本研究描述了使用便携式实时逆转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）系统对野生鸟类中的禽流感进行诊断。该方法利用冻干试剂，可在非实验室环境下对野生鸟类进行筛查，适用于疫情暴发时的典型现场情况。分子检测工具可为快速诊断提供准确且灵敏的替代方案。
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摘要
摘要
野生鸟类被认为与H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）的传播有关，因此需在候鸟迁徙路线上开展监测。对野生鸟类进行禽流感病毒（AIV）采样通常在偏远地区进行，但由于需要将样本运送至具备分子检测条件的实验室，检测结果往往存在延迟。实时反转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）是一种分子技术，可提供最为准确和敏感的AIV诊断方法之一。过去严格依赖实验室环境的rRT-PCR操作流程，目前正逐步适应野外现场应用。冻干（lyophilized）试剂的开发实现了无需冷链运输且灵敏度与液态试剂相当，使在偏远现场开展检测成为切实可行的目标。
本文介绍一种利用便携式实时逆转录聚合酶链式反应仪（Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device 或 RAPID，Idaho Technologies，美国犹他州盐湖城）结合冻干试剂（Influenza A Target 1 Taqman；ASAY-ASY-0109，Idaho Technologies）对野生鸟类中的禽流感病毒（AIV）进行快速诊断的方法。该试剂预混了单管中检测所需的所有组分，包括引物、探针、酶、缓冲液及内参阳性对照，且浓度适当，避免了液态试剂因储存或操作不当而引起的误差。该便携设备通过靶向基质基因对A型流感病毒进行筛查，可在2至3小时内获得结果。此外，利用靶向血凝素基因的H5和H7引物组，还可实现病毒的基因亚型鉴定。
该系统适用于检测从野生鸟类采集的泄殖腔和咽部样本，本文以在美国加利福尼亚州北部捕获的迁徙性滨鸟——西部沙锥（Calidris mauri）为例进行了演示。动物操作遵循美国地质调查局西部生态研究中心动物护理与使用委员会批准的方案，并获得美国地质调查局鸟类环志实验室的许可。该技术的主要优势在于能够加快对野生鸟类的诊断速度，从而提高在偏远地区控制疫情暴发的可能性。现场诊断还有助于识别和研究野生种群中的感染个体。获取有关宿主生物学（宿主对感染的免疫和生理反应）和空间生态学（感染鸟类的迁徙表现）的信息，将有助于深入了解野生鸟类在长距离传播禽流感病毒（AIV）方面所能发挥的媒介作用。
方案
1. 使用雾网捕捉野生鸟类
- 在涉禽捕获过程中，应在活跃的觅食地点（如沼泽、海岸线或泥滩）设置雾网。
- 将雾网一端的缠绕线环套入杆子，并将杆子垂直插入泥中。
- 拉直网体，将第二根杆子穿过雾网另一端的缠绕线环，并将其垂直插入泥中，确保缠绕线拉紧。
- 一旦鸟类被捕获，应从网中取出鸟类并返回环志工作站。
2. 泄殖腔拭子采样
- 捕获后立即采集泄殖腔拭子
- 找到泄殖腔，并用手指轻轻拨开周围的羽毛
- 从柄端打开无菌的 dacron 或聚酯纤维头拭子，用无菌病毒运送培养基润湿拭子头部，以便更顺利地进行采样。润湿后，将拭子头部轻轻插入泄殖腔内，缓慢旋转拭子以擦拭泄殖腔内壁，然后将拭子取出
- 将拭子头部直接插入病毒运送培养基样本管中，在培养基内用拇指和食指旋转拭子杆。请助手协助，将拭子头部从管底向上拉出约 1 cm，用剪刀剪断拭子杆，使拭子头部保留在管内，而杆部不会妨碍盖紧管盖。盖紧管盖。每次剪断拭子杆后，均需用酒精对剪刀进行消毒
- 将样本管放入含有干冰或冰袋的冷冻盒中
3. 口咽拭子采样
- 轻轻打开鸟喙，使腭裂可见
- 从包装中取出一支洁净的采样拭子，先取出杆部一端，并用病毒转运培养基润湿拭子尖端，以便....
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讨论
本文介绍的快速诊断方法可实现对野生鸟类样本的高效、准确检测，适用于禽流感病毒（AIV）监测。 便携式实时逆转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）对样本储存条件的要求大大降低，适用于偏远地区，在无法获得液氮运输罐或干冰而难以维持冷链的情况下尤为适用。此外，我们发现使用冻干试剂进行样本分析操作简便，即使缺乏实验室分子检测经验的野外生物学家也能完成。该技术不仅高效省时，而且成本效益高。在单人操作下，每天在野外环境中可完成三批次检测，共计42个AIV样本筛查。我们认为，运行该系统所需的所有材料均可携带至任何地点，并可在一天内完成对操作人员的技术培训。在偏远野外环境中，主要限制因素是便携式rRT-PCR仪及配套计算机所需的电源供应；然而，使用稳压便携式发电机可缓解这一问题。此外，提取RNA或原始样本的测序仅在能够暂时维持冷链直至样本送抵实验室的情况下才可行。
我们先前的分析表明，便携式rRT-PCR设备在特异性（100%）方面与实验室环境下的病毒分离法完全一致，敏感性（98%）也相当2。既往的验证研究显示，rRT-PCR最常见的错误是假阴性结果，其主要原因包括样本制备不当、粪便样本中存在P.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢爱达荷技术公司的 M. Scullion 和 R. Crisp 提供的技术支持，以及美国地质调查局西部生态研究中心提供的资金（S. Schwarzbach）和协助（K. Spragens、T. Graham）。本研究在美国创新技术中心—国防与国土安全研究所（www.idhs.org）的主持下进行，旨在支持美国国防部和空军研究实验室。动物操作遵循美国地质调查局西部生态研究中心动物护理与使用委员会批准的方案，以及美国地质调查局鸟类环志实验室的许可。本出版物中提及的任何贸易、产品或公司名称仅用于描述性目的，并不意味着美国政府对此表示认可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNeasy mini 离心柱 | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit 包含组分 |
| 收集管（1.5 &和 2 mL） | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit 包含组分 |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit 中包含 |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit 包含组分 |
| 缓冲液 RPE | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit 包含组分 |
| 无RNase水 | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini 试剂盒包含组分 |
| 14.3 M β-巯基–乙醇溶液 | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% 乙醇 | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2，120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman 流感病毒 A 型靶标 1（水解探针） | 爱达荷科技 | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20 ml 封口毛细管 | 罗氏集团 | 04929292001 | |
| 配备2 ml离心管转子的微型离心机 | 爱达荷科技 | 包含在 RAPID 试剂盒中 | |
| 坚固型高级病原体识别装置（RAPID）7200 | 爱达荷科技 | 包含在 RAPID 试剂盒中 | |
| 基于 Pentium 的笔记本电脑，配备 Windows XP Professional | 爱达荷科技 | 包含在 RAPID 试剂盒中 | |
| Lightcycler 数据分析软件 | 爱达荷科技公司 | 包含在 RAPID 试剂盒中 |
参考文献
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
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