细胞中四半胱氨酸传感器蛋白的ReAsH/FlAsH标记与图像分析

摘要

双砷染料FlAsH和ReAsH可特异性结合蛋白质中的四半胱氨酸基序，能够选择性地标记活细胞中的蛋白质。近年来，该标记策略已被用于开发针对不同蛋白质构象或寡聚状态的传感器。本文描述了该标记方法及定量分析结合情况的技术。

摘要

荧光蛋白和染料是研究细胞内蛋白质转运、定位和功能的重要工具。虽然绿色荧光蛋白（GFP）等荧光蛋白已被广泛用作融合标签，以追踪目标蛋白的特性¹，但近年来发展的小分子标签技术使得在细胞中研究蛋白质的新功能成为可能，例如构象变化和蛋白质相互作用^{2, 3}。其中一种小标签系统是在目标蛋白中基因插入四半胱氨酸基序（CCXXCC），该基序可特异性结合双砷染料ReAsH（红色荧光）和FlAsH（绿色荧光），即使在活细胞中也具有高度特异性²。与荧光蛋白相比，TC/双砷染料系统的空间位阻更小，因此已促成多种用于检测构象变化和蛋白质-蛋白质相互作用的新方法^4-7。我们最近开发了一种TC标签的新应用，用于检测表达突变亨廷顿蛋白的细胞中的寡聚化状态；该蛋白在亨廷顿病中发生突变后会在神经元中形成聚集体⁷。我们将亨廷顿蛋白标记了两种荧光探针：一种是用于追踪蛋白位置的荧光蛋白，另一种是TC标签，后者仅在单体状态下结合双砷染料。因此，通过分析蛋白与双砷染料反应性之间的共定位变化，可实现对细胞内亚显微水平寡聚体含量的空间定位成像。本文中，我们描述了如何在活体哺乳动物细胞中使用FlAsH或ReAsH对与荧光蛋白（Cherry、GFP或CFP）融合的TC标签蛋白进行标记，并介绍如何定量分析双色荧光信号（Cherry/FlAsH、CFP/FlAsH或GFP/ReAsH组合）。

方案

1. 使用 ReAsH/FlAsH 标记细胞的准备

1. 采用针对目标细胞系的标准细胞培养方法，直接在活细胞成像载玻片中培养贴壁细胞，为转染做好准备。
2. 根据所选的转染方法，将含有TC标签目标基因的质粒转染入细胞。

需要注意的是，使用阳性和阴性对照非常重要，可用于评估与TC标签特异性结合的程度，并在采集共聚焦显微图像时评估各荧光通道之间的串色情况。因此，对于双色实验（例如FlAsH/Cherry、ReAsH/CFP或ReAsH/GFP组合），应确保准备单色样品（例如仅表达荧光蛋白，或尽可能使用与FlAsH/ReAsH结合的TC标签蛋白但不带荧光蛋白的样品）

3. 转染后一至两天，用 300 μL 预热（37 °C）的 HBSS 轻轻冲洗细胞。
4. 用 300 μL 含 1 μM FlAsH（或 ReAsH）和 10 μM 1,2-乙二硫醇（EDT）的预热 HBSS 轻轻浸没细胞。

在加入FlAsH/ReAsH之前，必须先加入EDT，并在即将加入细胞前配制缓冲液。在组织培养孵箱中精确孵育30分钟，温度为37 °C。根据我们的经验，孵育时间延长会显著增加背景荧光。新的构建体也应优化标记时间和FlAsH/ReAsH浓度（0.5–2 μM）。

5. 轻轻吸去细胞中的标记溶液，然后加入 300 μL 预热的 HBSS + 250 μM 2,3-二巯基丙醇（BAL），在 37 °C 下孵育 15 分钟。
6. 轻轻吸去洗涤液，加入 300 μL 预热的 HBSS 替代。

此步洗涤后，可用多聚甲醛固定细胞（使用3.2%溶液固定15分钟），但我们发现这会增加双砷染料的非特异性荧光。因此，我们通常在室温下对活细胞进行成像。（注意：标记前固定细胞会阻止双砷染料的结合。）

