溴脱氧尿苷（BrdU）标记及后续荧光激活细胞分选用于无需培养的溶解性有机碳降解浮游细菌鉴定

摘要

将环境中的浮游细菌与一种模型溶解性有机碳（DOC）化合物以及DNA标记试剂溴脱氧尿苷（BrdU）共同孵育。随后，利用荧光激活细胞分选技术（FACS），根据细菌对BrdU的掺入量升高情况，将降解DOC的细胞从整个微生物群落中分离出来。随后通过分子分析对这些细胞进行鉴定。

摘要

微生物是介导水生环境中多种溶解性有机碳（DOC）底物降解的主要媒介。然而，在自然环境中鉴定能够转化特定DOC组分的细菌类群仍面临技术挑战。

本文介绍一种结合溴脱氧尿苷（BrdU）掺入、荧光激活细胞分选（FACS）和基于16S rRNA基因的分子分析方法，可实现对水生环境中能够降解特定溶解性有机碳（DOC）化合物的浮游细菌进行无需培养的鉴定。设置三组浮游细菌微宇宙实验体系，分别添加BrdU和一种模型DOC化合物（DOC添加组），或仅添加BrdU（无添加对照组）。BrdU可在新合成的细菌DNA中取代胸腺嘧啶的位置，且BrdU标记的DNA易于通过免疫检测识别^1,2。经过24小时培养后，能够利用所添加DOC化合物的浮游细菌预期会被选择性激活，因此在DOC添加组中，这些细胞的BrdU掺入水平显著高于无响应细胞，也高于无添加对照组中的细胞（低BrdU掺入细胞，LI细胞）。经荧光免疫检测后，通过荧光激活细胞分选（FACS）将高BrdU掺入细胞（HI细胞）与LI细胞区分开并实现物理分离³。对分选出的DOC响应性细胞（HI细胞）提取DNA，并通过后续基于16S rRNA基因的分析（包括PCR、克隆文库构建和测序）进行分类学鉴定。

方案

1. 水样处理

1. 将10升环境水通过孔径为1 μm的膜滤器过滤，以去除大颗粒和细菌捕食者。将滤过的水收集至大容量容器中。
2. 将36 ml滤液分别转移至3个无菌离心管（50 ml）中，每个离心管内预先加入4 ml新配制的10%多聚甲醛溶液（PFA）。在室温下孵育2小时以固定细胞。通过真空抽滤将细胞收集到孔径为0.22 μm的白色膜滤器上。再用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）通过真空抽滤洗涤滤膜。将滤膜标记为阴性对照，并于-20°C保存。

步骤 1.3-1.4 为建立 DOC 限制条件的可选步骤。

3. 添加无机氮和磷的混合物（5 μM NH₄⁺ 和 1 μM PO₄³⁻）₄Cl，5 μM NaNO₃，以及 1 μM NaH₂PO₄ 最终浓度）加入到大瓶中。
4. 避光孵育于 原位 48 小时内偶尔振荡，保持恒定温度。

2. 微型生态系统建立与培养

1. 取步骤1.4中大瓶水样，向六个1升玻璃烧瓶中各加入800 ml水样，以建立微宇宙体系。向每个微宇宙中加入BrdU（终浓度10 μM），充分混匀。
2. 向其中三个微宇宙中各加入1 ml模型溶解性有机碳（DOC）化合物溶液，作为DOC添加处理组；向其余三个微宇宙中各加入1 ml无菌PBS，作为空白对照组。
3. 将所有微宇宙置于摇床培养箱中，在原位温度（in situ temperature）下避光培养，同时以100 rpm振荡培养。
4. 在0、8、16和24小时时间点，分别从每个微宇宙中采集36 ml水样，转移至50 ml无菌离心管中。立即向样品管中加入4 ml新鲜PFA（10%），室温孵育2小时，以固定细胞。
5. 将固定后的细胞经0.22 μm孔径的聚碳酸酯膜过滤。用10 ml PBS洗涤滤膜。随后立即进行下一步操作，或将滤膜保存于-20°C。

3. 原位 BrdU 掺入的免疫检测

1. 在室温下解冻滤膜（DOC处理样品、无添加对照和阴性对照）。
2. 加入1 ml溶菌酶溶液［10 mg/ml鸡蛋清溶菌酶溶于100 mM Tris、50 nM EDTA（pH = 8）］⁴，以覆盖滤膜上的细菌细胞。室温孵育30分钟。通过抽滤方式用10 ml PBS洗涤滤膜。
3. 加入1 ml蛋白酶K溶液［2 mg/ml蛋白酶K溶于100 mM Tris、50 nM EDTA（pH = 8）］⁴，以覆盖滤膜上的细菌细胞。室温孵育30分钟。通过抽滤方式用10 ml PBS洗涤滤膜。
4. 加入1 ml外切核酸酶溶液［外切核酸酶III（50 U/ml）溶于5 mM MgCl₂和50 mM Tris-HCl］⁵，以覆盖滤膜上的细菌细胞。37 °C孵育30分钟。通过抽滤方式用10 ml PBS洗涤滤膜。
5. 按照制造商说明组装Frame-Seal孵育室（Bio-Rad）。
6. 在经酒精清洁的干燥表面上，使用无菌刀片将滤膜切成八等份。
7. 用镊子将滤膜的八分之一部分放入一个已组装的Frame-Seal孵育室中（每个滤膜样品需要八个孵育室）。滤膜切片带有细胞的一面应朝上。滤膜背面的水分可使其粘附于载玻片上。若滤膜变干，在将滤膜切片置于载玻片前，先在孵育室中央加入一小滴（2 μl）去离子水（diH₂O）。

