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方法文章

整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

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DOI：

10.3791/2797

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2011年10月10日

 ,  , 
1Department of Genetics, University of Georgia

本文内容

摘要

此整体样本 原位 杂交实验方案讨论了确保小鼠胚胎（E8.5至E11.5天）基因表达研究获得可重复且高质量结果的关键步骤。

摘要

整体封片 原位 杂交是一种用于确定胚胎中基因表达模式的非常有用的方法。 原位 杂交操作步骤繁琐且技术要求高，多个关键步骤共同影响最终结果的质量。 本方案详细描述了优化探针标记及其性能的若干关键质量控制步骤。 总体而言，我们的实验方案详细描述了为可重复获得高质量结果所必需的关键步骤。首先，我们介绍了通过体外转录生成地高辛（DIG）标记RNA探针的方法。 体外 通过PCR生成的DNA模板的转录。我们描述了三种关键的质量控制检测方法，用于确定地高辛（DIG）标记探针的含量、完整性和特异性活性。这些步骤对于制备出具有足够灵敏度以检测小鼠全胚胎中内源性mRNA的探针至关重要。此外，我们还描述了E8.5至E11.5天龄小鼠胚胎的固定与保存方法。 原位 杂交。随后，我们详细描述了对复水胚胎进行有限的蛋白酶K消化的方法，以及杂交条件、杂交后洗涤和RNase处理的步骤，以去除非特异性探针杂交信号。使用碱性磷酸酶（AP）偶联的抗体对标记的探针进行显色，以显示内源转录本的表达模式。文中展示了成功实验的代表性结果以及典型的非理想实验结果。

