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方法文章

盲肠结扎穿刺术

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DOI：

10.3791/2860

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2011年5月7日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology School of Medicine, Temple University , 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Temple University

本文内容

摘要

盲肠结扎穿刺小鼠模型作为研究人类脓毒症的重要工具。

摘要

人类脓毒症的特征是宿主无法将严重而广泛的感染局限在局部，从而引发一系列全身性反应。目前，脓毒症在美国重症监护病房的死亡原因中位列前十1。在脓毒症过程中，存在两个明确但可能重叠的血流动力学阶段。初始阶段（高动力期）表现为巨噬细胞和中性粒细胞大量产生促炎性细胞因子和活性氧物质，影响血管通透性（导致低血压）、心脏功能，并引发代谢改变，最终导致组织坏死和器官衰竭。因此，最常见的死亡原因是急性肾损伤。第二阶段（低动力期）是一种抗炎过程，涉及单核细胞抗原呈递功能改变、淋巴细胞增殖和功能下降以及细胞凋亡增加。这种被称为免疫抑制或免疫功能低下的状态，显著增加了院内感染的风险，并最终导致死亡。这些病理生理过程的机制尚未被充分阐明。由于脓毒症的两个阶段均可能造成不可逆且无法修复的损伤，因此确定患者的免疫学和生理状态至关重要。这也是许多治疗药物失败的主要原因。同一药物在脓毒症的不同阶段使用，可能具有治疗作用，也可能有害或无效2,3。为了从多个层面理解脓毒症，必须建立一种合适且全面的动物模型，以重现该疾病的临床病程。明确脓毒症期间发生的病理生理机制，并对模型条件进行严格控制以用于潜在治疗药物的测试，具有重要意义。

为了研究人类脓毒症的病因，研究人员已开发出多种动物模型。其中应用最广泛的临床模型是盲肠结扎穿刺术（CLP）。CLP模型通过穿刺盲肠，使其内容物释放到腹腔内，从而引发由多微生物感染所导致的强烈免疫反应。该模型能够很好地模拟临床上具有相关性的人类疾病状态。与人类患者类似，接受CLP处理并进行液体复苏的小鼠会表现出第一阶段（早期）的高动力状态，随后逐渐进展为第二阶段（晚期）的低动力状态。此外，其细胞因子谱也与人类脓毒症相似，均表现为淋巴细胞凋亡增加（详见文献4,5）。由于脓毒症涉及多种且相互重叠的发病机制，研究人员需要一个病情严重程度可控的合适脓毒症模型，以获得一致且可重复的实验结果。

方案

1. 盲肠结扎穿刺作为人类脓毒症的小鼠模型

本实验采用 C57BL/6 小鼠（7-9 周龄）。

  1. 通过腹腔注射1:1混合的氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）溶液对小鼠进行麻醉。作为参考，对一只体重为20克的小鼠注射30 μl的1:1混合溶液。或者，可使用麻醉蒸发器通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。
  2. 剃除小鼠腹部毛发，并先用聚维酮碘溶液消毒，再用70%酒精棉片擦拭（见下图序列中的编号1）。氯己定可作为替代的抗菌剂。可选：可使用无菌手术巾以保持术区清洁。
  3. 在无菌条件下，行1至2厘米长的腹正中切口，暴露盲肠及其相邻肠段（图2和图3）。
  4. 在回盲瓣下方的盲肠根部，使用6.0丝线（6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon）进行牢固结扎，并在同一侧盲肠壁上用19号针头穿刺一次或两次（图4和图5）。请注意，结扎盲肠的长度（定义为从盲肠远端至结扎点的距离）将决定脓毒症的严重程度。结扎长度＞1 cm可导致重度脓毒症，而≤1 cm则产生中至轻度脓毒症。另需注意，本实验所采用的盲肠穿孔方法不同于标准的贯穿穿刺技术（即针头完全穿透盲肠壁）。两种方法均可稳定诱导相同的脓毒症表型。然而，贯穿穿刺技术的一个缺点是当挤压盲肠时，无法控制排出粪便的量。
  5. 随后轻轻挤压盲肠，使少量粪便从穿孔处溢出（图6）。将盲肠放回腹腔，用6.0丝线缝合腹膜（图7）。
  6. 使用Reflex 7 mm夹（RS-9258, Roboz Surgical Instruments）或Michel伤口夹（7 mm, RS-9270）关闭皮肤（图8）。
  7. 通过皮下注射预热的0.9%生理盐水溶液1 ml（使用25G针头）对小鼠进行复苏。该液体复苏措施将诱导脓毒症的高动力相。此关键步骤在讨论部分有进一步说明。
  8. 可选：皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg体重）或曲马多（20 mg/kg体重）以提供术后镇痛。需注意，这些阿片类药物可能抑制呼吸和运动功能，这些效应可能被误判为脓毒症体征。
  9. 将动物暂时置于加热垫上，或立即放回笼中，并暴露于150 W红外加热灯下，直至其从麻醉中恢复。恢复时间通常为30分钟至1小时。
  10. 在笼底提供自由取用的食物和水（水凝胶）。
  11. 每12小时监测一次动物存活情况，持续一至两周；或在不同时间点处死动物，用于分析不同参数。

