利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

摘要

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。

摘要

目前用于肿瘤成像的技术，如超声、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和计算机断层扫描（CT），均无法提供高分辨率图像，因而难以在显微水平上评估纳米颗粒在肿瘤中的摄取情况^1,2,3,，这凸显了建立合适异种移植模型以进行详细摄取分析的重要性。本文中，我们采用高分辨率活体成像技术，在一种改良的无壳鸡胚模型中评估纳米颗粒在人源肿瘤异种移植模型中的摄取情况。该鸡胚模型特别适用于此类体内分析，因其可支持人类肿瘤的生长，成本相对较低，且无需麻醉或手术操作4,5。将肿瘤细胞植入绒毛尿囊膜（CAM）后，可在7天内形成完全血管化的异种移植瘤⁶。所形成的肿瘤可通过无创、实时、高分辨率成像进行观察，且该成像过程可持续长达72小时，对宿主及肿瘤系统均影响甚微。可通过成像观察并定量分析经远端给药、具有不同尺寸和配方的纳米颗粒在血液循环中的流动、从渗漏的肿瘤血管外渗并最终在肿瘤部位富集的过程。本文描述了来源于豇豆花叶病毒（CPMV）并修饰有近红外荧光染料和/或聚乙二醇聚合物（PEG）的纳米颗粒的分析方法^{7, 8, 9,10,11}。静脉注射后，这些病毒性纳米颗粒可迅速被内皮细胞内化，从而实现对肿瘤内外血管系统的整体标记^7,12。对病毒性纳米颗粒进行PEG化修饰可延长其血浆半衰期，增加其在循环系统中的滞留时间，并最终通过增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）提高其在肿瘤组织中的富集程度^{7, 10,11}。利用图像分析软件，可随时间动态测量纳米颗粒在肿瘤中富集的速度和程度。该技术为可视化和定量分析纳米颗粒在人源肿瘤中的动态行为提供了一种有效方法。

方案

1. 将肿瘤接种至禽类胚胎尿囊膜

1. 按照文献⁸所述方法制备去壳的受精鸡胚。
2. 在胚胎发育第9天，使用一根18号针头连接1 mL注射器组装微型注射器。剪取一段5–6英寸的Tygon管（内径1/32英寸，外径3/32英寸，壁厚1/32英寸），小心将针头斜面插入管中，使管子从针尖端延伸出约4–5英寸（图1a）。
3. 用细胞悬液填充注射器和管路。然后在管路末端插入玻璃微量注射针，小心排除所有气泡。
4. 在解剖显微镜（配备照明光源）下，将10,000–100,000个癌细胞以团块形式注射到第9天的鸡胚尿囊膜（CAM）内（图1b，图1c）。缓慢注射细胞，并仔细确保针头位置正确，使细胞在CAM内形成可见的团块。若细胞滴落在CAM表面，可用Kimwipe或其他涂抹工具清除。
5. 将鸡胚放回38°C、湿度60%的加湿培养箱中继续孵育，使肿瘤生长并形成血管（最长可达7天）。

2. 纳米颗粒的制备

1. 为准备用于注射到鸡胚中的荧光标记CPMV纳米颗粒；将病毒纳米颗粒（按文献⁸方法合成）用pH 7.4的PBS稀释至浓度为100 μg/ml。使用前充分涡旋混匀，并离心一分钟以去除任何聚集体。根据偶联物种类及聚集程度，超声处理也可能有助于分散。荧光标记的CPMV储存液在4°C避光保存时至少可稳定一年。定期检查储存液：取少量滴加于玻片上，观察其荧光情况。也可使用透射电子显微镜（TEM）检测偶联后颗粒是否保持完整。
2. 简而言之，可将一微克病毒纳米颗粒（终体积2 μl）加至铜网涂层载网上。随后加入等体积的2%醋酸铀酰溶液，染色1分钟，然后在电子显微镜（Philips EM 410）下观察。

3. 荧光标记病毒纳米颗粒的静脉注射

1. 第16天，按照上述方法组装显微注射仪。通过导管将所需体积的病毒纳米颗粒吸入注射器中（> 200 μL）。仔细去除所有气泡。在导管末端安装显微注射玻璃针。确保针头尽可能细长且呈锥形（图2a）。若针头过于钝，则无法刺穿外胚层，导致无法进入血管；若针头过于尖锐，则在穿透组织时针尖易塌陷。
2. 在荷瘤胚胎中，远离目标成像部位的位置，静脉注射100 μl浓度为1 mg/ml的荧光素葡聚糖（分子量70,000 Da，Invitrogen）。成功插入CAM静脉的标志是注射流经路径上的血液变得清晰透明（图2b）。注射后1小时评估血管渗漏情况。
3. 在已出现血管渗漏的荷瘤胚胎中，远离目标成像部位的位置，静脉注射50 μl浓度为1 mg/ml的CPMV-Alexa Fluor 647（CPMV-AF 647）或聚乙二醇化CPMV-Alexa Fluor 647（CPMV-PEG-AF 647）溶液。
4. 使用配备Yokogawa转盘共聚焦系统和Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD相机的Zeiss Examiner Z1正置显微镜，在注射后立即及每小时对肿瘤进行成像。