步骤3.8-3.20使用罗氏（ROCHE）In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS试剂盒中的试剂，操作步骤根据制造商说明书进行了修改。除PBS外，所有试剂均由试剂盒提供。

8. 加入足够的孵育缓冲液（PBS 中含 0.5% 牛血清白蛋白和 0.1% Tween20），使其均匀覆盖孵育室中的滤膜区域，且在密封后不会溢出。
9. 将聚酯框架盖置于孵育室框架上，按压以紧密密封孵育室，避免滤膜上方产生气泡。将密封后的孵育室于室温避光孵育10分钟。
10. 移除聚酯封条并打开孵育室。（注意：打开孵育室时有时会将框架封条从载玻片上带起。若发生此情况，请为后续步骤准备新的孵育室。）
11. 从培养室的一角吸出孵育缓冲液，避免接触滤膜。
12. 用移液器轻轻吸取100 μl PBS，反复进出滤器腔室3次，以清洗滤器。
13. 使用前，按照制造商推荐的步骤立即配制抗BrdU-FLUOS工作液。
14. 将120 μl抗BrdU-FLUOS工作液加入滤膜上，注意均匀覆盖整个表面。
15. 用新的聚酯覆盖膜重新密封培养室，避免滤膜表面产生气泡。将培养室置于暗处，37 °C 孵育 3 小时。此步骤可标记掺入 DNA 的 BrdU 原位 使用异硫氰酸荧光素（FITC）。
16. 移除聚酯覆盖物并打开孵育室。用移液器吸出抗BrdU-FLUOS工作液。用PBS洗涤滤膜3次。
17. 将滤膜从孵育室转移至无菌表面，使用无菌刀片将滤膜切成小块。
18. 将滤膜碎片转移至含有1 ml PBS的2 ml微量离心管中。盖紧管盖，并用封口膜密封。在37 °C、200 rpm条件下孵育10分钟。
19. 将离心管固定在涡旋振荡器上，以最大速度涡旋振荡5分钟。用移液器将上清液转移至无菌的15 ml离心管中。重复孵育和涡旋步骤共5次。将同一份样品的上清液合并至同一个15 ml离心管中。通常情况下，悬浮液中可回收约80%的细胞。
20. 将含有重悬细胞的上清液于 4 °C 保存，在 2 天内进行分选。

4. FACS 分析

本文介绍了一种用于 BD FACSAria 流式细胞仪及其配套软件的操作流程。

1. 根据制造商推荐的步骤优化流式细胞仪的设置。这包括：调节放大控制以设定所需的断点参数和最佳信号点；针对实验所用鞘液压力优化激光延迟和面积缩放因子；优化FSC和SSC电压、FSC阈值、FSC荧光缩放、荧光PMT电压等参数。
2. 在流式细胞仪（FCM）上运行阴性对照样本，依据FITC荧光强度和侧向散射（SSC）进行分析。逐步提高FITC阈值，直至在FITC-SSC采集图中无法观察到阴性对照中的任何细胞信号。
3. 运行未添加试剂的对照样本，基于FITC和SSC采集10,000个细胞的分布模式。设定一个门控区域以圈选所有细胞，并将其定义为“低荧光强度细胞”（LIs）。
4. 运行添加DOC的样本，基于FITC和SSC观察10,000个细胞的分布模式。部分细胞将出现在预设的LI门控区域内。另设一个门控区域，圈选荧光强度高于LIs的细胞，定义为高荧光强度细胞（HIs）。采集统计数据以查看门控细胞的相对丰度。
5. 以“纯化单滴”模式将HI细胞分选至含有500 μl PBS的收集管中。当HI细胞数量达到500,000个时，终止分选。