方案

1. 通过核糖探针的生成 体外 转录

  1. 准备用于PCR产物的 体外 转录模板
    1. 在PCR引物的5'端设计噬菌体转录启动子序列
      注意：添加在正义链PCR引物5'端的启动子序列将用于转录正义探针，而添加在反义链PCR引物5'端的启动子序列将用于合成反义探针1-3我们未检测到仅包含核心启动子序列的模板与包含核心启动子及额外5'序列的模板在转录效率上存在任何差异。该方法已应用于T3、T7和SP6噬菌体启动子。
      应避免选择在基因家族成员间高度保守或高度重复的序列，因为这些序列可能导致非特异性杂交，从而增加背景染色。富含GC的探针会限制地高辛标记的尿苷三磷酸（digoxigenin-rUTP）的掺入，而DNA模板序列中连续的T残基会因洋地黄毒苷分子之间的空间位阻而限制dig-UTP的掺入。探针长度可在300 bp至1 kb范围内选择。但只要满足上述条件，通常较长的探针具有更高的特异性活性。
    2. PCR 的模板可以是质粒克隆、基因组克隆或基因组 DNA。通常我们购买全长 EST 克隆 （例如来自 ATCC 或 Open Biosystems） 用作PCR模板。使用标准PCR程序扩增模板DNA，以获得包含启动子序列的PCR产物。为了制备足量的探针模板以支持多次探针合成反应，我们通常设置8个平行反应 50μl PCR反应。将这些反应产物合并，用于下一步实验。 通常进行少量大体积的PCR反应或较多的小体积反应（例如 50μl 我们使用的反应足以生成可供多次探针合成反应所需的模板量。
    3. 为去除质粒制备过程中污染的蛋白质，特别是残留的RNase，对每个样品进行消化处理 100μl PCR 反应的 1μl 20 mg/ml 蛋白酶 K 的 55° C 至少30分钟。蛋白酶K消化步骤之后使用的所有试剂和其他物品均应为无RNase，并专用于RNA实验。
    4. 在蛋白酶K消化过程中，取PCR反应样品进行琼脂糖凝胶电泳，以检测PCR产物的完整性。我们使用丙烯酰胺微型凝胶分离较小的PCR产物（小于600–700 bp），使用琼脂糖凝胶分离较大的PCR产物（>600-700 bp）进行质量控制分析。如果在凝胶上观察到多条条带，建议优化PCR反应条件，以获得单一的、大小正确的PCR产物。
    5. 用等体积的苯酚/氯仿（1:1）混合液彻底抽提经蛋白酶K消化的PCR反应产物，随后用等体积的氯仿再抽提一次。每一步均需涡旋振荡试管至少30秒以充分混匀。上述操作必须在化学通风橱中进行。
    6. 通过加入0.1体积的3M醋酸钠和2体积的100%乙醇沉淀纯化的PCR产物。置于-20° C 至少30分钟。
    7. 在微量离心机中以13,000 rpm离心5分钟，移除上清液，用70%乙醇洗涤。让DNA沉淀完全干燥。
    8. 将 DNA 重悬于合适体积的溶液中（例如 50μl) 1×TE。使用荧光计测量DNA浓度。
    9. 使用与噬菌体启动子序列或探针内部序列相对应的引物，测定每份PCR模板制备物的核苷酸序列。这是关键的质量控制步骤，可确保探针模板具有正确的序列。
    10. DNA 已准备好作为模板使用 体外 转录。将DNA模板保存于 4° C.
  2. 体外 以PCR产物为模板进行转录。
    1. 在最终体积中建立RNA转录反应 50μl转录反应包括 500 - 1000 ng 模板 DNA， 5μl 含100 mM DTT的10×转录缓冲液 10μl 2.5 mM dig-NTP 混合液， 3μl （50˜90 个单位）RNA 聚合酶， 1μl α-32P CTP（最多6个月大），其余体积通过添加焦碳酸二乙酯处理水补足。2.5 mM dig-NTP 混合液通常配制为一种 40μl 含有工作液 10μl 10 mM CTP, 10μl 10 mM GTP, 10μl 10 mM ATP, 6.5μl 10 mM UTP 3.5μl 10 mM 地高辛-11-UTP。配制转录反应体系时，确保所有反应组分（除酶以外）均升温至室温。先将DNA与水混合，然后加入反应缓冲液，混匀后再加入其他组分；否则转录缓冲液中的亚精胺会导致DNA沉淀。根据所用RNA聚合酶推荐的温度孵育2小时。
      注意：α-32加入P以测定起始核苷酸池中有多少比例被掺入到RNA探针中，这是衡量反应效率的重要指标。以下所有步骤均遵循处理相关操作的规程 32P.
      一种测量合成RNA探针数量的替代方法是使用小体积分光光度计。该方法可避免使用 32P标记（参见步骤1.3.1中的注释）
    2. 孵育的最后几分钟内，根据制造商说明书准备Quick Spin Column（Roche）。
    3. 孵育后，加入 1μl RNase-free DNase I，于 37° C 10 分钟。
    4. 稀释至 100μl 与 50μl 反应稀释缓冲液（20 mM Tris pH 7.5, 1% SDS, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl（RNase free，配制50 ml 储液，室温保存））。取 1μl （通常插入到 4μl 用于闪烁计数以测定总起始放射活性及用于凝胶分析。
