外周血中细菌微生物群的测序：我们在HIV感染者中的经验

摘要

本实验将展示如何对艾滋病病毒阳性患者外周血中易位的细菌种类进行测序分析。

摘要

健康的胃肠道在生理状态下定植有大量共生微生物，这些微生物影响着体液和细胞黏膜免疫系统的发育^1,2。

肠道菌群通过强大的黏膜屏障受到免疫系统的保护。已知感染和抗生素会改变正常的胃肠道屏障以及定植菌群的组成，这可能导致潜在的免疫异常³。

HIV 会导致胃肠道屏障受损，伴随黏膜免疫功能进行性衰竭，以及细菌生物产物（如脂多糖和细菌 DNA 片段）漏入全身循环，从而引发全身性免疫激活^4-7。微生物易位参与了 HIV/AIDS 的免疫病理发生过程以及对治疗的反应^4,8。

我们旨在表征 HIV 感染患者外周血中易位细菌的组成。为实现这一目标，我们建立了一种针对泛细菌 16S 核糖体基因的 PCR 反应，随后进行测序分析。

简而言之，使用来自HIV感染患者和健康受试者的全血。由于健康个体具有正常的肠道稳态，因此在这些患者中不应出现微生物群的易位。通过静脉穿刺采集全血并分离血浆后，从血浆中提取DNA，并用于进行针对泛细菌16S核糖体基因的广谱PCR反应⁹。PCR产物经纯化后，进行克隆和测序分析。

方案

处理HIV感染的血液样本需遵循一些重要建议。
所有血液标本必须置于坚固、防漏的容器中运输。采集标本时应小心操作，避免标本容器外部及随附文件受到污染。
所有处理感染性血液的人员必须佩戴手套。完成标本处理后，必须更换手套并洗手。
HIV感染的血液样本处理必须在II级生物安全柜中进行。
应使用机械移液辅助装置。
针头或其他锐器（包括玻璃制品，如移液管或毛细管）的使用应仅限于无其他替代方法的情况。
发生血液溢出后以及工作结束时，实验室台面必须使用适当的化学消毒剂进行去污染处理。
使用过的污染材料在重复使用前必须去污染，或通过临床废弃物途径正确处置。
任何职业性接触潜在感染性血液或体液的事件（即需要采取普遍预防措施的情况）均应视为医疗紧急情况，必须立即采取干预措施以确保有效性。
该方案的完成需要5天时间。具体时间安排详见图1。
细菌种类的鉴定采用图2中描述的方法进行。

1. 样品采集

1. 将9 ml全血采集至含EDTA的试管中。
2. 试管在室温下以2000 rpm离心10分钟，以获取血浆。
3. 将血浆收集至无菌的2 ml Eppendorf管中。

2. 血浆样本中DNA的提取

1. 充分对超净台、移液器及实验所需材料进行消毒，以确保无菌状态。
2. 将所有材料置于紫外灯下照射至少30分钟。
3. 用消毒剂擦拭手套。
4. 将数张纸巾浸入乙醇后置于超净台内，每次丢弃枪头时，均用湿润的纸巾擦拭移液器。

使用商业试剂盒按照制造商说明书提取DNA（Easy-DNA试剂盒，Invitrogen，Carlsbad CA，美国）。

5. 将 350 μL 血浆置于无菌的 2 ml 离心管中。
6. 使用 350 μL 过滤后的超纯水作为阴性对照。
7. 向样品中加入 10 μL 溶菌酶（1 mg/ml）。
8. 在 37°C 下孵育 30 分钟。
9. 向样品中加入 500 μL 裂解液，并轻轻混匀。
10. 在 65°C 下孵育 7 分钟。
11. 向样品中加入 900 μL 氯仿。
12. 剧烈涡旋振荡，直至样品均匀黏稠。
13. 加入 200 μL 沉淀液，并剧烈涡旋振荡。
14. 在室温下以 10500 rpm 离心 10 分钟，使相分离并形成界面。
15. 将上层水相转移至含有 1 ml 100% 乙醇的新鲜微量离心管中。
16. 在 4°C 下以 10500 rpm 离心 10 分钟。
17. 移除乙醇。
18. 加入 1 ml 70% 乙醇。
19. 在 4°C 下以最大转速离心 10 分钟。
20. 移除乙醇，残留的乙醇应使用移液器彻底吸除。
21. 将沉淀物重悬于 50 μL 超纯水中。
22. 使用分光光度计测定 DNA 浓度。