5. 16S rRNA 基因的过滤式 PCR 扩增

滤膜PCR实验步骤经Kirchman等人⁶的方法修改而来

1. 将分选后的细胞过滤至一张白色的、孔径为0.22 μm、直径为25 mm的聚碳酸酯膜滤膜上。使用无菌刀片切除滤膜上不含细菌细胞的边缘部分，并将滤膜切成8个大小相等的片段。
2. 取一个滤膜片段放入PCR反应管中，使细胞面朝向管内。向PCR反应管中加入45 μl PCR级水，确保滤膜完全浸没在水中。
3. 向PCR反应管中加入2粒ROCHE illustra PuReTaq Read-To-Go PCR微珠，短暂涡旋混匀。再向每个PCR反应管中各加入2 μl的16S rRNA基因正向和反向引物（每种引物的终浓度为0.4 μM），例如27F和1492R⁷。
4. （可选）向PCR反应体系中加入1 μl牛血清白蛋白溶液（BSA，终浓度为30 μg/100 μl），以帮助吸附扩增抑制物。若不添加BSA，则加入1 μl水作为替代。
5. 在热循环仪上进行PCR扩增。推荐使用降落PCR程序：退火温度从62°C开始，每个循环降低1°C，直至52°C，共11个循环；随后进行15个循环，退火温度保持在52°C。所有循环均包括变性（95°C）、退火（62至52°C）和延伸（72°C）步骤，各步骤持续50秒。PCR程序还包括初始3分钟的变性步骤和最终10分钟的延伸步骤。
6. 通过溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增结果。从凝胶中切下PCR扩增产物，并使用QIAGEN QIAquick凝胶回收试剂盒进行纯化。
7. 对每个样品额外进行两次PCR扩增，每次使用一个新的滤膜片段。PCR扩增后经凝胶纯化，将同一样品的扩增产物合并。纯化后的16S rDNA扩增产物即可用于多种分子分析，以实现分类学鉴定，例如构建克隆文库并进行测序。

6. 代表性结果：

以腐胺降解细菌的研究为例，描述代表性实验结果。从美国佐治亚州沿海地点采集水样，并按照上述方法进行处理。流式细胞分选（FACS）分析显示，添加腐胺后诱导产生了一类具有高异硫氰酸荧光素（FITC）荧光强度的细菌，表明其具有较高的溴脱氧尿苷（BrdU）掺入率（图1）。这类细胞被定义为高BrdU掺入细胞（HIs），预计其中主要含有腐胺降解细菌。在未添加腐胺的对照组中未观察到HIs，仅存在BrdU掺入水平较低的细胞（LIs）。LIs预计主要包含无法利用所添加腐胺的浮游细菌。将HIs分选至不同的离心管中，随后收集到膜滤器上。利用滤膜PCR方法，对高HIs细胞进行16S rRNA基因扩增子的获取。

图1. 培养24小时后采集的无添加对照组和添加模型化合物（以亚精胺为例）样品的流式细胞分析结果。细胞分布分析基于：(1) FITC标记的荧光强度（x轴），其与BrdU掺入水平呈正相关；(2) 侧向散射（SSC，y轴），其与细胞大小呈正相关。门控标注依据BrdU掺入水平（HI，高BrdU掺入；LI，低BrdU掺入）。HI和LI细胞的相对百分比显示于相应门控区域内。

讨论

我们的方法结合了BrdU掺入、流式细胞术（FACS）和16S rDNA分析，可实现对水生环境中代谢特定溶解性有机碳（DOC）组分的浮游细菌在物种水平上的鉴定。BrdU掺入实验依据细菌的代谢活性对其进行标记，从而仅对活跃生长的细菌进行分析，排除了处于休眠状态的细胞。在本方法中，BrdU掺入用于标记正在活跃摄取和代谢外源性DOC组分的细菌细胞。 原位 通过FACS对免疫检测到的细菌进行可视化、分组和分选，这些细菌具有不同水平的BrdU掺入。已有报道采用磁珠免疫捕获BrdU标记的DNA，随后进行分子分析，以检测BrdU掺入的细胞。 ^2,8,9后一种方法的局限性在于无法区分不同活性水平的细胞。在这种情况下，分析将包括那些仅通过利用水样中内源性溶解性有机碳而保持微弱活性的细胞（图1，LIs）。

耦合方法已被用于鉴定能够降解近海海水中溶解性有机碳化合物（如二甲基巯基丙酸、香草酸、甘氨酸甜菜碱）的细菌的分类结构 ³其应用可广泛推广至研究利用其他单一或混合溶解性底物的水生环境中细菌的分类学。除了16S rRNA基因外，功能基因标记也可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BrdU	试剂	Sigma-Aldrich	B5002-5G
溶菌酶	试剂	Sigma-Aldrich	L6876-5G
蛋白酶K	试剂	Sigma-Aldrich	P2308-25MG
原位细胞增殖试剂盒，FLUOS	试剂盒	罗氏集团	11810740001	每次反应消耗的 Anti-BrdU-FLUOS 和孵育缓冲液应多于制造商建议的用量。
Frame-Seal 培养室	材料	Bio-Rad	SLF-1201
聚碳酸酯膜滤器（142 毫米直径，1.0 μm-孔径	材料	EMD Millipore	FALP14250
聚碳酸酯膜滤器（25 mm 直径，0.2 μm-孔径	材料	EMD Millipore	FGLP02500
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads	试剂盒	GE Healthcare	27-9559-01
QIAquick 胶回收试剂盒	试剂盒	Qiagen	28704
FailSafe PCR 系统	试剂盒	Epicentre Biotechnologies	FS99060