    5. 将剩余的反应液加至层析柱床中心，在台式临床离心机中以1100 × g离心4分钟。离心后，RNA探针即位于收集管中。
    6. 加入两倍体积的100%乙醇至洗脱反应液中，充分混匀，冰上静置5分钟（或置于-20° C 或 30 分钟。
    7. 在微型离心机中以最大转速离心5分钟，使RNA探针沉淀成团。
    8. 用移液器彻底去除上清液，让沉淀自然风干。切勿使沉淀过度干燥，否则将难以溶解。
    9. 将RNA探针溶解于 50 μl - 100 μl 1xTE 或 DEPC-H₂O2O. 取 1 μl 用于测定掺入率百分比及变性丙烯酰胺凝胶分析的样品。将探针浓度调整至100 ng/μl 根据预估产量。
    10. 通过全部三项质量控制的探针可储存于 -20° C 6至12个月。我们通常在12个月内用完探针库存。探针在-20°C下很可能可以长期保存。
  3. 核糖探针的质量评估——探针产量的测定
    1. 为估算探针产率，将离心柱纯化后回收的计数除以离心柱纯化前反应体系中的计数（通过探针合成方案中所取样品测得）。对于本反应，100% 掺入率 = 33 μg. 成功的反应通常产率为15-50%。掺入率低于15%的探针（<5 μg 产量）不应使用。
      注意：测量探针产量的另一种方法是使用微量体积分光光度计或荧光计，直接测定柱层析离心后存在的RNA量。这种替代方法避免了使用 32P同位素示踪标记。我们使用BioTek Epoch微孔板分光光度计测量了核糖探针的浓度。将分光光度计测得的数值与根据核糖探针质量估算的结果进行比较 32P掺入结果显示，这两种方法在使用相似的小体积时可得到可比较的结果（2 μl最终探针制备样品
      产量极低或无产量几乎总是由于用作PCR模板的质粒制备物中存在RNase污染所致。务必按照步骤1.1.3所述，用蛋白酶K处理质粒DNA和PCR产物。
  4. 核探针质量评估——特异性活性的测定
    1. 为了检测地高辛标记的UTP掺入程度，进行点样检测。这是关键的质量控制步骤。
      调整探针浓度至 100 ng/μl. 点样 1 μl 系列稀释（10-2 至 10-5将探针点样至直径为82 mm的Hybond-N+（GE Healthcare）或其他等效尼龙膜上。设置未标记的DNA样本作为阴性对照。立即使用紫外交联仪在125 mJoules条件下对湿润的膜进行交联，或根据所用尼龙膜的制造商说明进行操作。
      以下所有步骤（1.4.2–1.4.6）均在室温下于培养皿中置于摇床上进行。在将探针稀释液点样至滤膜后，无需担心RNase污染。
    2. 室温下，用 10 ml 含 1% 封闭试剂（Roche）的 1X TN 缓冲液（10X TN 缓冲液 = 1M Tris pH7.5, 1.5M NaCl）封闭滤膜 30 分钟
    3. 用10 ml 1× TN缓冲液洗涤1次，每次15分钟。
    4. 在1X TN缓冲液中按1/5000稀释抗地高辛素Fab片段，孵育30分钟。
    5. 用10 ml 1× TN缓冲液洗涤2次，每次15分钟。
    6. 使用BM紫色底物进行显色反应（培养皿中约需5 ml）。从10倍稀释的样品开始，斑点处应可见显色-4 30分钟内进行稀释。此时，用5×TE缓冲液洗涤两次，每次5分钟，以终止显色反应。如果在对应于10的位点处未观察到信号-4 稀释后，探针应丢弃。
      注意：根据我们的经验，仅在短探针中发现比活性不足的情况。在遵循本方案中规定的其他设计标准的同时，增加探针模板的长度（最长可达1 kb），应可提高探针的比活性。比活性过低会导致信号水平极低或无法检测。
  5. 通过5%变性丙烯酰胺凝胶电泳检测探针的完整性。
    这是另一项重要的质量控制检测。本方案假设探针已用 32合成反应过程中使用 P（见步骤 1.2.1）。我们采用变性丙烯酰胺凝胶以获得高分辨率，从而可轻松检测到降解或不完整的探针。通常使用 5% 变性丙烯酰胺微型凝胶（7.5 g 尿素，1.9 ml 40% 丙烯酰胺，1.9 ml 2% 双丙烯酰胺（或使用 20:1 的丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液），1.5 ml 10× MOPS 凝胶缓冲液（0.2 M 吗啉丙磺酸，pH 7.0，50 mM 醋酸钠，5 mM EDTA）和 H2O 至终体积 15 ml）对于分离本方案所用尺寸范围的探针效果极佳。
    注意：作为替代方案，可从不同供应商处购买TBE-尿素预制胶。请遵循制造商提供的说明进行预制胶电泳操作。
    1. 将样品与等体积的凝胶上样缓冲液（Gel Loading Buffer，Ambion）混合，并充分混匀。
    2. 加热至 95° C 5分钟以变性任何二级结构。
    3. 立即将样品置于冰上冷却，然后上样至凝胶，以防止重新退火。
    4. 以200 V电压同时电泳跑完柱前和柱后的样品，直至蓝色染料迁移至凝胶底部。凝胶使用1× MOPS凝胶缓冲液进行电泳。
    5. 用保鲜膜包裹凝胶，并将其暴露于X射线胶片或磷屏成像仪屏幕，以检测放射性标记的RNA。如果 32不使用P标记时，可用常规荧光染料对凝胶进行染色以检测RNA
    6. 成功的探针合成将产生一条在凝胶顶部附近迁移的清晰RNA探针条带。

