备——振动切片机和共聚焦显微镜——均为大多数研究人员普遍可及的常规仪器。此外，该方法适用于任何在柯蒂氏器中能产生特异性染色的抗体。实际上，该方法的主要限制因素正是抗体的特异性，因此可能需要对本方案的第3步进行适当调整，以确保特定抗体能够产生特异性染色信号。综上所述，本文介绍了一种简便且通用的方法，适用于各类抗体，可最大限度地保存并分析柯蒂氏器的细胞组织结构。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
动物实验按照威斯康星医学院动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。
致谢
作者感谢儿童研究所影像核心设施在共聚焦显微镜方面的支持，以及张健博士关于使用琼脂糖珠固定切片的建议。本研究由美国国立卫生研究院（N.I.H.）资助项目DC010387提供经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S 振动刀片切片机 | Leica Microsystems | ||
| Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Student Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way 包埋模具 | Polysciences, Inc. | 18986 或 18646A | |
| 牛血清白蛋白 | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| 山羊血清 | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 稀释 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| 真空润滑脂 | Fisher Scientific | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
参考文献
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
