我们提供了一种改进的从高盐度微生物垫中提取高分子量DNA的方案。在DNA提取和纯化之前，先将微生物细胞从微生物垫基质中分离出来。该步骤可提高DNA的浓度、质量和片段大小。本方案也可用于其他难处理样品的DNA提取。
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摘要
摘要
宏基因组数据的成功且准确的分析与解读依赖于高效提取高质量、高分子量（HMW）的群落DNA。然而，环境样本（如微生物席）常常难以获得高浓度、高质量的高分子量DNA。高盐度微生物席含有大量胞外多聚物（EPS）1 和盐分，可能抑制提取DNA的下游应用。针对难处理样本的DNA提取通常采用直接且剧烈的方法。这些方法常被使用的原因是，微生物席中的EPS作为一种黏附性基质，会在直接裂解过程中结合DNA2,3。由于采用了更剧烈的提取方法，DNA往往被断裂成较小的片段4,5,6。
因此，该DNA不适合用于大片段插入载体的克隆。为了克服这些限制，我们报道了一种改进的方法，可从高盐度微生物垫中提取高质量和高产量的高分子量（HMW）DNA。我们采用了一种间接方法，通过匀浆和差速离心将微生物细胞从微生物垫基质中分离出来。随后结合机械和化学手段，从分离得到的微生物细胞中提取并纯化DNA。本方案每克微生物垫样品可获得约2 μg的HMW DNA（35–50 kb），A260/280比值为1.6。此外，16S rRNA基因的扩增7结果表明，该方案能够最大程度减少或消除污染物可能带来的抑制作用。我们的研究结果为从微生物垫中提取HMW DNA以开展功能宏基因组学研究提供了适宜的方法，也可能适用于其他难以提取DNA的环境样品。
方案
1. 微生物细胞提取：
- 使用无菌研磨杵充分混匀微生物垫层。将约 30 g（湿重）均质后的垫层材料全部放入 Waring 匀浆器的无菌容器中，加入约 100 mL 的 1 M NaCl（或根据所用样品特定浓度），以中等速度匀浆 3 次，每次 1 分钟，每次间隔在 -20°C 冰箱中冷却 1 分钟。将匀浆液转移至 250 mL 离心瓶中，并用 1 M NaCl 补充至满体积。NaCl 溶液使用高压灭菌的去离子水配制，并经滤膜除菌。
- 在室温下使用涡旋振荡器（Vortex-GenieR2）以 150 rpm 振荡 30 分钟，进一步使微生物细胞从基质中脱离。
- 在 4°C 下以低速（500×g）离心 15 分钟。轻柔地将上清液转移至烧瓶中，尽量减少对沉淀物的扰动。
- 利用所得沉淀物，重复进行匀浆及步骤 1.2 和 1.3，共额外进行 4 次，每次在步骤 1.3 结束后向沉淀物中加入新鲜的 NaCl 溶液。每次 NaCl 提取所得的上清液均转移至新的烧瓶中。
- 合并 5 次细胞提取所得的上清液，分装为每份 200 mL，于 4°C 下以高速（25,000×g）离心 15 分钟。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 10 mL 2% 六偏磷酸钠溶液中，合并所有沉淀，并用 2% 六偏磷酸钠溶液定容至 200 mL。在室温下以 150 rpm 振荡洗涤细胞 30 分钟。此步骤结束后，应仅保留一支含有全部细胞的离心管，用于后续操作。 ....
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讨论
由于从复杂且高度多样化的微生物席样品中完全去除所有细胞并不现实，因此主要关注的问题是所提取的细胞在多大程度上能够代表整个微生物席群落。在之前的一项研究中，通过对微生物16S rRNA基因进行PCR-DGGE分析表明，本方案中所采用的五步细胞去除步骤所提取的细胞能够代表整个微生物席群落7。实际所需的细胞提取步骤数量可能因样品类型不同而有所变化。为了针对不同样品优化实验方案，建议先开展小规模的预实验，通过比较每一步细胞提取后所获得的微生物丰富度与原始群落的丰富度，以确定最佳的提取步骤数。
Fosmid 克隆需要用于文库构建的 35–40 kb HWM DNA8我们的方案获得的DNA片段大小在35–50 kb之间（图4），并已成功用于构建基于fosmid的宏基因组文库（未发表结果）。其他用于产EPS海洋细菌DNA提取的方案所获得的 ˜23 kb4在功能宏基因组学研究中，较大的DNA片段能够更广泛地获取编码生物合成途径以及功能行为的多种基因 9,10因此，高质量大分子量DNA是宏基因组学研究.......
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致谢
本工作由美国国家科学基金会环境基因组学计划（资助号：EF-0723707）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 聚乙二醇 8000 | Promega Corp. | V3011 | 20%（溶于1.2 M NaCl中） |
| 乙酸钾 | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA 检测试剂盒 | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre Biotechnologies | MRNA092 | |
| 氯化钠 | VWR | BDH8014 | 适当浓度 |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% 水溶液 |
| 六偏磷酸钠 | EMD Millipore | SX0583-3 | 2% 的水溶液 |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA 系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | ND-1000 | |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries Inc. | ||
| 紫外交联仪 | UVP 公司 | ||
| 沃林搅拌器 | 沃林实验室 | LB10S |
参考文献
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steff....
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