2. 小鼠胚胎的收集与保存

  1. 应将小鼠胚胎收集于预冷的 PBST（PBS + 0.1% Tween 20，经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理）中，并在解剖过程中保持置于冰上。
  2. 胚胎在 4 ml 带螺旋盖的玻璃小瓶中处理。多个胚胎可置于同一小瓶中固定。单个小瓶中最多可固定 10 至 15 个 E9.5 期或 5 个 E10.5 期胚胎。由于胚胎体积增大，E11.5 期胚胎在固定前需用刀片沿中线剖开，以利于杂交过程中探针的渗透。每个小瓶中最多可放置 3 个半剖的 E11.5 期胚胎。
  3. 为最大限度提高本实验方案各步骤的效率并减少对胚胎的损伤，胚胎固定及所有洗涤步骤均在样品小瓶中进行，加入溶液至小瓶颈部下缘，使仅留少量气泡，除非另有说明。所有洗涤步骤中，均将小瓶平放于摇床上进行振荡。
  4. 在 4°C 条件下，用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBST 在摇床上固定 6 小时至过夜。小瓶应水平放置，并在 4°C 下于摇床上振荡。
  5. 固定后，将胚胎在冰上用 PBST 洗涤两次，每次 5 分钟，然后通过甲醇/PBST 梯度（25% 甲醇/PBST、50% 甲醇/PBST 和 75% 甲醇/PBST）逐步脱水至 100% 甲醇，使用玻璃巴斯德吸管在小瓶中更换溶液。胚胎可在 100% 甲醇中于 -20°C 保存长达 8 个月，甚至更久。