3. 16S rRNA 基因 PCR

PCR 扩增按先前所述方法进行⁹。

1. 在100 μL反应体系中扩增DNA，反应体系包含：10 μL 10X PCR缓冲液、5 μL 25 mM MgCl2、5 μL 2 mM总dNTPs、1 μL 50 μM引物RW01（AACTGGAGGAAGGTGGGGAT）、1 μL 50 μM引物DG74（AGGAGGTGATCCAACCGCA）、34 μL H2O和0.5 μL Taq聚合酶（AmpliTaq Gold，Applied Biosystem，Foster City，CA，USA）。
2. 将PCR混合液转移至滤器中，以避免细菌Taq聚合酶可能造成的污染。
3. 将滤器（Microcon，Millipore，Billerica，MA，USA）在4°C下以500 rcf离心30分钟。
4. 根据需要扩增的样本数量（阳性与阴性PCR对照、样本及提取水）分装PCR混合液。
5. 采用以下热循环条件：94°C预变性10分钟；随后进行40个循环，每个循环依次为94°C 1分钟、55°C 1分钟、72°C 1分钟；最后72°C延伸10分钟。
6. 在2%琼脂糖凝胶上观察PCR产物，使用100 bp DNA Marker，PCR产物大小约为360 bp（图3）。

4. PCR 产物纯化

仅对PCR检测呈阳性的样本进行纯化。使用商品化试剂盒并按照制造商说明进行纯化（PureLink PCR microkit，Invitrogen，Carlsbad CA，USA）。

1. 每1体积PCR产物中加入4体积含异丙醇的结合缓冲液。
2. 将含结合缓冲液的PCR产物转移至纯化柱中。
3. 室温下，以10000 rcf离心1分钟。
4. 用含乙醇的洗涤缓冲液洗涤纯化柱。
5. 室温下，以10000 rcf离心1分钟。
6. 室温下，以最大转速离心1分钟，以干燥硅胶膜并去除残留的含乙醇洗涤缓冲液。
7. 加入10 μL超纯水。
8. 室温孵育1分钟。
9. 室温下，以最大转速离心2分钟，收集纯化的DNA。

5. 克隆

LB 培养基平板制备

1. 将25克LB培养基粉末溶解于约800毫升水中。
2. 加水至终体积为1升。
3. 加入15克Bacto琼脂。
4. 高压灭菌20分钟。
5. 灭菌后，用力摇动烧瓶中的溶液，使琼脂充分混匀。
6. 将溶液冷却至50°C。
7. 加入氨苄青霉素（50 μg/ml），摇动至完全溶解。
8. 倒制平板，琼脂厚度约为3毫米。
9. 将平板置于室温下放置。
10. 在每块LB平板表面涂布X-Gal（40 mg/ml）和IPTG（100 mM），37°C孵育至可使用为止。

感受态细胞转化

转化按照商品化试剂盒的说明书进行（Topo TA 克隆试剂盒，Invitrogen，Carlsbad CA，美国）。

1. 准备连接反应体系（1-4 μL 新鲜PCR产物、1 μL 盐溶液、1 μL 载体，必要时加水）。
2. 轻轻混匀反应液，在室温下孵育5-10分钟。
3. 将反应管置于冰上。
4. 取2 μL连接反应液加入感受态细胞小管中，轻轻混匀。
5. 在冰上孵育30分钟。
6. 在42°C下热激30秒。
7. 立即将离心管转移至冰上。
8. 加入250 μL培养基。
9. 盖紧管盖，在37°C下水平摇动培养1小时。
10. 取每种转化产物50 μL涂布于预热的选择性平板上。
11. 在37°C下过夜培养。

孵育后，平板上会形成白色和蓝色菌落。白色菌落表示成功插入PCR产物，为阳性；蓝色菌落表示未插入PCR产物，为阴性。

6. 测序分析

测序反应

1. 使用以下试剂配制混合液：2,5 μl DNA，1 μl 引物（5 pmol/μl），1,1 μl BigDye（Applied Biosystem，美国加利福尼亚州福斯特城）。
2. PCR 扩增条件：96°C 预变性 1 分钟；循环 25 次：96°C 变性 10 秒，55°C 退火 15 秒，60°C 延伸 4 分钟。

