可将活的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中利用原子力显微镜（AFM）进行成像。
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本文内容
摘要
摘要
原子力显微镜（AFM）是一种高分辨率（纳米级）成像工具，通过机械探针扫描样品表面。它能够在液体环境中对细胞和生物大分子进行成像，而无需对样品进行化学处理。为了实现这一目标，样品必须充分附着在支撑表面上，以防止被扫描过程中AFM悬臂针尖施加的力所移除。在许多情况下，成功的成像依赖于样品在支撑表面的有效固定。理想情况下，固定过程应对样品的侵入性尽可能小，以确保其代谢过程和功能特性不受影响。通过在新解理的云母表面涂覆猪源明胶，可使带负电荷的细菌固定在表面，并在液体环境中利用AFM进行成像。细菌细胞在明胶涂层云母上的固定很可能是由于带负电荷的细菌与带正电荷的明胶之间发生静电相互作用所致。多种因素可能干扰细菌的固定效果，包括细菌悬浮液中的化学成分、细菌在明胶涂层云母上的孵育时间、菌株的表面特性以及成像时所用的培养基环境。总体而言，明胶涂层云母已被证明普遍适用于微生物细胞的成像研究。
方案
1. 云母片制备：
- 用剪刀将云母（Electron Microscopy Sciences）裁剪至适合原子力显微镜（AFM）的尺寸（约 22 × 30 mm）。
- 通常使用胶带剥离云母两侧的外层，直至仅剩光滑且完整的层。
2. 明胶溶液的制备：
- 向一个实验瓶中加入 100 ml 蒸馏水。
- 将瓶子放入微波炉中加热，直至水开始沸腾。（若无微波炉，也可将水置于烧杯中，用加热板加热。）
- 称取 0.5 克明胶（Sigma G-6144、G-2625 或 G-2500），加入到热的蒸馏水中。
- 轻轻旋转瓶子，直至明胶完全溶解。
- 将明胶溶液冷却至 60–70 °C。
- 将约 15 mL 溶液倒入一个小烧杯（20 mL）中，用于浸入切割好的云母片。
3. 云母涂层：
- 将云母片浸入预热的明胶溶液中，然后迅速取出，使云母表面被明胶覆盖（图1a）。
- 涂覆后，立即将云母片边缘朝下竖直放置在纸巾上，于室温空气中干燥（图1b）。涂有明胶的云母片至少可在两周内使用。剩余的明胶溶液可冷藏保存，通过将储备液重新加热至60–70 °C，可在约一个月内重复使用。重新加热时需注意避免明胶沸腾。
4. 在明胶包被的云母上固定细菌：
- 在800至4,500 rcf条件下离心1 mL细菌培养物（600 nm处OD值为0.5–1.0），离心时间约5分钟。根据细菌种类，选用能够使细胞形成沉淀的最低rcf。
- 用相同体积的过滤去离子水或缓冲液洗涤沉淀。
- 再次通过离心收集细胞。
- 立即将沉淀重悬于 500 μL 纳米纯去离子水或缓冲液。（细菌悬液应明显浑浊，以确保原子力显微镜成像时细胞浓度足够。）
- 加入细胞悬液（10-20 μL) 加到明胶包被的云母表面，用移液枪头将菌液在表面铺展开（图1c）。在加样或铺展细菌溶液时，应注意避免枪头直接接触明胶表面。
- 让表面静置10分钟，然后用流水或缓冲液冲洗（图1 c-d）。在整个操作过程中，务必确保样品始终保持湿润，避免干燥。
5. 典型结果：
图2显示了固定在明胶包被云母片上的细菌细胞经原子力显微镜（AFM）成像的示例图像。在我们的实验室中，通常使用配备100 μm扫描头的PicoPlus原子力显微镜（Agilent Technologies，亚利桑那州坦佩）对样品进行成像。该仪器以每行扫描128-512像素、扫描速度为0.5-1.0行/秒的条件运行。通常使用的悬臂为Veeco氮化硅探针（MLCT-AUHW，Veeco，加利福尼亚州圣塔芭芭拉），其标称弹性常数范围为0.01至0.1 nN/nm。
图1. 将60–70 °C的明胶置于20 mL烧杯中。用镊子夹取新解理的云母片，完全浸入明胶中（a），然后取出并垂直放置在纸巾上，斜靠于微量离心管架上（b）。将一滴细菌样品滴加到云母表面，并用移液器吸头在X和Y方向上均匀涂布（c）。让样品在云母表面孵育至少10分钟，随后用蒸馏水冲洗样品。若固定成功，则可在云母上观察到一个不透明的斑点，如（d）右图所示；若固定失败，则云母片保持透明，如左图所示。云母上的不透明斑点大小与滴加到经明胶处理的云母上的细菌浓度成正比。
图2. 大肠杆菌（E. coli）的原子力显微镜（AFM）图像。在图（a）中，细胞固定于明胶包被的云母片上，并在0.005 M PBS溶液中成像。作为对比，图（b）展示了同样固定于明胶包被云母片上但在空气中成像的细菌细胞图像。尽管在液体中采集的图像可清晰观察到隔膜结构，但空气中的成像分辨率更高，如图（b）插图所示，可观察到菌毛的存在。
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讨论
多种因素会影响微生物细胞在原子力显微镜（AFM）中的固定与成像。用于云母表面包被的明胶至关重要。市售明胶通常从多种脊椎动物中提取，包括鱼类、牛和猪。明胶的来源及其加工方法决定了其是否适用于细菌的固定。已有研究评估了多种来源和类型的明胶在固定细菌方面的有效性[1]。其中效果最好的两种明胶为 Sigma G-6144 和 G-2625，它们均来源于猪（猪源性），分别属于低勃氏强度（low Bloom）和中等勃氏强度（medium Bloom）明胶。在使用前，必须测试经明胶处理的基底与待研究细菌菌株之间的相容性。值得注意的是，来源于牛（牛源性）的明胶在固定所有测试菌株方面均无效。一种简单的细胞固定性检测方法是在用水或缓冲液冲洗后（步骤4.6之后），让样品在云母上自然干燥。若细菌被成功固定，可观察到浑浊区域（图1d）。若表面无浑浊，则说明冲洗水流已将细菌冲走。进行该测试时，操作者需注意添加剂（如盐类）可能也会导致浑浊现象，从而造成误判。
明胶包被云母固定技术已成功应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌（1）、细菌球状体（2）、病毒颗粒（3）以及硅藻外壳（4）。使用明胶固定的优势在于可使细胞在基底...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国能源部生物与环境研究办公室以及弗吉尼亚州联邦健康研究委员会的资助项目资助。橡树岭国家实验室由UT-Battelle有限责任公司根据合同号DE-AC05-00OR22725为美国能源部管理。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 或 G2500 | |
| PicoPlus 原子力显微镜 | Agilent Technologies | ||
| 原子力显微镜悬臂梁 | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
参考文献
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重印与许可