2. 在共聚焦显微镜上成像细胞

1. 在共聚焦显微镜上设置各个荧光染料的成像参数（参见表1），并确保各通道之间几乎无串色。可通过对照样本中每种荧光染料在不同荧光采集设置下的检测来验证是否存在串色。调整发射波长范围有助于最小化串色（但这也可能降低信噪比）。
2. 同时调节光电倍增管参数，使样品中最强荧光信号不超出探测器的饱和限度（可使用徕卡SP2共聚焦显微镜的Q-LUT模式检测信号饱和情况）。确定最佳成像参数后，在所有样品间不得更改任何设置。
3. 我们通常采用的其他设置（可进一步优化）包括：扫描速率为200 Hz，采集4次线平均，针孔直径设为1个艾里单位。若信噪比较低，可适当增大针孔直径，但可能导致成像分辨率有所下降。
4. 如条件允许，应以12位（或更高）格式采集共聚焦图像。12位格式相比8位格式可记录更宽的动态范围（每个像素强度值范围为0–4095，而非0–255），这对于获取最丰富的数据集至关重要，有助于最大限度提升定量数据分析的质量。
5. 对所有样品均需采集荧光蛋白通道（Cherry、GFP或CFP）以及双砷染料通道（FlAsH或ReAsH）的图像。

3. 数据分析

1. 在您的计算机上安装 ImageJ 软件⁸。http://rsbweb.nih.gov/ij/
2. 确保您的 ImageJ 版本包含以下插件：
   • http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html
   • http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html
   • http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html
3. 打开 ImageJ，如果使用的是早于 v1.32c 的版本，请点击以下选项以启用同时打开多个图像的功能（可通过按住控制键并点击不同文件实现）：
   
4. 在 ImageJ 中打开感兴趣的图像。
   ImageJ 将自动为每幅图像单独定义屏幕上显示的最大和最小像素强度。由于不同图像的像素强度不同，这意味着所显示的图像在视觉上不可直接比较。
5. 为确保所有已打开的图像处于同一尺度，您可以手动设定显示的上下限像素强度（这不会像某些其他软件那样改变图像的实际数据内容）。这些值可在以下菜单中设置：
   
6. 另一种方法是使用图像堆栈（stack），将所有图像合并为一个文件，并自动将堆栈中所有图像的显示尺度统一。处理数据最简便的方式是将每个通道转换为堆栈。因此，对于荧光蛋白通道，应如图所示将所有图像转换为堆栈。您可以通过将标题中含有共同名称（例如“ch00”）的所有图像堆叠起来，轻松选择某一通道。
   
7. 现在将所有已打开的图像转换为 8 位格式以进行分析。此操作会将显示范围实际重定标为 0–255 范围（即定义 8 位图像）。
   重要：切勿覆盖原始的 12 位（或更高）格式文件，否则将丢失信息内容。请注意，某些软件包仅能显示 8 位图像，因此该格式在制作图表等方面非常有用。
   
8. 使用“另存为…”选项，将副本保存到名为“8-bit converted”的新文件夹中。
9. 检查双砷染料在整个图像中结合程度的一种方法是进行像素强度相关性图分析。该图将一个通道中的每个像素值与第二个通道中对应位置的像素值进行对比绘制。因此，如果结合程度高，则 CFP 荧光较强的像素位置，其 ReAsH 荧光也应较强。
10. 为分析像素共相关性，请确保 8 位的 ReAsH 和 Cerulean/GFP 图像已在 ImageJ 中打开。
11. 按如下所示打开“Image Correlator”插件。将“Image1”选择为 ReAsH 或 FlAsH 堆栈，将“Image2”选择为荧光蛋白堆栈。
    
12. 生成的堆栈可能不显示任何详细信息——这是正常现象。将该堆栈保存到名为“Scatterplots”的新文件夹中，并使用与其对应的样本相同的文件名（例如“FlAsH-cherry correlation plot”）。
13. 为有意义地查看数据，您可以选择以下两种方式之一。首先将数据转换为对数格式，然后按如下方式视觉重定标数据：
    
