本实验将展示如何对艾滋病病毒阳性患者外周血中易位的细菌种类进行测序分析。
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摘要
摘要
健康的胃肠道在生理状态下定植有大量共生微生物，这些微生物影响着体液和细胞黏膜免疫系统的发育1,2。
肠道菌群通过强大的黏膜屏障受到免疫系统的保护。已知感染和抗生素会改变正常的胃肠道屏障以及定植菌群的组成，这可能导致潜在的免疫异常3。
HIV 会导致胃肠道屏障受损，伴随黏膜免疫功能进行性衰竭，以及细菌生物产物（如脂多糖和细菌 DNA 片段）漏入全身循环，从而引发全身性免疫激活4-7。微生物易位参与了 HIV/AIDS 的免疫病理发生过程以及对治疗的反应4,8。
我们旨在表征 HIV 感染患者外周血中易位细菌的组成。为实现这一目标，我们建立了一种针对泛细菌 16S 核糖体基因的 PCR 反应，随后进行测序分析。
简而言之，使用来自HIV感染患者和健康受试者的全血。由于健康个体具有正常的肠道稳态，因此在这些患者中不应出现微生物群的易位。通过静脉穿刺采集全血并分离血浆后，从血浆中提取DNA，并用于进行针对泛细菌16S核糖体基因的广谱PCR反应9。PCR产物经纯化后，进行克隆和测序分析。
方案
处理HIV感染的血液样本需遵循一些重要建议。
所有血液标本必须置于坚固、防漏的容器中运输。采集标本时应小心操作，避免标本容器外部及随附文件受到污染。
所有处理感染性血液的人员必须佩戴手套。标本处理完成后，必须更换手套并洗手。
HIV感染的血液样本必须在II级生物安全柜中进行操作。
应使用机械移液辅助装置。
针头或其他锐器（包括玻璃制品，如移液管或毛细管）的使用应仅限于无其他替代方法的情况。
发生血液溢洒后，以及工作结束时，实验室台面必须使用适当的化学消毒剂进行去污染处理。
使用过的污染材料在重复使用前必须去污染，或通过医疗废物途径正确处置。
任何职业性接触潜在感染性血液或体液的事件（即需要采取普遍预防措施的情况）均应视为医疗紧急情况，必须及时采取干预措施以确保有效性。
该方案的完成需要5天时间。具体时间安排详见图1。
细菌种类的鉴定采用图2中所述的方法。
1. 样品采集
- 采集9 ml全血至含EDTA的试管中。
- 试管在室温下以2000 rpm离心10分钟，以获取血浆。
- 将血浆收集至无菌的2 ml Eppendorf管中。
2. 血浆样本中DNA的提取
- 对超净台、移液器及实验所需材料进行充分消毒，以确保无菌环境。
- 将所有材料置于紫外灯下照射至少30分钟。
- 使用消毒剂擦拭手套。
- 将几张纸巾浸入乙醇后放置于超净台内，每次丢弃枪头时，均需将移液器在湿润的纸巾上擦拭。
使用商品化试剂盒按照制造商说明书提取DNA（Easy-DNA试剂盒，Invitrogen，Carlsbad CA，USA）。
- 将 350 μL 血浆置于无菌的 2 ml 离心管中。
- 使用 350 μL 过滤的超纯水作为阴性对照。
- 向样品中加入 10 μL 溶菌酶（1 mg/ml）。
- 在 37°C 下孵育 30 分钟。
- 向样品中加入 500 μL 裂解液，并轻轻混匀。
- 在 65°C 下孵育 7 分钟。
- 向样品中加入 900 μL 氯仿。
- 剧烈涡旋振荡，直至样品呈现均匀的黏稠状态。
- 加入 200 μL 沉淀液，并剧烈涡旋振荡。
- 在室温下以 10500 rpm 离心 10 分钟，使相分离并形成界面。
- 将上层水相转移至含有 1 ml 100% 乙醇的新鲜微量离心管中。
- 在 4°C 下以 10500 rpm 离心 10 分钟。
- 去除乙醇。
- 加入 1 ml 70% 乙醇。
- 在 4°C 下以最大转速离心 10 分钟。
- 去除乙醇，残留的乙醇应用移液器彻底吸除。
- 将沉淀物重悬于 50 μL 超纯水中。
- 使用分光光度计测定 DNA 浓度。
3. 16S rRNA 基因 PCR
PCR 扩增按先前所述方法进行9。
- 在100 μL反应体系中扩增DNA，反应体系包含10 μL 10X PCR缓冲液、5 μL 25 mM MgCl2、5 μL 2 mM总dNTPs、1 μL 50 μM引物RW01（AACTGGAGGAAGGTGGGGAT）、1 μL 50 μM引物DG74（AGGAGGTGATCCAACCGCA）、34 μL H2O和0.5 μL Taq聚合酶（AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）。
- 将PCR混合液转移至滤器中，以避免细菌Taq聚合酶可能造成的污染。