3. 地高辛标记探针与小鼠整体胚胎的杂交

  1. 当胚胎仍处于甲醇中时，用显微解剖刀刺穿 E10.5 及更晚期胚胎的心脏和头部（如果在解剖过程中未完成此步骤）。这一简单操作可使洗涤液进入脑泡和心腔，从而显著降低背景染色。
  2. 通过在甲醇/PBST 系列溶液中依次洗涤，使胚胎重新水化（75% 甲醇/PBST、50% 甲醇/PBST 和 25% 甲醇/PBST），每个甲醇浓度下洗涤 5–10 分钟。随后在 100% PBST 中洗涤两次，每次 5 分钟。
  3. 在冰上用 4:1 PBST : 30% H2O2 孵育 1 小时，然后在 1× PBST 中换液三次，每次 5 分钟。
  4. 去除最后一次 PBST 洗涤液，加入 1 ml 含 10 μg/ml 蛋白酶 K 的 PBST。在蛋白酶 K 消化过程中，将管子垂直放置于 25°C 水浴中的试管架内。
    注意：蛋白酶 K 溶液会因自消化而随时间失去活性。为确保最大且一致的活性，蛋白酶 K 溶液必须在每次使用前新鲜配制。每次使用时先配制少量 1 mg/ml 储存液，再进行稀释。蛋白酶 K 的孵育时间应根据每批蛋白酶 K 粉末及每种胚胎年龄进行优化。例如，E9.5 胚胎通常在 25°C 下消化 10–15 分钟，而 E10.5 胚胎通常需要 20–30 分钟。实验过程中应精确测量蛋白酶 K 的孵育时间，以便在不同管之间及不同实验之间进行有效比较。消化过程中应严格控制温度以提高可重复性，即使 1°C 的微小差异也可能影响消化程度。强烈建议在具有精确温控功能的培养箱或水浴中进行蛋白酶 K 消化。此步骤对探针穿透组织至关重要，有助于产生强信号。然而，过度消化会损伤胚胎，导致其在后续步骤中逐渐解体。
  5. 用新配制的含 2 mg/ml 甘氨酸的 PBST 在室温下洗涤两次，每次 5 分钟，以终止蛋白酶 K 消化反应。随后在 PBST 中再洗涤两次，每次 5 分钟。
  6. 在室温下用 4% PFA/PBST、0.2% 戊二醛（Polysciences）固定消化后的胚胎 20 分钟。注意避免固定不足或过度。随后在 PBST 中洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 此时应将胚胎分组用于杂交。去除 PBST，加入 1 ml 已预热至 65°C 的杂交缓冲液（50% 超纯甲酰胺（Invitrogen）、5× SSC，pH 5、1% SDS、50 μg/ml 肝素（Acros）、50 μg/ml Torula RNA（Sigma））（不含探针）。待胚胎沉降后，吸除全部杂交缓冲液，并替换为 1 ml 新鲜预热的不含探针的杂交缓冲液。
  8. 在 65°C 的摇动水浴或振荡平台上的烘箱中（例如 Boekle Shake 'n' Bake 烤箱，见表 1）预杂交 1 小时。若使用水浴孵育，请确保水面达到但不超过管口。杂交温度可提高至 70°C。对于大多数我们测试过的探针，高于 65°C 的杂交温度不会影响信号强度或背景。胚胎在含甲酰胺的缓冲液（如杂交缓冲液）中会变得半透明、黏稠且脆弱，操作时需格外小心。
  9. 将预杂交缓冲液替换为含探针的 0.4 ml 杂交缓冲液，探针浓度为 0.25–1 μg/ml。对于约 E8.5 及更早期的胚胎，使用 0.5 μg/ml 探针浓度。对于更晚期的胚胎，应将探针浓度从 1–0.1 μg/ml 进行滴定，以确定在低背景条件下获得良好信号的最佳浓度（通常为 0.25–0.5 μg/ml 左右）。请注意，较大胚胎可能需要更大的杂交体积。在 65°C 下过夜杂交。
  10. 如果胚胎被蛋白酶 K 处理过度，会显得极度透明，可能黏附在管壁上或解体。出现此类现象的胚胎应在本实验方案的此阶段丢弃，继续处理将无法获得可解读的数据。
  11. 用预热至 70°C 的溶液 I（50% 甲酰胺、5× SSC，pH 5、1% SDS）替换杂交缓冲液。对于 E8.5 胚胎，洗涤两次，每次 30 分钟；对于 E9.5 及更晚期胚胎，洗涤三次，每次 30 分钟。
  12. 用预热的 50% 溶液 I : 50% 溶液 II（0.5 M NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.5、0.1% Tween 20）在 70°C 下洗涤一次，持续 10 分钟。
  13. 在室温下用溶液 II 洗涤三次，每次 5 分钟。
  14. 将缓冲液替换为含 RNase A（100 μg/ml）和 RNase T1（100 单位/ml）的溶液 II。在 37°C 温室中于摇床上孵育两次，每次 30 分钟。RNase 洗涤对于降低非特异性杂交探针引起的背景至关重要。
  15. 在 65°C 下用溶液 III（50% 甲酰胺、2× SSC，pH 5）洗涤，E8.5 胚胎洗涤两次，每次 30 分钟；E9.5 及更晚期胚胎洗涤三次，每次 30 分钟。
  16. 在 1× TBST 中洗涤三次，每次 5 分钟（100 ml 10× TBS 含 8 g NaCl、0.2 g KCl、12.5 ml 2 M Tris-HCl，pH 7.6，加水至总体积。配制 1× TBST 时，将 10× TBS 按适当体积用水稀释，并加入 Tween 20 至终浓度 0.1%）。
  17. 除非另有说明，所有洗涤均在样品管中进行，液体加至管颈下部水平。所有洗涤步骤中，管子均侧放于摇床上。

