外周血中细菌微生物群的测序：我们在HIV感染者中的经验

摘要

本实验将展示如何对艾滋病病毒阳性患者外周血中易位的细菌种类进行测序分析。

摘要

健康的胃肠道在生理状态下定植有大量共生微生物，这些微生物影响着体液和细胞黏膜免疫系统的发育^1,2。

肠道菌群通过强大的黏膜屏障受到免疫系统的保护。已知感染和抗生素会改变正常的胃肠道屏障以及定植菌群的组成，这可能导致潜在的免疫异常³。

HIV 会导致胃肠道屏障受损，伴随黏膜免疫功能进行性衰竭，以及细菌生物产物（如脂多糖和细菌 DNA 片段）漏入全身循环，从而引发全身性免疫激活^4-7。微生物易位参与了 HIV/AIDS 的免疫病理发生过程以及对治疗的反应^4,8。

我们旨在表征 HIV 感染患者外周血中易位细菌的组成。为实现这一目标，我们建立了一种针对泛细菌 16S 核糖体基因的 PCR 反应，随后进行测序分析。

简而言之，使用来自HIV感染患者和健康受试者的全血。由于健康个体具有正常的肠道稳态，因此在这些患者中不应出现微生物群的易位。通过静脉穿刺采集全血并分离血浆后，从血浆中提取DNA，并用于进行针对泛细菌16S核糖体基因的广谱PCR反应⁹。PCR产物经纯化后，进行克隆和测序分析。

方案

处理HIV感染的血液样本需遵循一些重要建议。
所有血液标本必须置于坚固、防漏的容器中运输。采集标本时应小心操作，避免标本容器外部及随附文件受到污染。
所有处理感染性血液的人员必须佩戴手套。完成标本处理后，必须更换手套并洗手。
HIV感染的血液样本处理必须在II级生物安全柜中进行。
应使用机械移液辅助装置。
针头或其他锐器（包括玻璃制品，如移液管或毛细管）的使用应仅限于无其他替代方法的情况。
发生血液溢出后以及工作结束时，实验室台面必须使用适当的化学消毒剂进行去污染处理。
使用过的污染材料在重复使用前必须去污染，或通过临床废弃物途径正确处置。
任何职业性接触潜在感染性血液或体液的事件（即需要采取普遍预防措施的情况）均应视为医疗紧急情况，必须立即采取干预措施以确保有效性。
该方案的完成需要5天时间。具体时间安排详见图1。
细菌种类的鉴定采用图2中描述的方法进行。

1. 样品采集

1. 将9 ml全血采集至含EDTA的试管中。
2. 试管在室温下以2000 rpm离心10分钟，以获取血浆。
3. 将血浆收集至无菌的2 ml Eppendorf管中。

2. 血浆样本中DNA的提取

讨论

本文展示了一种PCR/测序方案，用于表征HIV感染者外周血中细菌的移位情况。

使用含EDTA试管采集的血浆可获得最可靠的结果。采血后，应在2至3小时内通过离心分离血浆，以避免溶血和DNA片段降解。样本首先在-20°C下保存约5天，随后转移至-80°C保存。应避免反复冻融，以免导致细菌DNA损失。

血浆样本应在解冻后12小时内使用。

为了从供体的外周血中获得最大量的DNA，对DNA提取方案进行了优化。具体而言，使用血浆而非全血，因为全血中含有少量细菌DNA，且这些细菌DNA会被来自外周血细胞的大量DNA所掩盖。

我们有意将具有急性感染体征和/或症状的受试者排除在本研究之外。然而，考虑到与 HIV 相关的免疫抑制患者存在胃肠屏障功能受损及细菌产物易位现象，我们无法排除整个微生物的易位可能性。因此使用溶菌酶的理论依据在于：由于该酶可破坏细菌细胞壁，其使用能够促使极少量循环微生物释放细菌 DNA，而这些微生物的数量未必足以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Easty-DNA 试剂盒	Invitrogen	K 180001
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432
乙醇	Sigma-Aldrich	E7203
UltraPure 水	Invitrogen	10977049
溶菌酶	Fluka	62970	10 μg/mL 蒸馏水中
AmpliTaq Gold	Applied Biosystems	26478701
Microcon 100	EMD Millipore	42413
PCR 引物	Invitrogen
琼脂糖	Eppendorf	C1343
DNA Marker	Invitrogen	15628019
Purelink PCR 微量纯化试剂盒	Invitrogen	K310050
LB 琼脂粉	Invitrogen	22700025
Bactoagar	Invitrogen
氨苄青霉素	Invitrogen	11593027	10 mg/mL 蒸馏水中
X-gal	Invitrogen	15520034	40 mg/mL DMF 中
IPTG	Invitrogen	15529019	100 mM 蒸馏水中
Topo TA 克隆试剂盒	Invitrogen	K450002
Purelink Quick Plasmid Miniprep 试剂盒	Invitrogen	K210010
Big dye	Applied Biosystems	4337455
DyeEx 2.0 离心柱试剂盒	Qiagen	63204