阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一是形成淀粉样β蛋白阳性的神经炎性斑块。在本方案中，我们描述了两种在转基因AD模型小鼠中检测神经炎性斑块的方法：采用ABC与DAB法进行免疫组织化学检测，以及使用硫黄素S染色法进行荧光检测。
本文内容
摘要
摘要
阿尔茨海默病（AD）是最常见的导致痴呆的神经退行性疾病。神经炎性斑块的形成是阿尔茨海默病的病理学特征之一。神经炎性斑块的核心成分是一种称为淀粉样蛋白β（Aβ）的小型丝状蛋白1，它由β-淀粉样前体蛋白（APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶的连续蛋白水解切割产生。淀粉样蛋白假说认为，含有Aβ的斑块是AD病理过程中潜在的毒性机制2。死后对神经炎性斑块存在的分析可确认AD的诊断。为了进一步理解Aβ在AD发病机制中的神经生物学作用，研究人员构建了多种表达人类APP基因AD相关突变的小鼠品系。根据疾病严重程度的不同，这些小鼠会在不同年龄阶段出现神经炎性斑块。这些小鼠为研究发病机制以及可能影响APP加工通路和神经炎性斑块形成的药物开发提供了宝贵的工具。在本实验方案中，我们采用免疫组织化学方法特异性检测AD模型小鼠中的神经炎性斑块。我们将重点讨论从半脑组织提取、多聚甲醛固定、冷冻切片制备，以及两种在AD转基因小鼠中检测神经炎性斑块的方法：采用ABC和DAB法的免疫组织化学检测，以及使用硫黄素S染色法的荧光检测。
方案
1. 小鼠脑组织的固定与冷冻切片
- 使用二氧化碳气体处死转基因小鼠，随后进行断头并取出脑组织。
- 将脑组织在中线处沿纵轴解剖。一半脑组织用于在干冰上快速冷冻，以备生化分析；另一半则浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4°C下固定至少48小时。
- 在4% PFA中固定至少48小时后，将半脑直接转移至30%蔗糖溶液中，并置于4°C环境中。此时半脑应漂浮于蔗糖溶液中。当半脑沉至容器底部时（通常需要约48小时），即可将其包埋于OCT包埋剂中，用于冷冻切片。
- 在进行冷冻切片前，先在持样头表面涂布一层薄薄的OCT，并在-20°C下冷冻固化。将小脑从其余半脑组织上移除后，放置于已冻结的OCT层上。立即用OCT覆盖半脑组织，并在-20°C下缓慢冷冻。当包埋脑组织的OCT变为不透明时，即可进行切片。
- 设置切片厚度为30 μm。将每一片切片收集至含有D'Olomos溶液的容器中。
2. 神经炎性斑块免疫组织化学实验步骤（游离漂浮切片法）
- 将每个切片用88%甲酸处理15分钟。甲酸处理后，切片会暂时变得不透明，并可能出现皱缩现象。
- 将每个切片转移至培养板中，用Tx-PBS（含0.3% Triton X-100的PBS）洗涤，每次5分钟，共3次，期间轻轻振荡。
- 使用含0.5% H2O2的Tx-PBS在室温下封闭内源性过氧化物酶，孵育30分钟，期间轻轻振荡。
- 用Tx-PBS洗涤切片，每次10分钟，共3次，期间轻轻振荡。
- 用含5%脱脂奶粉的Tx-PBS在室温下封闭切片1小时，期间轻轻振荡。
- 将切片与一抗（生物素标记的4G8，1:500–1:2000，Signet）在含5%脱脂奶粉的Tx-PBS中4°C孵育过夜，期间轻轻振荡。
- 用Tx-PBS洗涤切片，每次10分钟，共3次，期间轻轻振荡。
- 按照生产商说明书配制ABC溶液（Elite ABC，Vector Laboratories）。将切片在ABC混合液中孵育30分钟，期间轻轻振荡。
- 用Tx-PBS洗涤切片，每次10分钟，共3次，期间轻轻振荡。
- 按照生产商说明书配制3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液（Vector Laboratories）。将切片在DAB混合液中孵育5–10分钟。此时可观察到每个切片上出现棕褐色着色。
- 用Tx-PBS洗涤切片，每次10分钟，共3次，期间轻轻振荡。
- 将游离漂浮的脑切片贴附于明胶包被的载玻片上，以增强组织黏附性。切片随后自然风干，经一系列二甲苯透明处理后，用Entellen封片。
- 在40倍放大倍数的光学显微镜下观察斑块，并通过评估每只小鼠每张切片的平均斑块数量进行定量分析。
3. 使用硫黄素S染色法检测神经炎性斑块
- 小鼠处死及脑组织提取步骤参见第 1.1 至 1.5 节。
- 将 4 至 5 张半脑切片贴附于载玻片上，于染色前完全室温晾干。
- 用 70% 乙醇洗涤载玻片 1 分钟。
- 用 80% 乙醇洗涤载玻片 1 分钟。
- 将载玻片置于滤过（0.2 μm 滤膜）的刚果红 S 溶液（1% 溶于 80% 乙醇）中孵育 15 分钟。（每次使用前均需过滤刚果红 S 溶液）。注意：需避光保存刚果红 S，并避免染色后的切片暴露于光线下。
- 用 80% 乙醇洗涤载玻片 1 分钟。
- 用 70% 乙醇洗涤载玻片 1 分钟。
- 用蒸馏水洗涤两次。
- 使用水溶性封片剂封片，并将载玻片置于暗处干燥至少 2 小时，随后用透明指甲油封固盖玻片。染色切片应于 4°C 避光保存。
- 可用荧光显微镜观察呈绿色荧光的染色斑块。建议在一周内完成切片分析，因染色信号会随时间逐渐减弱。
4. 代表性结果