4. 地高辛标记探针的抗体检测

  1. 将胚胎置于 0.5 ml 1X TBST + 10% 热处理的绵羊血清中进行预封闭。然后在室温（˜ 20°C）下垂直振荡孵育至少 2.5 小时。
  2. 用新鲜的含 1:2000 - 1:5000 稀释度的碱性磷酸酶标记的绵羊抗地高辛 Fab 片段（通过预先与胚胎丙酮粉孵育去除背景，见下文）的 1X TBST + 10% 血清替代封闭液。对于 E9.5 及更晚期的胚胎，使用更高稀释度（最高至 1:5000），以最小化背景信号。在 4°C 下垂直振荡孵育过夜。
    注意：我们发现，将抗地高辛 Fab 片段与胚胎丙酮粉孵育可降低本方案中的背景染色水平。制备胚胎丙酮粉的方法如下：将汇集的 E12.5–14.5 天小鼠胚胎在最小体积的 PBS 中匀浆，加入 4 倍体积的冰冻丙酮，混匀后在冰上孵育 30 分钟。在 10,000×g 离心 10 分钟以去除上清液。用冰冻丙酮洗涤沉淀物并再次离心。将沉淀物铺展在滤纸上研磨成粉末，并使其自然风干。该粉末可在密封管中于 4°C 长期保存数年。
    抗体去除（预吸附）操作中，应将抗体在封闭前或封闭期间与胚胎丙酮粉预先孵育，以减少非特异性结合。将抗体以 1:100 的比例与少量胚胎丙酮粉（用量无需精确）在 1X TBST/10% 血清中于 4°C 振荡孵育至少 1 小时。通过微型离心机在 4°C 下离心 10 分钟去除粉末。经去除处理的抗体可在 4°C 保存至少 6 个月。
  3. 用 1X TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟，随后在室温下洗涤 5–6 次，每次 1 小时，以去除过量抗体。如需要，可在 4°C 过夜延长洗涤时间以降低背景。过夜洗涤可显著降低背景水平，从而提高信噪比。
  4. 用新配制的碱性磷酸酶缓冲液（100 mM Tris，pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween 20）洗涤 2 次，每次 20 分钟。对于 E9.5 及更晚期的胚胎，需添加 0.5 mg/ml 的左旋咪唑（一种内源性碱性磷酸酶抑制剂）。
  5. 将最后一次洗涤液替换为预热至室温的 BM Purple AP 底物（Roche）。
  6. 在室温下孵育显色反应，并通过解剖显微镜定期观察信号。对于长时间显色反应（数小时至过夜），应将管子避光。高丰度 mRNA 的信号通常在 15 分钟内可见。当信号达到满意程度或背景开始明显时，应终止反应。若溶液本身开始变暗，可通过更换底物溶液来延长显色反应时间。
  7. 用 1X PBST/5 mM EDTA 洗涤 2 次，每次 5 分钟，以终止反应。
  8. 转移至 4% 多聚甲醛/PBST 中重新固定，固定时间可为数小时至过夜。胚胎也可在 4% 多聚甲醛/1X PBST 中长期保存数年，或直接进行切片处理。此最终固定步骤对染色模式的长期保存至关重要。

