高通量酵母质粒过表达筛选

摘要

本文介绍了一种在Saccharomyces cerevisiae中进行质粒过表达筛选的方法，该方法采用阵列式质粒文库，并结合液体处理机器人进行高通量酵母转化实验。

摘要

芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究多种重要细胞过程基本机制的强大模式体系，其中许多过程与人类疾病直接相关。由于其世代时间短且基因组特征明确，酵母模式体系的一个主要实验优势在于能够开展遗传筛选，以鉴定参与特定生物学过程的基因和信号通路。在过去三十年中，此类遗传筛选已被用于阐明细胞周期、分泌途径以及更多在真核细胞生物学中高度保守的机制^1-5。近年来，已构建出多个覆盖全基因组的酵母菌株和质粒文库^6-10。这些资源使得研究人员能够系统地通过基因功能获得和功能缺失策略来探究基因功能^11-16。本文提供了一种详细的实验方案，介绍如何结合液体处理机器人使用高通量酵母转化方法，利用包含5,500个酵母质粒的阵列文库开展质粒过表达筛选。我们已将此类筛选用于鉴定与聚集倾向性人类神经退行性疾病相关蛋白积累所引发的毒性作用相关的遗传修饰因子。本文所述方法可便捷地适用于其他感兴趣细胞表型的研究。

方案

1. 酵母转化的准备工作

本方案适用于十块96孔板，但可根据需要相应扩大或缩小规模。我们发现，每轮转化操作中，若超过二十块96孔板，本方案的效果不佳。整个转化过程（从步骤I.3开始）大约需要八小时。

1. 使用Biorobot RapidPlate液体处理仪，将酵母FLEXGene ORF文库中的质粒DNA（100 ng/μL）各5–10 μL分装至圆底96孔板的每个孔中。将未加盖的96孔板置于洁净台通风橱中过夜干燥。我们发现CEN和2μ酵母质粒的转化效率相似。
2. 在500 mL带挡板的三角烧瓶中，向200 mL酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、20 g/L葡萄糖）接种待测菌株。在30°C条件下振荡培养过夜（200 rpm）。如有需要，起始培养也可使用选择性培养基。
3. 次日早晨，将待测菌株在2 L YPD培养基中稀释至OD₆₀₀=0.1。在30°C下振荡培养4–6小时（200 rpm），直至菌液OD₆₀₀达到0.8–1.0。为获得最佳生长状态，建议在两个独立的2.8 L带挡板烧瓶中分别培养1 L菌液。如有需要，可使用选择性培养基替代YPD。

2. 酵母转化

1. 通过离心收集细胞。将酵母培养物分装至四个一次性225 mL锥形管中，在台式离心机（Eppendorf 5810R）中以3000 rpm（约1800 × g）离心5分钟。倒去上清液，重复此步骤直至所有细胞均被收集。
2. 用200 mL灭菌蒸馏H₂O洗涤细胞。通过振荡或涡旋重悬细胞沉淀。将所有细胞合并至一个225 mL锥形管中，以3000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
3. 配制0.1 M LiOAc/1×TE溶液（含0.1 M LiOAc、10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 8，溶于灭菌蒸馏水中）。用100 mL 0.1 M LiOAc/1×TE溶液洗涤细胞，3000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
4. 将细胞沉淀重悬于70 mL 0.1 M LiOAc/1×TE溶液中。通过振荡和/或涡旋确保沉淀完全重悬。
5. 在30°C下振荡孵育30分钟（200 rpm）。
6. 加入β-巯基乙醇至终浓度0.1 M，在30°C下振荡孵育30分钟（200 rpm）。注意：若使用对β-巯基乙醇敏感的酵母菌株，可省略此步骤。我们发现该步骤对转化成功并非必需，但可提高转化效率。
7. 将2 mL超声处理的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）煮沸15分钟，随后置于冰上冷却。
8. 向细胞混合物中加入2 mL煮沸后的鲑鱼精子DNA。注意：加入鲑鱼精子DNA后可能形成沉淀。使用移液器和200 μL吸头小心去除任何形成的沉淀，因其可能干扰后续移液操作。
9. 使用BioRobot RapidPlate将50 μL细胞混合物分装至96孔板的每个孔中（也可使用多通道移液器）。不要混匀。
10. 在室温下静置孵育30分钟，不振荡。
11. 立即使用前配制200 mL 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1 M LiOAc溶液（160 mL 50% PEG-3350、20 mL DMSO、20 mL 1 M LiOAc）。
12. 向每孔加入125 μL PEG/LiOAc/DMSO溶液，使用RapidPlate通过吸取和排液操作混悬细胞悬液共8次。
13. 在室温下静置孵育30分钟，不振荡。
14. 在干式培养箱中42°C热激15分钟。切勿叠放培养板。注意：我们发现该热激步骤对成功转化并非必需。对于某些酵母菌株（例如温度敏感型突变株），热激反而有害。我们此前已将热激时间缩短至1分钟，并成功利用本方案转化了携带ypt1温度敏感突变的酵母菌株。
15. 使用适配96孔板的离心转子，在2500 rpm（约1100 × g）下离心5分钟。将培养板倒置于废液桶上以去除PEG溶液，然后将倒置的培养板轻压于纸巾上以吸除残留液体（细胞将保留在孔底）。
16. 使用RapidPlate向每孔加入200 μL基本培养基（如SD/-Ura），对细胞进行冲洗。
17. 以2500 rpm离心5分钟，将培养板倒置于废液桶上并用纸巾吸除上清液。
18. 使用RapidPlate向每孔加入200 μL基本培养基（如SD/-Ura）。
19. 在30°C下静置孵育2天，不振荡。2天后，成功转化的孔底部应开始出现微小菌落。

