溴脱氧尿苷（BrdU）标记及后续荧光激活细胞分选用于无需培养的溶解性有机碳降解浮游细菌鉴定

摘要

将环境中的浮游细菌与一种模型溶解性有机碳（DOC）化合物以及DNA标记试剂溴脱氧尿苷（BrdU）共同孵育。随后，利用荧光激活细胞分选技术（FACS），根据细菌对BrdU的掺入量升高情况，将降解DOC的细胞从整个微生物群落中分离出来。随后通过分子分析对这些细胞进行鉴定。

摘要

微生物是介导水生环境中多种溶解性有机碳（DOC）底物降解的主要媒介。然而，在自然环境中鉴定能够转化特定DOC组分的细菌类群仍面临技术挑战。

本文介绍一种结合溴脱氧尿苷（BrdU）掺入、荧光激活细胞分选（FACS）和基于16S rRNA基因的分子分析方法，可实现对水生环境中能够降解特定溶解性有机碳（DOC）化合物的浮游细菌进行无需培养的鉴定。设置三组浮游细菌微宇宙实验体系，分别添加BrdU和一种模型DOC化合物（DOC添加组），或仅添加BrdU（无添加对照组）。BrdU可在新合成的细菌DNA中取代胸腺嘧啶的位置，且BrdU标记的DNA易于通过免疫检测识别^1,2。经过24小时培养后，能够利用所添加DOC化合物的浮游细菌预期会被选择性激活，因此在DOC添加组中，这些细胞的BrdU掺入水平显著高于无响应细胞，也高于无添加对照组中的细胞（低BrdU掺入细胞，LI细胞）。经荧光免疫检测后，通过荧光激活细胞分选（FACS）将高BrdU掺入细胞（HI细胞）与LI细胞区分开并实现物理分离³。对分选出的DOC响应性细胞（HI细胞）提取DNA，并通过后续基于16S rRNA基因的分析（包括PCR、克隆文库构建和测序）进行分类学鉴定。

方案

1. 水样处理

1. 将10升环境水通过孔径为1 μm的膜滤器过滤，以去除大颗粒和细菌捕食者。将滤过的水收集至大容量容器中。
2. 将36 ml滤液分别转移至3个无菌离心管（50 ml）中，每个离心管内预先加入4 ml新配制的10%多聚甲醛溶液（PFA）。在室温下孵育2小时以固定细胞。通过真空抽滤将细胞收集到孔径为0.22 μm的白色膜滤器上。再用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）通过真空抽滤洗涤滤膜。将滤膜标记为阴性对照，并于-20°C保存。

步骤 1.3-1.4 为建立 DOC 限制条件的可选步骤。

3. 添加无机氮和磷的混合物（5 μM NH₄⁺ 和 1 μM PO₄³⁻）₄Cl，5 μM NaNO₃，以及 1 μM NaH₂PO₄ 最终浓度）加入到大瓶中。
4. 避光孵育于 原位 48 小时内偶尔振荡，保持恒定温度。

2. 微型生态系统建立与培养

1. 取步骤1.4中大瓶水样，向六个1升玻璃烧瓶中各加入800 ml水样，以建立微宇宙体系。向每个微宇宙中加入BrdU（终浓度10 μM），充分混匀。
2. 向其中三个微宇宙中各加入1 ml模型溶解性有机....

讨论

我们的方法结合了BrdU掺入、流式细胞术（FACS）和16S rDNA分析，可实现对水生环境中代谢特定溶解性有机碳（DOC）组分的浮游细菌在物种水平上的鉴定。BrdU掺入实验依据细菌的代谢活性对其进行标记，从而仅对活跃生长的细菌进行分析，排除了处于休眠状态的细胞。在本方法中，BrdU掺入用于标记正在活跃摄取和代谢外源性DOC组分的细菌细胞。 原位 通过FACS对免疫检测到的细菌进行可视化、分组和分选，这些细菌具有不同水平的BrdU掺入。已有报道采用磁珠免疫捕获BrdU标记的DNA，随后进行分子分析，以检测BrdU掺入的细胞。 ^2,8,9后一种方法的局限性在于无法区分不同活性水平的细胞。在这种情况下，分析将包括那些仅通过利用水样中内源性溶解性有机碳而保持微弱活性的细胞（图1，LIs）。

耦合方法已被用于鉴定能够降解近海海水中溶解性有机碳化合物（如二甲基巯基丙酸、香草酸、甘氨酸甜菜碱）的细菌的分类结构 ³其应用可广泛推广至研究利用其他单一或混合溶解性底物的水生环境中细菌的分类学。除了16S rRNA基因外，功能基因标记也可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BrdU	试剂	Sigma-Aldrich	B5002-5G
溶菌酶	试剂	Sigma-Aldrich	L6876-5G
蛋白酶K	试剂	Sigma-Aldrich	P2308-25MG
原位细胞增殖试剂盒，FLUOS	试剂盒	罗氏集团	11810740001	每次反应消耗的 Anti-BrdU-FLUOS 和孵育缓冲液应多于制造商建议的用量。
Frame-Seal 培养室	材料	Bio-Rad	SLF-1201
聚碳酸酯膜滤器（142 毫米直径，1.0 μm-孔径	材料	EMD Millipore	FALP14250
聚碳酸酯膜滤器（25 mm 直径，0.2 μm-孔径	材料	EMD Millipore	FGLP02500
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads	试剂盒	GE Healthcare	27-9559-01
QIAquick 胶回收试剂盒	试剂盒	Qiagen	28704
FailSafe PCR 系统	试剂盒	Epicentre Biotechnologies	FS99060