5. 染色胚胎的石蜡包埋与切片

  1. 在胚胎固定前（步骤 4.8），当染色强度达到理想水平时，对整体染色的胚胎进行拍照。在记录完整胚胎的表达模式后，将胚胎在 BM purple 底物中于室温下孵育过夜至 24 小时，直至整个胚胎变为深蓝色。此步骤旨在确保染色足够深，以便在组织切片中清晰显现。请注意，胚胎的蓝色是由于在整个胚胎表面沉积了一层极薄的色素所致。这种背景染色在切片后于目标组织内部将不可见。
  2. 用 PBS 洗涤染色后的胚胎三次，以去除多余的底物沉淀，并在 4% PFA 中于 4°C 下固定过夜。
  3. 用 PBS 洗涤三次，然后将胚胎脱水至 100% 甲醇（如步骤 2.4 所述）。
  4. 用二甲苯替换最后一次甲醇。在二甲苯中洗涤 2 至 3 次，每次 2 分钟，直至胚胎变得透明。切勿在二甲苯中过度洗涤，否则组织在包埋后会变得非常脆，难以获得完整的切片。应目视监测每次二甲苯孵育过程，确保胚胎刚好达到透明状态，并特别注意不要使孵育时间超过此点。
  5. 将胚胎（E10.5 及以上）转移至 Biopsy Sure-Tek 包埋盒（Fisherbrand），并将整个包埋盒在 65°C 下于石蜡（Fisherbrand）中孵育 15˜30 分钟。更换新鲜石蜡再孵育 15˜30 分钟，然后再次更换。较小的胚胎/组织块需要更短的石蜡孵育时间。E9.5 胚胎可直接置于组织包埋模具中进行所有石蜡更换。在此类情况下，可直接从模具中去除石蜡，而无需转移胚胎。
  6. 经过三次石蜡更换后，将胚胎转移至组织包埋模具（Polysciences）中，并用新鲜石蜡包埋。仔细调整胚胎位置，以获得所需的切面方向。让石蜡冷却至完全凝固。
  7. 使用标准切片机（如 Leica RM2155）将石蜡块切成 8˜14 μm 的切片。将切片收集到载玻片（Fisherbrand）上。
  8. 将载玻片平放并在玻片加热器上干燥。载玻片可在 4°C 下保存数月。
  9. 通过两次 5 分钟的二甲苯洗涤去除干燥切片上的石蜡，并通过系列甲醇/水洗涤重新水化（100% 甲醇 2 分钟，100% 甲醇 2 分钟，90% 甲醇/水 2 分钟，70% 甲醇/水 2 分钟，去离子水 5 分钟）。
  10. 用核快红（Sigma）染色液对切片染色 1 分钟。配制核快红染色液时，将浓缩储备液（0.1% 核快红溶于 5% 硫酸铝水溶液中，加热溶解后经 Whatman 滤纸过滤）用 5% 硫酸铝水溶液按 1:5 稀释。染色后用流水冲洗载玻片，直至水变清澈。核快红作为复染剂，可显示切片中的整体组织结构，其颜色与标记 RNA 探针定位的紫蓝色染色形成良好对比。核快红为饱和性染色，染色强度由染色液浓度控制。若使用该染色液时染色强度不足，可使用更高浓度的核快红溶液重复此步骤。
  11. 通过以下系列溶液依次洗涤载玻片，为封片做准备：90% 甲醇/水，随后两次 100% 甲醇洗涤，再两次二甲苯洗涤。每次洗涤孵育 2 分钟。
  12. 使用 Cytoseal 60 封片介质（Richard-Allan Scientific）封片。请注意，水性封片介质会溶解核快红染色。
    注：我们也曾使用一种塑料包埋树脂（Immuno-Bed, Polysciences Inc）对染色胚胎进行切片，获得了极佳的结果4。

6. 代表性结果：

图1展示了使用本方案获得的代表性结果。图1A显示了E10.5小鼠胚胎中Gata3的表达模式，该图显示信号与背景比高，结果良好。相比之下，图1C显示失败的 原位 使用部分降解的RNA探针进行Gata3 mRNA的杂交。 低比活性探针将导致信号与背景对比度较低的类似结果。 通过比较图A和图C，可以看出对探针质量进行仔细质控评估的重要性，以确保获得高质量的结果。使用Foxg1探针获得的结果（图1B）也展示了一个良好的染色效果，在端脑中呈现特异性染色，而大脑其他区域背景信号较低。脑和心脏是由于探针滞留而导致背景染色的常见部位。用镊子刺穿脑和心脏，可使洗涤液进入胚胎内部，从而最大限度地减少背景染色（见步骤3.1）。图1D展示了在未刺穿脑组织时常见的浅蓝色背景，此结果使用Pax1探针获得，属于非理想结果。Pax1在脑部任何区域均不表达，因此该胚胎脑部所见的所有染色均源于非特异性背景信号。

胚胎中的基因表达：显示不同发育阶段 Gata3、Foxg1 和 Pax1 染色的示意图。
图 1. 代表性结果，展示成功（A、B）与次优（C、D）实验结果的示例。A. 与 Gata3 探针杂交的 E10.5 胚胎。B. 与 Foxg1 探针杂交的 E11.5 胚胎。C. 与部分降解的 Gata3 探针杂交的 E10.5 胚胎，显示整个胚胎信号非常微弱但背景较高。D. 与 Pax1 探针杂交但未穿刺头部的 E10.5 胚胎，显示脑室区域存在背景染色（箭头所示）。

