高通量酵母质粒过表达筛选

摘要

本文介绍了一种在Saccharomyces cerevisiae中进行质粒过表达筛选的方法，该方法采用阵列式质粒文库，并结合液体处理机器人进行高通量酵母转化实验。

摘要

芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究多种重要细胞过程基本机制的强大模式体系，其中许多过程与人类疾病直接相关。由于其世代时间短且基因组特征明确，酵母模式体系的一个主要实验优势在于能够开展遗传筛选，以鉴定参与特定生物学过程的基因和信号通路。在过去三十年中，此类遗传筛选已被用于阐明细胞周期、分泌途径以及更多在真核细胞生物学中高度保守的机制^1-5。近年来，已构建出多个覆盖全基因组的酵母菌株和质粒文库^6-10。这些资源使得研究人员能够系统地通过基因功能获得和功能缺失策略来探究基因功能^11-16。本文提供了一种详细的实验方案，介绍如何结合液体处理机器人使用高通量酵母转化方法，利用包含5,500个酵母质粒的阵列文库开展质粒过表达筛选。我们已将此类筛选用于鉴定与聚集倾向性人类神经退行性疾病相关蛋白积累所引发的毒性作用相关的遗传修饰因子。本文所述方法可便捷地适用于其他感兴趣细胞表型的研究。

方案

1. 酵母转化的准备工作

本方案适用于十块96孔板，但可根据需要相应扩大或缩小规模。我们发现，每轮转化操作中，若超过二十块96孔板，本方案的效果不佳。整个转化过程（从步骤I.3开始）大约需要八小时。

1. 使用Biorobot RapidPlate液体处理仪，将酵母FLEXGene ORF文库中的质粒DNA（100 ng/μL）各5–10 μL分装至圆底96孔板的每个孔中。将未加盖的96孔板置于洁净台通风橱中过夜干燥。我们发现CEN和2μ酵母质粒的转化效率相似。
2. 在500 mL带挡板的三角烧瓶中，向200 mL酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、20 g/L葡萄糖）接种待测菌株。在30°C条件下振荡培养过夜（200 rpm）。如有需要，起始培养也可使用选择性培养基。
3. 次日早晨，将待测菌株在2 L YPD培养基中稀释至OD₆₀₀=0.1。在30°C下振荡培养4–6小时（200 rpm），直至菌液OD₆₀₀达到0.8–1.0。为获得最佳生长状态，建议在两个独立的2.8 L带挡板烧瓶中分别培养1 L菌液。如有需要，可使用选择性培养基替代YPD。

2. 酵母转化

1. 通过离心收集细胞。将酵母培养物分装至四个一次性225 mL锥形管中，在台式离心机（Eppen....

讨论

本文介绍了一种在酵母中进行高通量质粒过表达筛选的实验方案。该方法能够快速、无偏倚地筛选出多种不同细胞表型的遗传修饰因子。利用该方法，研究人员可在数周内对酵母基因组的相当一部分进行筛选。这种无偏倚的方法还可鉴定出基于以往研究结果难以预测的修饰因子。我们已应用该方法鉴定了与人类神经退行性疾病蛋白聚集相关毒性的修饰因子^19,21-23。然而，由于本方案可灵活用于研究其他细胞过程，因此对于致力于解决广泛重要生物学问题的研究人员而言，该方案具有广泛应用价值。例如，我们还发现该筛选方法在鉴定参与应对环境应激（包括重金属和氧化应激）的基因和通路方面同样有效。本文重点介绍一种质粒文库，即酵母FLEXGene文库⁹。但目前已有其他多种酵母质粒文库可供选择，也可用于此类筛选^6,8。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioRobot RapidPlate	Qiagen	9000490
96针复制器（frogger）	V&P Scientific	VP404
FLEXGene ORF文库	哈佛医学院蛋白质组学研究所
台式离心机	Eppendorf	5810R
500 mL 带挡板锥形瓶	Bellco Glass	2543-00500
2.8 L 三挡板Fernbach锥形瓶	Bellco Glass	2551-02800
100μL Rapidplate移液器吸头	Axygen Scientific	ZT-100-R-S
200μL Rapidplate移液器吸头	Axygen Scientific	ZT-200-R-S