4. 活体实时成像

1. 组装胚胎成像装置时，在胚胎成像装置盖子底面成像孔的周围涂抹一层薄薄的真空脂，并将18 mm的玻璃盖玻片安装到该孔上。
2. 调整胚胎位置，使盖玻片能够覆盖所需的成像区域。缓慢放下盖子，直至盖玻片刚好接触胚胎，然后将盖子旋紧固定在装置上（图2c）。
3. 将加热至37°C的水加入胚胎成像装置中，但避免浸没含有胚胎的培养皿，然后将整个装置放置于直立式共聚焦显微镜的载物台上，同时确保内部环境培养室已平衡至37°C。
4. 将含有胚胎的成像装置置于转盘共聚焦荧光显微镜下进行观察（图2e）。该成像装置可固定胚胎位置并保持视野稳定，从而实现三维Z轴扫描和延时成像。我们使用Perkin Elmer公司（前身为Improvision）的Volocity软件包获取并分析三维延时图像（图3a）。通过采集肿瘤及其周围血管系统的高分辨率三维图像，可在特定时间点进行详细的结构分析。定期采集三维图像序列，以追踪肿瘤血管系统的精细结构变化。注射后每小时对肿瘤进行一次成像。
5. 使用图像定量分析软件（如Perkin Elmer公司的Volocity）计算肿瘤区域或间质区域（非肿瘤区域）内选定区域的平均Alexa Fluor（AF）647信号强度，以定量分析病毒纳米颗粒的摄取情况。肿瘤与间质的比值通过将肿瘤区域的平均AF 647信号除以间质区域的平均AF 647信号获得。若肿瘤/间质比值大于1，则表明纳米颗粒正在被肿瘤组织摄取。

5. 代表性结果：

在本示例中，我们将HT-29结肠癌细胞注入第9天鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）中，形成直径约1 mm的瘤体（图1b）。接种后，将鸡胚置于湿润培养箱中继续培养7天，以促进肿瘤充分生长和血管化（图1c）。通过静脉注射低分子量葡聚糖以确认肿瘤血管化情况，并在Zeiss AxioExaminer Z1直立显微镜下观察肿瘤（图2d）。

静脉注射CPMV-AF 647或CPMV-PEG-AF 647纳米颗粒后（图3a和3b），高分辨率实时共聚焦成像（图2e）显示，CPMV和CPMV-PEG纳米颗粒均能快速标记整个血管系统，但在注射12小时后，CPMV-PEG在肿瘤中的摄取量约为CPMV的3倍（图3a）。采用图像分析软件（Perkin Elmer公司的Volocity）测定纳米颗粒在肿瘤中的相对摄取量。在肿瘤内部及外部（间质区）选择感兴趣区域，并测定各区域的平均荧光强度。数据以肿瘤/间质比值表示。

图1. 将肿瘤微注射至禽类胚胎的尿囊膜（CAM）中。（a）微注射装置按所示组件组装而成。（b）第9天的禽类胚胎，其尿囊膜已扩展至覆盖整个表面，此时可接种肿瘤。（c）至第16天，肿瘤直径可达1 cm（虚线所示），可进行纳米颗粒注射。

图 2. 纳米颗粒注射与活体成像。（a）在解剖显微镜下进行注射，显示微注射针尖端即将插入鸡胚尿囊膜（CAM）静脉；（b）微注射针已插入静脉（箭头所示），纳米颗粒被注入血流（可见血液变澄清）。（c）成像装置，其中禽类胚胎的盖玻片直接与CAM接触。（d）在注射纳米颗粒前，通过荧光素葡聚糖注射后进行活体成像评估肿瘤血管化情况。（e）将胚胎置于成像装置中，并放置在设定为37°C恒温环境内的直立共聚焦显微镜载物台上。

图3. 人类肿瘤中纳米颗粒摄取的活体可视化。在注射（a）CPMV-AF647 和（b）CPMV-PEG-AF647 后7小时对肿瘤进行成像。d) 从禽类胚胎中切除肿瘤以进行后续分析。