作为实验设计的对照，假手术动物将接受剖腹手术，但不进行结扎和穿刺。
手术后6至12小时，小鼠将出现精神萎靡、发热、竖毛、腹泻、蜷缩和全身不适等症状，这些均为脓毒症的表现。病情极为严重的小鼠在死亡前几乎无法移动，并表现出体温显著下降。在此阶段，应实施安乐死以避免小鼠遭受 prolonged 疼痛与痛苦。

小鼠伤口愈合过程，手术操作步骤，生物医学研究实验。

2. 最常分析的参数

为了评估手术结果，可在器官、细胞提取物或体液中分析不同的参数。样本可在手术后3小时至一周内的不同时间点采集。

  1. 小鼠存活率。
  2. 血清、腹腔及器官提取物中的细胞因子和趋化因子。
    1. 白细胞介素-6：由单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、粒细胞、肥大细胞及其他多种细胞类型产生并释放。在急性期反应和炎症过程中发挥重要作用。
    2. 肿瘤坏死因子-α：一种多效性细胞因子，在炎症和细胞凋亡中起核心作用。由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和成纤维细胞产生。
    3. 白细胞介素-1β：由单核细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞产生。可诱导发热及急性期蛋白的合成。
    4. 白细胞介素-10：促进吞噬细胞的摄取作用和Th2型免疫应答，但抑制抗原呈递及Th1型促炎性免疫应答。
    5. 白细胞介素-10：促进吞噬细胞的摄取作用和Th2型免疫应答，但抑制抗原呈递及Th1型促炎性免疫应答。
    6. 单核细胞趋化蛋白-1（又称CCL2）：将单核细胞、记忆T细胞和树突状细胞募集至组织损伤和感染部位。
    7. KC（CXCL1）：由巨噬细胞和内皮细胞产生。小鼠KC是一种强效的中性粒细胞趋化因子和激活剂。
    8. RANTES：一种单核细胞趋化因子。可趋化未受刺激的CD4+/CD45RO+记忆T细胞，以及具有初始和记忆表型的受刺激CD4+和CD8+ T细胞。
    9. 干扰素-γ：由Th1细胞、细胞毒性T细胞、树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞分泌。可增强巨噬细胞的抗原呈递能力和杀伤活性，抑制Th2细胞活性，促进白细胞迁移所需的黏附和结合，并增强NK细胞的活性。
    10. 高迁移率族蛋白B-1：在单核细胞中，通过与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合，激活核因子κB，从而在脓毒症晚期促进促炎介质的释放。
  3. 器官中髓过氧化物酶（MPO）的测定，用于评估中性粒细胞浸润程度。髓过氧化物酶是一种过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞中。它是一种溶酶体蛋白，储存于中性粒细胞的嗜天青颗粒内。MPO含有血红素色素，使其在富含中性粒细胞的分泌物（如脓液和某些类型的黏液）中呈现绿色。
  4. 器官和血液中的细菌负荷量，以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）的数量来衡量。

3. 代表性结果

CLP 手术最初在 C57BL/6 小鼠品系中进行。我们测试了多个参数，通过改变结扎长度和针头粗细来调节脓毒症的严重程度，如图1和图2所示。在这两个因素中，结扎长度对改变存活率的影响似乎比针头粗细更为显著。如图1所示，当结扎长度超过 1 cm 时，与结扎长度 ≤1 cm 的小鼠相比，死亡率升高至 100%。增加针头粗细也会降低存活率，使用 22G 针头时存活率为 100%，而使用 19G 针头进行两次穿刺后存活率降至 55%。我们还比较了 CLP 对 C57BL/6 和 129SvJ 小鼠的影响，以确定不同小鼠品系对 CLP 诱导的脓毒症是否具有相似或不同的易感性。图3 显示，在相同条件下，129SvJ 小鼠比 C57BL/6 小鼠更易感染，表现为更高的死亡率。