在我们最近关于抗癫痫药物兼情绪稳定剂丙戊酸（VPA）抑制神经炎性斑块形成有效性的研究中，我们采用了上述免疫染色和硫黄素S染色方法来鉴定阿尔茨海默病（AD）模型小鼠中的神经炎性斑块（3）。图1显示了一只典型的9月龄APP23转基因小鼠，使用生物素标记的4G8抗体抗Aβ染色，并通过ABC法检测。神经炎性斑块被抗体清晰标记，并由白色箭头指示。通过硫黄素S染色，我们在2月龄的APP23xPS双转基因小鼠中检测到神经炎性斑块的沉积（图2）。在荧光显微镜下，硫黄素S结合含Aβ的神经炎性斑块呈现绿色（由白色箭头指示）。我们发现，经VPA处理后，神经炎性斑块的形成显著减少（3）。在另一项研究中，我们探讨了缺氧与AD发病机制之间潜在的分子联系。同样通过4G8抗Aβ免疫组织化学染色和硫黄素S染色，我们发现缺氧促进了含Aβ的神经炎性斑块的形成（4）。
图1. 阿尔茨海默病转基因小鼠中神经炎性斑形成免疫组织化学分析。 9月龄的APP23小鼠被处死，进行解剖、固定和切片。使用抗Aβ抗体4G8检测海马区的神经炎性斑，并通过ABC和DAB法显色。采用40倍光学显微镜观察斑块。白色箭头指示Aβ神经炎性斑。
图 2. 阿尔茨海默病模型小鼠中神经炎性斑块的硫黄素 S 染色。 8 周龄的 APP23xPS45 双重转基因小鼠被处死，进行解剖、固定和切片。通过硫黄素 S 荧光染色在海马区确认神经炎性斑块，并在 40X 放大倍数下通过显微镜观察。白色箭头指示硫黄素 S 染色的神经炎性斑块。
讨论
使用生物素标记的4G8抗体进行免疫组织化学染色，可特异性地显示阿尔茨海默病（AD）模型小鼠中的神经炎性斑块。该染色结果可用于定量并比较不同处理组之间的斑块负荷。实验中有多个关键步骤可能影响最终结果。由于在从颅骨中取出半脑前未进行灌注，因此在提取过程中应格外小心，以避免对半脑组织造成损伤。此外，由于半脑是被动灌注固定的，我们建议将其在4%多聚甲醛（PFA）中于4°C孵育至少48小时，然后再浸入30%蔗糖溶液中。另一种方法是在取出脑组织前进行经心脏灌注。若脑组织固定得当，其质地应具有一定的弹性。若固定不当，则脑切片在D'Olomos溶液中或染色过程中容易发生撕裂。
4G8 单克隆抗体可识别 Aβ 的第 17 至 24 位氨基酸残基，并识别核心序列（VFFAE）中的表位。由于 4G8 来源于小鼠，容易产生较高的背景染色。因此，我们选择在指定稀释比例下孵育切片，以在获得真实信号的同时尽量降低背景染色。
除了使用4G8抗体进行神经突斑块的免疫染色外，还采用硫黄素S染色法来鉴定斑块。硫黄素S是一种均相染料混合物，由脱氢硫代甲苯胺与磺酸甲基化反应生成。硫黄素S可非特异性地结合蛋白质中的β片层结构，例如淀粉样蛋白寡聚体中的β片层。当与目标物结合后，硫黄素S的发射光谱会发生特征性的蓝移。相反，硫黄素S与单体形式结合时不会产生蓝移，因此无法通过荧光显微镜检测到。硫黄素S染色为淀粉样物质的筛查提供了一种快速的方法，因为其荧光强度能够清晰显示少量的淀粉样沉积物。然而，硫黄素S染色的一个缺点是特异性较差。许多其他含有丰富β片层结构的组织成分，如纤维蛋白样物质、透明样物质、角蛋白等，对该染料也有较强的亲和力。
披露
所有实验均按照英属哥伦比亚大学动物护理与使用委员会以及加拿大卫生研究院（CIHR）的指南进行。
致谢
本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、汤森家族以及杰克·布朗及其家族阿尔茨海默病研究基金会（资助对象：W. S.）的支持。W. S. 持有加拿大阿尔茨海默病研究讲席。P. T.T. L. 获得加拿大自然科学与工程研究委员会以及迈克尔·史密斯健康研究基金会奖学金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-3 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% 甲酸 | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| 曲拉通 X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| 生物素标记的 4G8 抗体 | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC 试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB 显色试剂 | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan 封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus 显微载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 冷冻切片机 | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier 微量切片刀 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| 硫黄素 S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
参考文献
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
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