- 将滤器（Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA）在4°C下以500 rcf离心30分钟。
- 根据需要扩增的样本数量（阳性与阴性PCR对照、样本及提取用水）分装PCR混合液。
- 采用以下热循环条件：94°C预变性10分钟；94°C、55°C和72°C各1分钟，共40个循环；最后72°C延伸10分钟。
- 在2%琼脂糖凝胶上检测PCR产物，使用100 bp DNA Marker，PCR产物大小约为360 bp（图3）。
4. PCR 产物纯化
仅应纯化PCR检测呈阳性的样本。纯化步骤使用商业试剂盒并按照制造商说明书进行（PureLink PCR microkit，Invitrogen，Carlsbad CA，USA）。
- 每1体积PCR产物加入4体积含异丙醇的结合缓冲液。
- 将含结合缓冲液的PCR产物转移至离心柱中。
- 室温下以10000 rcf离心1分钟。
- 用含乙醇的洗涤缓冲液洗涤离心柱。
- 室温下以10000 rcf离心1分钟。
- 室温下以最大转速离心1分钟，以干燥硅胶膜并彻底去除残留的含乙醇洗涤缓冲液。
- 加入10 μL超纯水。
- 室温孵育1分钟。
- 室温下以最大转速离心2分钟，收集纯化的DNA。
5. 克隆
LB 培养基平板的制备
- 将25克LB培养基粉末溶解于约800毫升水中。
- 加水定容至1升。
- 加入15克Bacto琼脂。
- 高压灭菌20分钟。
- 灭菌后，用力摇动烧瓶中的溶液，使琼脂充分混匀。
- 将溶液冷却至50°C。
- 加入氨苄青霉素（50 μg/ml），摇动至完全溶解。
- 倒平板，琼脂厚度约为3毫米。
- 将平板置于室温下晾干。
- 在每块LB平板表面均匀涂布X-Gal（40 mg/ml）和IPTG（100 mM），于37°C孵育至可使用状态。
感受态细胞转化
转化采用商业试剂盒并按照制造商说明书进行（Topo TA 克隆试剂盒，Invitrogen，Carlsbad CA，USA）。
- 准备连接反应体系（1–4 μL 新鲜 PCR 产物、1 μL 盐溶液、1 μL 载体，必要时加水）。
- 轻轻混匀反应体系，在室温下孵育 5–10 分钟。
- 将反应体系置于冰上。
- 取 2 μL 连接反应产物加入感受态细胞小管中，轻轻混匀。
- 在冰上孵育 30 分钟。
- 在 42°C 下热激 30 秒。
- 立即将小管转移至冰上。
- 加入 250 μL 培养基。
- 盖紧管盖，在 37°C 下水平摇动培养 1 小时。
- 取每种转化产物 50 μL 涂布于预热的选择性平板上。
- 在 37°C 下过夜培养。
孵育后，平板上会形成白色和蓝色菌落。白色菌落表示含有PCR产物插入，蓝色菌落表示无PCR产物插入。
6. 测序分析
测序反应
- 使用以下试剂配制混合液：2,5 μl DNA，1 μl 引物（5pmol/μl），1,1 μl BigDye（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA）。
- 热循环仪反应条件：96°C 预变性 1 分钟；96°C 变性 10 秒、55°C 退火 15 秒、60°C 延伸 4 分钟，共 25 个循环。
柱纯化
- 每个反应准备一个 MicroSpin 柱（Qiagen，Milan，意大利）。
- 倒置柱子并涡旋震荡以混匀树脂。
- 折断柱子底部，将盖子松开 ¼ 圈，并将柱子放入一个微量离心管中。
- 以 3200 rpm 离心 1 分钟。
- 将柱子转移至一个新的洁净微量离心管中。
- 小心地将整个 PCR 测序反应液用移液器加入柱子中心。
- 以 3200 rpm 离心 1 分钟。
- 纯化的 DNA 将被洗脱至管中（20 μl 超纯水）。
测序分析
- 将纯化后的样品（20 μl）加入96孔板中。
- 将板放入测序仪中。自动DNA测序仪会生成四色色谱图，显示测序运行的结果。
- 将核苷酸序列作为查询序列比对公共序列数据库。该搜索在NCBI数据库和服务器上通过基本局部比对搜索工具（BLAST）进行。
- 仅考虑同源性为98-100%的细菌。
7. 代表性结果
图1. 实验流程时间线。
图2. 整个细菌鉴定流程的流程图。
图3. 2%琼脂糖凝胶显示广谱16S rRNA基因PCR产物。第1道为100 bp DNA Marker，第2道为PCR阳性对照，第3道为PCR阴性对照。第4道显示来自一名HIV阳性患者的样本，第5道为水对照。第6道显示来自一名健康个体的样本及阴性PCR反应；第7道为水对照。仅HIV阳性患者显示出阳性PCR扩增。在提取步骤中使用超纯水作为阴性对照，表明未发生污染。
