整体封片 原位 E8.5 至 E11.5 小鼠胚胎的杂交

摘要

此整体样本 原位 杂交实验方案讨论了确保小鼠胚胎（E8.5至E11.5天）基因表达研究获得可重复且高质量结果的关键步骤。

摘要

整体封片 原位 杂交是一种用于确定胚胎中基因表达模式的非常有用的方法。 原位 杂交操作步骤繁琐且技术要求高，多个关键步骤共同影响最终结果的质量。 本方案详细描述了优化探针标记及其性能的若干关键质量控制步骤。 总体而言，我们的实验方案详细描述了为可重复获得高质量结果所必需的关键步骤。首先，我们介绍了通过体外转录生成地高辛（DIG）标记RNA探针的方法。 体外 通过PCR生成的DNA模板的转录。我们描述了三种关键的质量控制检测方法，用于确定地高辛（DIG）标记探针的含量、完整性和特异性活性。这些步骤对于制备出具有足够灵敏度以检测小鼠全胚胎中内源性mRNA的探针至关重要。此外，我们还描述了E8.5至E11.5天龄小鼠胚胎的固定与保存方法。 原位 杂交。随后，我们详细描述了对复水胚胎进行有限的蛋白酶K消化的方法，以及杂交条件、杂交后洗涤和RNase处理的步骤，以去除非特异性探针杂交信号。使用碱性磷酸酶（AP）偶联的抗体对标记的探针进行显色，以显示内源转录本的表达模式。文中展示了成功实验的代表性结果以及典型的非理想实验结果。

方案

1. 通过核糖探针的生成 体外 转录

1. 准备用于PCR产物的 体外 转录模板
   1. 在PCR引物的5'端设计噬菌体转录启动子序列
      注意：添加在正义链PCR引物5'端的启动子序列将用于转录正义探针，而添加在反义链PCR引物5'端的启动子序列将用于合成反义探针^1-3我们未检测到仅包含核心启动子序列的模板与包含核心启动子及额外5'序列的模板在转录效率上存在任何差异。该方法已应用于T3、T7和SP6噬菌体启动子。
      应避免选择在基因家族成员间高度保守或高度重复的序列，因为这些序列可能导致非特异性杂交，从而增加背景染色。富含GC的探针会限制地高辛标记的尿苷三磷酸（digoxigenin-rUTP）的掺入，而DNA模板序列中连续的T残基会因洋地黄毒苷分子之间的空间位阻而限制dig-UTP的掺入。探针长度可在300 bp至1 kb范围内选择。但只要满足上述条件，通常较长的探针具有更高的特异性活性。
   2. PCR 的模板可以是质粒克隆、基因组克隆或基因组 DNA。通常我们购买全长 EST 克隆 （例如来自 ATCC 或 Open Biosystems） 用作PCR模板。使用标准PCR程序扩增模板DNA，以获得包含启动子序列的PCR产物。为了制备足量的探针模板以支持多次探针合成反应，我们通常设置8个平行反应 50μl PCR反应。将这....

讨论

本实验方案中所述方法借鉴了多种不同来源的技术，并针对E8.5至E11.5天龄的小鼠胚胎整体标本进行了优化。in situ杂交技术用于脊椎动物胚胎的整体标本检测，最早于20世纪90年代初期出现^2,5-12。本方案主要借鉴了非洲爪蟾（Xenopus）胚胎^7,8以及小鼠胚胎^2,11的相关方法。在本方案中，特别强调对探针进行严格的质量评估。根据本方案的初始步骤，仔细制备高质量、高特异性活性的RNA探针，将显著提高实验数据的质量，并从长远来看节省大量时间和精力。本方案还包括使用PCR扩增生成的DNA模板，用于噬菌体RNA聚合酶的体外转录。该方法快速且具有高度可扩展性，适用于大规模in situ杂交筛选中大量RNA探针的制备^13-15。

当背景信号较高而特异性信号较低时，应考虑本方案中的多个步骤。首先需关注探针本身。只要RNA探针符合本方案中规定的设计标准，并通过全部三项质量控制检测（产量、比活性和探针长度），我们从未遇到过高背景的问题。另一个影响背景水平的因素是探针渗透.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
地高辛-11-尿苷-5’-三磷酸	试剂	Roche Group	11209256910
核糖核苷三磷酸混合物	试剂	Roche Group	11277057001
用于放射性标记RNA纯化的快速旋转柱	耗材	Roche Group	11274015001
T7 RNA聚合酶	试剂	Roche Group	10881767001
SP6 RNA聚合酶	试剂	Roche Group	10810274001
T3 RNA聚合酶	试剂	Roche Group	11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi	试剂	PerkinElmer, Inc.	BLU008X250UC
重组DNase I，无RNase	试剂	Roche Group	4716728001
尿素，无色至白色晶体或结晶性粉末	试剂	Fisher Scientific	BP169-500
凝胶上样缓冲液	试剂	Ambion	AM8547
Hybond-N+, Amersham	耗材	GE Healthcare	RPN82B
UV Stratalinker 2400	设备	Stratagene, Agilent Technologies
焦碳酸二乙酯	试剂	Sigma-Aldrich	D5758-100ML
肝素钠	试剂	Acros Organics	41121-0010
30% 水溶液过氧化氢	试剂	Fisher Scientific	BP2633-500
戊二醛，8% 电镜级	试剂	Polysciences, Inc.	0/710	请按照制造商’的说明谨慎使用
封闭试剂	试剂	Roche Group	11096176001	配制成5%储存液，于-20°C保存
蛋白酶K	试剂	Roche Group	3115852001
RNase A	试剂	Roche Group	10109142001	配制成10 mg/ml储存液，于-20°C保存。
RNase T1	试剂	Roche Group	10109193001
超纯甲酰胺	试剂	Invitrogen	15515-026
盐酸左旋咪唑	试剂	ICN Biomedicals	155228
来自酿酒酵母的核糖核酸，VI型	试剂	Sigma-Aldrich	R6625	经多次苯酚/氯仿抽提并沉淀，重悬于DEPC处理的去离子水中，于-20°C保存
抗地高辛-碱性磷酸酶Fab片段	试剂	Roche Group	11093274910
BM Purple AP底物（沉淀型），即用型溶液	试剂	Roche Group	11 442 074 001
4 mL透明闭口储存瓶便捷套装	耗材	National Scientific Company	B7800-2
Shake N Bake杂交炉	设备	Boekel Scientific	136400
Biopsy Sure-Tek活检盒	耗材	Fisher Scientific	15-200-402C
Paraplast Plus组织包埋介质	试剂	Fisher Scientific	23-021-400
Peel-A-Way一次性塑料组织包埋模具	耗材	Polysciences, Inc.	18646A
Colorfrost Plus显微镜载玻片	耗材	Fisher Scientific	12-550-17
核固红	试剂	Sigma-Aldrich	N8002
Cytoseal 60	试剂	Richard-Allan Scientific	8310-16