14. 或者，您也可以视觉重定标数据，仅显示低值范围（例如 1–255），并使用特殊查找表（LUT）显示数据。查找表（LUT，Look Up Table）表示为图像中每个像素值分配颜色的颜色表。 这可用于为图像定义伪彩色方案，在突出图像中某些特征时非常有用。要创建自定义 LUT，请点击“LUT editor”并新建一个如图所示的 LUT（可保存并在后续使用）。
    
15. 将亮度/对比度范围设置为 0–255（如上文第 13 步所述）。为将屏幕上显示的图像“固定”下来，可将图像转换为 RGB 格式，该格式会为每个像素的红、绿、蓝三种颜色分别保存一个 8 位值。
    
    要将图像复制并粘贴到其他程序中，请首先打开 8 位或 16 位图像。如上文第 14 步所述，为图像分配一个 LUT 颜色方案。对于 CFP，按如下所述分配“Cyan”LUT…
    
16. 选择图像后，通过以下操作将其复制到剪贴板：
    

4. 典型结果：

使用双砷染料对细胞进行标记的成功与否取决于几个关键参数。首先，使用染料标记的时间至关重要。我们发现，过长的标记时间（超过30分钟）会导致非特异性背景染色显著升高。<图1>显示了此前描述的含有TC标签的猎蛋白片段（25Q）野生型与CFP衍生物Cerulean融合后的典型结果⁷。该样品用ReAsH染色30分钟，而在缺乏TC标签的样品中背景信号极低。我们发现，用多聚甲醛固定细胞会增加背景染色，而用甲醇固定则会消除荧光蛋白标签的荧光信号。因此，在可能的情况下，我们优先对活细胞进行成像。还需注意的是，使用双砷染料标记前对细胞进行固定会阻止染料结合，推测原因是TC基序发生了修饰。

获得稳定结果的另一个关键因素是细胞密度。我们发现，成像时细胞应呈松散分布，而过度聚集可能导致不同细胞中双砷染料染色不均。

图1. 转染表达亨廷顿蛋白（外显子1-25Q）-天蓝色荧光蛋白融合蛋白的活细胞中四半胱氨酸标签与ReAsH染色结果。TC标签位于亨廷顿蛋白与天蓝色荧光蛋白融合处的连接区域（如文献⁷所述）。像素强度相关性图可用于评估细胞内不同区域ReAsH结合的差异，并可用于绘制因构象变化或配体相互作用引起的ReAsH结合变化图谱。

讨论

利用荧光蛋白标记蛋白质定位，并用第二种染料标记其构象特性，这种方法在绘制蛋白质不同构象在细胞内的分布以及揭示影响蛋白质构象动态变化的事件方面具有巨大潜力。ReAsH/FlAsH 最初被用作哺乳动物细胞维甲酸结合蛋白 I 蛋白折叠的细胞内传感器⁴。在此实例中，FlAsH 结合至经基因工程改造、插入细胞维甲酸结合蛋白 I 中的 TC 标签，在蛋白质折叠状态下的荧光产率低于未折叠状态，从而可在E. coli细胞中追踪其折叠过程。最近，通过双位点四半胱氨酸展示技术，已在模型蛋白中实现了对蛋白质折叠和自关联现象的检测⁶。在此示例中，当含有双半胱氨酸对的两个肽段结合时，或通过一个肽段折叠从而重建出可结合双砷染料的功能性四半胱氨酸基序时，原本位于远端的双半胱氨酸对被拉近至邻近位置。我们进一步拓展了该方法，开发出能够区分单体与寡聚体的传感器，其原理在于所有寡聚体形式中，TC 标签均因空间位阻而无法与双砷染料结合⁷。

尽管TC标签和双砷染料作为构象变化和相互作用的报告分子具有潜力，但由于存在基线背景荧光，其信噪比较荧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔 μ-载玻片	Ibidi	80826	我们发现这些培养室载玻片在用于成像的细胞培养中特别有用。
TC-FlAsH II 细胞内四半胱氨酸标签检测试剂盒 *绿色荧光* *适用于活细胞成像*	Invitrogen	T34561 (FlAsH) 或 T34562 (ReAsH)
Hanks’ 平衡盐溶液	Invitrogen	14175-103
2,3-二巯基-1-丙醇	Sigma-Aldrich	D1129-5ML
1,2-乙二硫醇	Sigma-Aldrich	02390-25ML