讨论

禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）是评估人类肿瘤血管动力学和药代动力学的有用模型。CAM的结构和位置便于获取高质量图像，并可在无需侵入性外科手术的情况下容纳多种类型的癌组织异种移植。此外，植入绒毛尿囊膜的癌组织异种移植物在7天内即可实现血管化，为评估纳米颗粒在肿瘤组织中的富集提供了一种快速、经济且半高通量的方法。由于植入无壳鸡胚CAM中的癌组织异种移植物可被直立式落射荧光显微镜或共聚焦显微镜的高分辨率光学系统清晰观察，因此可方便地获得有关纳米颗粒在肿瘤血管中摄取的时空信息。在此模型中，癌组织异种移植物倾向于沿CAM横向生长，形成的肿瘤体积较大，但厚度通常小于200 µm。这使其特别适合活体成像，因为标准的落射荧光显微镜能够有效穿透整个肿瘤组织。相比之下，植入小鼠浅表或原位部位的肿瘤则呈三维增殖，使得通过非侵入性技术难以准确定位深部肿瘤组织中的纳米颗粒。我们已利用该模型评估了量子点、脂质体以及氧化铁纳米颗粒在多种人类肿瘤异种移植物中的摄取情况，凸显了该模型在体内分析多种纳米颗粒制剂方面的广泛应用潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
受精的来航鸡鸡蛋	弗雷孵化场，圣雅各布斯	N/A
Dremel 旋转工具	Dremel		可使用任何型号
Dremel 切割片编号 36	Dremel	409
运动员孵化器	贝里山	1550HA
运动型培养箱	贝里山	1502EA
乙醇			70%（体积/体积）
聚苯乙烯称量舟	VWR 国际公司	12577-01
方形培养皿	Simport	25378-115
带盖橡胶材质的乐柏美（Rubbermaid）容器	Guillevin	RH3-228-00-BLU	在侧面钻出的孔
垂直式移液器拉制仪	David Kopf Instruments	model 720	设置：16.3（加热器）和2.3（电磁阀）
钠硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Co.	BF100-58-10	（外径，1.0 毫米；内径 0.58 毫米；10 厘米） 长度
1X 达尔伯克’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	Invitrogen	11995073
杜尔贝科’s	Invitrogen	14190250	pH 7.4
磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1×），液体
0.05% (1X) 含 EDTA 4Na 液体胰蛋白酶	Invitrogen	25300054
胎牛血清	Invitrogen	12483-020	热灭活
血细胞计数板	豪泽科学	15170-090
离心	Eppendorf	5811 000.010
精细尖头镊子	VWR 国际公司	25607-856
Tygon R-3603 管路	VWR 国际公司	63009-983	50 英尺（内径 1/32 英寸，外径 3/32 英寸，壁厚 1/32 英寸）
用于注射的皮下注射针头，18号针头	BD 生物科学	305195	100个装的一盒
用于注射的1 ml注射器	BD 生物科学	309602	100 个装的一盒
光纤显微镜照明器	Amscope	HL250-AY	150W
Kimwipe纸巾	VWR 国际	10805-905
V. unguiculata 种子（加州黑眼5号）	勃起	51771A
室内种植灯	SunLite，园丁’s 供应
甲基-PEO4-NHS酯	Pierce，Thermo Scientific	PI22341
mPEG-NHS，聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，分子量 2000	NANOCS	PEG1-0002
Alexa Fluor 647 羧酸（琥珀酰亚胺酯）	Invitrogen	A20006
俄勒冈绿488琥珀酰亚胺酯 * 6-异构体 *	Invitrogen	O-6149
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	379980	K2HPO4（用于磷酸盐缓冲液）
磷酸二氢钾		P5655	KH2PO4（用于磷酸盐缓冲液）
Superose 6 尺寸排阻柱	GE Healthcare	17-0673-01
ÄKTA Explorer 100 色谱仪	GE Healthcare	WS-AKTA100
ÄKTA 高流量套件	GE Healthcare	18-1154-85
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
超速离心机	贝克曼库尔特公司
SW 28 Ti 转子	贝克曼库尔特公司	342204	摆动吊篮
50.2 Ti 转子	贝克曼库尔特公司	337901	固定角度
Amicon Ultra-15 离心滤过装置	EMD Millipore	UFC910008	100 kDa 截留分子量
梯度生成器	伯乐（Bio-Rad）
葡聚糖，荧光素，70,000 分子量，阴离子	Invitrogen	D1823
转盘共聚焦荧光显微镜	Quorum Technologies	N/A
落射荧光宽场显微镜	群体感应；蔡司 Axio Examiner，蔡司	N/A
滨松 ImagEM 9100-12 EM-CCD 相机	群体感应；滨松	N/A
显微镜用温控培养箱	精密塑料	N/A
真空润滑脂	VWR 国际公司	59344-055
圆形玻璃盖玻片1号（18 mm）	VWR 国际公司	16004-300
Volocity 软件	珀金埃尔默股份有限公司
鸡胚包埋		定制加工
精细剪刀	VWR 国际公司	25608-203
甲醛	BioShop Canada	FOR201.500	在通风橱中使用
最佳切割	Fisher Scientific	1437365
温度（OCT）
塑料模具	Fisher Scientific	22-038217
VWR VistaVision HistoBond 黏附载玻片	VWR 国际公司	16004-406
延长 DAPI 的金染色时间	Invitrogen	P36931
冷冻切片机用一次性刀片	Fisher Scientific	12-634-2
冷冻切片机	徕卡显微系统	14047033518