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讨论

本实验方案中所述方法借鉴了多种不同来源的技术，并针对E8.5至E11.5天龄的小鼠胚胎整体标本进行了优化。in situ杂交技术用于脊椎动物胚胎的整体标本检测，最早于20世纪90年代初期出现2,5-12。本方案主要借鉴了非洲爪蟾（Xenopus）胚胎7,8以及小鼠胚胎2,11的相关方法。在本方案中，特别强调对探针进行严格的质量评估。根据本方案的初始步骤，仔细制备高质量、高特异性活性的RNA探针，将显著提高实验数据的质量，并从长远来看节省大量时间和精力。本方案还包括使用PCR扩增生成的DNA模板，用于噬菌体RNA聚合酶的体外转录。该方法快速且具有高度可扩展性，适用于大规模in situ杂交筛选中大量RNA探针的制备13-15。

当背景信号较高而特异性信号较低时，应考虑本方案中的多个步骤。首先需关注探针本身。只要RNA探针符合本方案中规定的设计标准，并通过全部三项质量控制检测（产量、比活性和探针长度），我们从未遇到过高背景的问题。另一个影响背景水平的因素是探针渗透...

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致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R21MH082360（BGC）和 R01HD056315（NRM），以及佐治亚大学提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
地高辛-11-尿苷-5’-三磷酸试剂Roche Group11209256910
核糖核苷三磷酸混合物试剂Roche Group11277057001
用于放射性标记RNA纯化的快速旋转柱耗材Roche Group11274015001
T7 RNA聚合酶试剂Roche Group10881767001
SP6 RNA聚合酶试剂Roche Group10810274001
T3 RNA聚合酶试剂Roche Group11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi试剂PerkinElmer, Inc.BLU008X250UC
重组DNase I，无RNase试剂Roche Group4716728001
尿素，无色至白色晶体或结晶性粉末试剂Fisher ScientificBP169-500
凝胶上样缓冲液试剂AmbionAM8547
Hybond-N+, Amersham耗材GE HealthcareRPN82B
UV Stratalinker 2400设备Stratagene, Agilent Technologies
焦碳酸二乙酯试剂Sigma-AldrichD5758-100ML
肝素钠试剂Acros Organics41121-0010
30% 水溶液过氧化氢试剂Fisher ScientificBP2633-500
戊二醛，8% 电镜级试剂Polysciences, Inc.0/710请按照制造商’的说明谨慎使用
封闭试剂试剂Roche Group11096176001配制成5%储存液，于-20°C保存
蛋白酶K试剂Roche Group3115852001
RNase A 试剂Roche Group10109142001配制成10 mg/ml储存液，于-20°C保存。
RNase T1试剂Roche Group10109193001
超纯甲酰胺试剂Invitrogen15515-026
盐酸左旋咪唑试剂ICN Biomedicals155228
来自酿酒酵母的核糖核酸，VI型试剂Sigma-AldrichR6625经多次苯酚/氯仿抽提并沉淀，重悬于DEPC处理的去离子水中，于-20°C保存
抗地高辛-碱性磷酸酶Fab片段试剂Roche Group11093274910
BM Purple AP底物（沉淀型），即用型溶液试剂Roche Group11 442 074 001
4 mL透明闭口储存瓶便捷套装耗材National Scientific CompanyB7800-2
Shake N Bake杂交炉设备Boekel Scientific136400
Biopsy Sure-Tek活检盒耗材 Fisher Scientific15-200-402C
Paraplast Plus组织包埋介质试剂Fisher Scientific23-021-400
Peel-A-Way一次性塑料组织包埋模具耗材Polysciences, Inc.18646A
Colorfrost Plus显微镜载玻片耗材Fisher Scientific12-550-17
核固红试剂Sigma-AldrichN8002
Cytoseal 60试剂Richard-Allan Scientific8310-16

参考文献

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小鼠胚胎基因表达地高辛标记RNA探针探针质量控制蛋白酶K消化杂交条件碱性磷酸酶检测胚胎固定与保存BM Purple底物RNase处理与洗涤
整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交
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