柱层析纯化

1. 每个反应准备一个 MicroSpin 柱（Qiagen，米兰，意大利）。
2. 将柱子倒置并涡旋以混匀树脂。
3. 折断柱子底部，将盖子松开 ¼ 圈，然后将柱子放入一个微量离心管中。
4. 以 3200 rpm 离心 1 分钟。
5. 将柱子转移至一个新的洁净微量离心管中。
6. 小心地将整个 PCR 测序反应液用移液器加至柱子中心。
7. 以 3200 rpm 离心 1 分钟。
8. 纯化的 DNA 将洗脱至管中（20 μl 超纯水）。

测序分析

1. 将纯化后的样品（20 μl）加入96孔板中。
2. 将板放入测序仪中。自动DNA测序仪会生成一个四色色谱图，显示测序运行的结果。
3. 将核苷酸序列作为查询序列比对公共序列数据库。该搜索在NCBI数据库和服务器上通过基本局部比对搜索工具（BLAST）进行。
4. 仅考虑同源性为98-100%的细菌。

7. 代表性结果

图1. 实验流程时间线。

图2. 细菌鉴定全过程的流程图。

图3. 2% 琼脂糖凝胶电泳显示广谱 16S rRNA 基因 PCR 扩增产物。第1道为100bp DNA marker，第2道为PCR阳性对照，第3道为PCR阴性对照。第4道显示来自一名HIV阳性患者的样本，第5道为水对照。第6道显示来自一名健康个体的样本及阴性PCR反应；第7道为水对照。仅HIV阳性患者的样本显示出PCR扩增阳性结果。在提取步骤中使用超纯水作为阴性对照，表明未发生污染。

图4. 0.7% 琼脂糖凝胶电泳显示通过质粒小提程序提取的质粒。第1道为1千碱基DNA标记物，第2道为蓝色对照菌落，第3至第12道为白色菌落。来自蓝色菌落的质粒不含PCR产物插入片段，所有10个白色菌落均含有带正确插入片段的质粒。

图 5. 显示了一名 HIV 阳性个体血浆中细菌测序分析的示例。我们的结果表明，HIV 疾病中的微生物易位涉及多种微生物菌群，而在 HIV 阴性个体中未观察到该现象，提示肠道免疫在控制细菌易位方面存在显著功能障碍。

讨论

本文展示了一种PCR/测序方案，用于表征HIV感染者外周血中细菌的移位情况。

使用含EDTA试管采集的血浆可获得最可靠的结果。采血后，应在2至3小时内通过离心分离血浆，以避免溶血和DNA片段降解。样本首先在-20°C下保存约5天，随后转移至-80°C保存。应避免反复冻融，以免导致细菌DNA损失。

血浆样本应在解冻后12小时内使用。

为了从供体的外周血中获得最大量的DNA，对DNA提取方案进行了优化。具体而言，使用血浆而非全血，因为全血中含有少量细菌DNA，且这些细菌DNA会被来自外周血细胞的大量DNA所掩盖。

我们有意将具有急性感染体征和/或症状的受试者排除在本研究之外。然而，考虑到与 HIV 相关的免疫抑制患者存在胃肠屏障功能受损及细菌产物易位现象，我们无法排除整个微生物的易位可能性。因此使用溶菌酶的理论依据在于：由于该酶可破坏细菌细胞壁，其使用能够促使极少量循环微生物释放细菌 DNA，而这些微生物的数量未必足以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Easty-DNA 试剂盒	Invitrogen	K 180001
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432
乙醇	Sigma-Aldrich	E7203
UltraPure 水	Invitrogen	10977049
溶菌酶	Fluka	62970	10 μg/mL 蒸馏水中
AmpliTaq Gold	Applied Biosystems	26478701
Microcon 100	EMD Millipore	42413
PCR 引物	Invitrogen
琼脂糖	Eppendorf	C1343
DNA Marker	Invitrogen	15628019
Purelink PCR 微量纯化试剂盒	Invitrogen	K310050
LB 琼脂粉	Invitrogen	22700025
Bactoagar	Invitrogen
氨苄青霉素	Invitrogen	11593027	10 mg/mL 蒸馏水中
X-gal	Invitrogen	15520034	40 mg/mL DMF 中
IPTG	Invitrogen	15529019	100 mM 蒸馏水中
Topo TA 克隆试剂盒	Invitrogen	K450002
Purelink Quick Plasmid Miniprep 试剂盒	Invitrogen	K210010
Big dye	Applied Biosystems	4337455
DyeEx 2.0 离心柱试剂盒	Qiagen	63204