结扎长度生存曲线图，C57BL/6小鼠，比较穿刺尺寸19G，年龄7-8周。
图1. 盲肠结扎长度对动物生存率的影响。 在C57BL/6小鼠中采用两种不同长度的盲肠结扎进行盲肠穿刺结扎（CLP）模型操作。该单一参数显著影响动物生存率，结扎区域超过1 cm的组别中所有动物在3天内全部死亡，而结扎区域约为1 cm的组别动物存活情况较好（n=8）。

小鼠生存分析图；针头粗细影响，19G 与 22G，持续 10 天，两次穿刺。
图 2. 针头粗细对生存率的影响。 在 C57BL/6 小鼠中使用两种不同规格的针头（19G 和 22G）进行 CLP 手术。使用 19G 针头穿刺盲肠的小鼠生存率为 55–60%。相比之下，使用 22G 针头穿刺盲肠的小鼠生存率为 100%，尽管它们在最初 3–4 天内表现出典型的炎症症状，但这些症状在 4 天后消失（n=8）。

小鼠品系存活率比较图；Kaplan-Meier 曲线；C57BL/6 与 129SvJ 在 10 天内的比较。
图 3. 两种不同小鼠品系对脓毒症易感性的比较。在相同条件下，对 129SvJ 和 C57BL/6 小鼠进行盲肠结扎穿刺（CLP）模型实验。在评估期结束时，129SvJ 品系的存活率比 C57BL/6 品系低 25%，表明其对多微生物感染引发的炎症具有更高的易感性。（n=6）

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讨论

本文详细展示了如何在小鼠中实施CLP模型并调节其严重程度。

与其他脓毒症动物模型相比，盲肠结扎穿刺术（CLP）可在不同年龄和性别的任何小鼠品系中进行。该手术操作相对简单且成本较低。在此模型中，病情严重程度直接影响存活率。结扎长度、针头粗细以及穿刺次数是可调控的参数，可用于调节CLP模型的严重程度或死亡率。因此，若需显著改变CLP的严重程度，操作者可调整结扎长度；而若需轻微调整严重程度，则可通过改变针头粗细来实现。

可能对盲肠结扎穿刺（CLP）实验结果引入显著变异性的其他重要参数包括小鼠品系6,7、性别8以及动物的年龄9。在这方面，我们发现，在相同实验条件下，不同品系的小鼠对该操作表现出不同的易感性。事实上，已在不同小鼠品系之间检测到血浆细胞因子水平和组织损伤程度的差异10-12。液体复苏和镇痛药物的使用也是可能在CLP模型中引入显著变异性的因素。例如，液体复苏可能通过减少早期促炎性细胞因子的产生而提高存活率11, 13, 14

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披露

动物实验遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经天普大学动物护理与使用委员会批准。

致谢

本研究得到了宾夕法尼亚州卫生部资助项目的支持。
Miguel Garcia Toscano 博士在本研究期间由 Alfonso Martin Escudero 基金会资助，在天普大学担任博士后研究员。
我们感谢 Iliya Yordanov 和 Kevin Kotredes 为制作本视频所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮Ketaset0856-2013-01
赛拉嗪AnaSedNADA# 139-236
胰岛素注射器 29GExcel Scientific26028
丝线缝合线，6-0 PROLENEEthicon Inc.8680G
19G 和 25G 针头BD Biosciences305186
剃毛器General SupplyGeneral supply
红外加热灯General SupplyGeneral supply
Michel 伤口夹 7mmRoboz Surgical Instruments Co.RS-9270
耳挂式口罩Fisher Scientific19-130-4181
解剖剪刀Roboz Surgical Instruments Co.RS-6702
聚维酮碘溶液VWR international63410-992
外科镊子Roboz Surgical Instruments Co.RS-5135
70% 异丙醇消毒垫Fisher Scientific22-031-350
丁丙诺啡Bedford Laboratories55390-100-10
曲马多Sigma-Aldrich42965

参考文献

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