3. 点板实验

1. 将200μL基于棉子糖的最小培养基（例如SRaf/-Ura）加入到新的平底96孔板的每个孔中。
2. 使用Rapidplate通过吸取和加入细胞悬液各八次，混匀转化板的每个孔。
3. 从转化板中取5μL细胞混合物接种至SRaf平板上。
4. 在30°C下培养一天。一天后，每个孔底部应出现微小菌落。
5. 在超净台中将菌落点种至SD/-Ura和SGal/-Ura平板上。通过火焰灭菌96孔复制器（frogger）。使用frogger混匀菌落后，再点种至选择性培养基平板上。点种后，在超净台中静置平板5–10分钟使其干燥。
6. 在30°C下培养2–3天。

使用数码相机拍摄平板照片，并通过肉眼比较SGal/-Ura平板上菌落的生长情况，以寻找查询菌株毒性增强（生长较慢/菌落较稀疏）或受到抑制（生长较快/菌落较密集）的菌落。

4. 代表性结果：

图1. 酵母质粒过表达筛选用于鉴定TDP-43毒性的抑制因子和增强因子。TDP-43是一种人类蛋白，已被证实与肌萎缩侧索硬化症（ALS，即卢·格里克病）的发病机制相关。在ALS患者的大脑和脊髓神经元中可观察到TDP-43的胞质聚集¹⁷。在酵母细胞中表达TDP-43会导致蛋白聚集和细胞毒性¹⁸。我们已利用该模型系统来阐明TDP-43毒性的分子机制^19,20。图中展示了我们进行酵母TDP-43毒性修饰因子筛选时具有代表性的平板示例。这些平板上的菌落含有整合的半乳糖诱导型TDP-43质粒，并同时转化了FLEXGene ORF表达文库中的质粒。左侧平板含有葡萄糖，可抑制TDP-43或FLEXGene质粒的表达；右侧平板含有半乳糖，可诱导TDP-43及FLEXGene质粒中ORF的表达。绿色箭头指示的是转化了能够抑制TDP-43毒性的质粒的菌落；红色箭头指示的是转化了能够增强TDP-43毒性作用的质粒的菌落。

讨论

本文介绍了一种在酵母中进行高通量质粒过表达筛选的实验方案。该方法能够快速、无偏倚地筛选出多种不同细胞表型的遗传修饰因子。利用该方法，研究人员可在数周内对酵母基因组的相当一部分进行筛选。这种无偏倚的方法还可鉴定出基于以往研究结果难以预测的修饰因子。我们已应用该方法鉴定了与人类神经退行性疾病蛋白聚集相关毒性的修饰因子^19,21-23。然而，由于本方案可灵活用于研究其他细胞过程，因此对于致力于解决广泛重要生物学问题的研究人员而言，该方案具有广泛应用价值。例如，我们还发现该筛选方法在鉴定参与应对环境应激（包括重金属和氧化应激）的基因和通路方面同样有效。本文重点介绍一种质粒文库，即酵母FLEXGene文库⁹。但目前已有其他多种酵母质粒文库可供选择，也可用于此类筛选^6,8。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioRobot RapidPlate	Qiagen	9000490
96针复制器（frogger）	V&P Scientific	VP404
FLEXGene ORF文库	哈佛医学院蛋白质组学研究所
台式离心机	Eppendorf	5810R
500 mL 带挡板锥形瓶	Bellco Glass	2543-00500
2.8 L 三挡板Fernbach锥形瓶	Bellco Glass	2551-02800
100μL Rapidplate移液器吸头	Axygen Scientific	ZT-100-R-S
200μL Rapidplate移液器吸头	Axygen Scientific	ZT-200-R-S