图4. 0.7%琼脂糖凝胶，显示通过质粒小提程序提取的质粒。第1泳道含有1千碱基DNA Ladder，第2泳道为蓝色对照菌落，第3至第12泳道为白色菌落。来自蓝色菌落的质粒不含PCR产物插入片段，全部10个白色菌落均含有带正确插入片段的质粒。
图5. 显示了一例HIV阳性个体血浆中细菌测序分析的结果。我们的结果表明，HIV疾病中的微生物易位涉及多种微生物菌群，而在HIV阴性个体中未观察到该现象，提示肠道免疫在控制细菌易位方面存在显著功能障碍。
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讨论
本文展示了一种PCR/测序方案，用于表征HIV感染者外周血中细菌的移位情况。
使用含EDTA试管采集的血浆可获得最可靠的结果。采血后，应在2至3小时内通过离心分离血浆，以避免溶血和DNA片段降解。样本首先在-20°C下保存约5天，随后转移至-80°C保存。应避免反复冻融，以免导致细菌DNA损失。
血浆样本应在解冻后12小时内使用。
为了从供体的外周血中获得最大量的DNA，对DNA提取方案进行了优化。具体而言，使用血浆而非全血，因为全血中含有少量细菌DNA，且这些细菌DNA会被来自外周血细胞的大量DNA所掩盖。
我们有意将具有急性感染体征和/或症状的受试者排除在本研究之外。然而，考虑到与 HIV 相关的免疫抑制患者存在胃肠屏障功能受损及细菌产物易位现象，我们无法排除整个微生物的易位可能性。因此使用溶菌酶的理论依据在于：由于该酶可破坏细菌细胞壁，其使用能够促使极少量循环微生物释放细菌 DNA，而这些微生物的数量未必足以...
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致谢
我们感谢 Gianni Scimone 在视频制作方面提供的出色帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA 试剂盒 | Invitrogen | K 180001 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure 水 | Invitrogen | 10977049 | |
| 溶菌酶 | Fluka | 62970 | 10 μg/mL 蒸馏水中 |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystems | 26478701 | |
| Microcon 100 | EMD Millipore | 42413 | |
| PCR 引物 | Invitrogen | ||
| 琼脂糖 | Eppendorf | C1343 | |
| DNA Marker | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR 微量纯化试剂盒 | Invitrogen | K310050 | |
| LB 琼脂粉 | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| 氨苄青霉素 | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL 蒸馏水中 |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40 mg/mL DMF 中 |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100 mM 蒸馏水中 |
| Topo TA 克隆试剂盒 | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep 试剂盒 | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystems | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 离心柱试剂盒 | Qiagen | 63204 |
参考文献
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
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