本文提出了一些在细胞培养中诱导缺氧的简单方法，以及评估培养物缺氧状态的简单检测手段。
本文内容
摘要
摘要
缺氧是指器官、组织或细胞中氧气的减少或缺乏。这种氧张力的降低可能是由于氧气供应不足（原因包括血管网络不充分、血管功能缺陷和贫血）或相对于供应而言氧气消耗增加（由细胞增殖速率突然升高引起）所致。缺氧可以是生理性的，也可以是病理性的，例如实体瘤中的缺氧情况。 1-3类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等… 不同组织和细胞对这种新环境的适应能力各不相同。在缺氧条件下，缺氧诱导因子α（HIF）得以稳定，并调控多种基因的表达，例如参与血管生成或氧气运输的基因。 4该蛋白的稳定化是缺氧的标志性特征，因此检测HIF常被用于缺氧的常规筛查。 5-7.
本文中，我们提出两种在哺乳动物细胞培养中诱导缺氧的简单方法，以及评估这些细胞缺氧状态的简单检测手段。
方案
1. 由 CoCl2 溶液诱导的缺氧
六水合氯化钴（CoCl2 • 6H2O，分子量 = 237.9）是一种缺氧诱导因子-1的化学诱导剂8。该产品可溶于水（100 mg/ml），形成澄清的红色溶液。
- 用无菌去离子水配制 25 mM 储存液（请在使用前立即配制）
- 在常规细胞培养基中加入 CoCl2，使其终浓度为 100 μM，以诱导缺氧状态。
- 将含有 CoCl2 的培养基加入细胞中，并在普通培养箱（37°C；5% CO2）中培养 24 小时。
上述浓度适用于我们已测试的细胞系，但每种细胞系均应通过不同浓度（以建立剂量依赖性曲线）以及不同孵育时间进行测试，以控制药物相关毒性并优化检测效果。
2. 在模块化培养箱中诱导缺氧
- 准备至少两份相同的（孪生培养）细胞培养物。细胞培养物可置于烧瓶、培养板或培养皿中。打开舱室前，先打开连接在舱室上的两枚白色塑料夹（用于注入/通入缺氧气体的管路），然后轻轻松开钢环夹。
- 松开夹子后，即可取下舱盖和托盘。
- 将细胞培养物放入缺氧舱内。同时在舱内放置一个含有无菌水的培养皿，以提供足够的湿度，确保培养物的充分保湿。
- 将“孪生”细胞培养物置于常氧环境中作为对照。
- 确保托盘已固定稳妥、不会移动，然后盖上舱盖。正确放置钢环夹以确保舱室完全密封，随后将其夹紧。
- 为建立缺氧环境，将管路连接至含有1% O2气体混合物的“缺氧气罐”。若气罐上已连接流量计，则可直接将舱室与流量计相连（气罐—流量计—舱室）。我们使用的是集成在减压阀中的流量计。
- 重要的是要尽可能完全地去除舱室及培养基中存在的氧气。为此，以每分钟20升的流速打开气罐，对舱室冲洗7至10分钟；随后迅速关闭气体流，并立即关闭两个白色夹子，彻底密封舱室。
- 将密封后的舱室放回常规培养箱中，按所需时间进行培养。若使用较大体积的培养物，应让培养基脱气1至2小时，然后重复一次冲洗步骤。
上述操作步骤基于制造商（Billups-Rothenberg, Inc）的建议。请始终确保气罐已牢固固定。
注意事项：
- 为了消除培养基中含有的 O2，建议在 1–3 小时后重新对培养 chamber 进行气体置换。
- 若培养时间超过 48 小时，也建议重新对 chamber 进行气体置换。
- 使用可检测细胞/腔室内 O2 含量的氧气传感器（电极/压力计）可更精确地测定细胞内/腔室内的 O2 含量。
- 对细胞进行不同时间长度的培养以绘制时间曲线，有助于确定 HIF-1α 在您特定细胞中的最佳表达时间。
3. 缺氧评估
- 通过蛋白质印迹法检测 HIF-1α
- 按照第2.2节所述方法重新打开培养室，并立即将培养物置于冰上。
- 用含5% SDS的溶液在培养板中裂解经低氧处理和未处理的细胞，然后将细胞裂解液转移至离心管中，进行超声处理，离心去除细胞碎片，并收集上清液。
- 使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液并95°C加热5分钟，制备样品。
- 在8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白质电泳，随后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。
- 用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween 20的PBS溶液在室温下封闭膜1小时，或在4°C摇床上过夜封闭。
- 在相同缓冲液中，加入抗HIF-1α单克隆一抗（1/600稀释），4°C孵育过夜。
- 用含0.1% Tween 20的PBS溶液在室温下洗涤3次，每次5分钟，随后在PBS + 0.1% Tween 20中加入HRP标记的二抗（1/2000稀释），孵育45分钟。
- 用含0.1% Tween 20的PBS溶液在室温下洗涤3次，每次5分钟。
- 使用Pierce ECL试剂盒和X射线胶片显影蛋白条带。
- 低氧反应元件（HRE）
HIF-1α通过结合一种称为低氧调控元件（HRE）的DNA序列，调控多种基因（如VEGF、EPO）的表达。利用与报告基因相连的HRE序列，可检测HIF的活性9。使用该方法时，首先需采用适合您细胞类型的转染方法，将HRE-荧光素酶质粒转染至细胞中。例如，我们使用了Lipofectamine 2000。细胞需在低氧或常氧条件孵育前至少4小时完成转染，以确保DNA充分进入细胞，从而避免低氧环境对转染过程本身造成影响。荧光素酶信号通过荧光素酶检测试剂盒进行检测。- 将转染了HRE质粒的细胞置于模块化培养室中进行低氧孵育，或使用经CoCl2处理的HRE转染细胞，同时设置常氧对照组。
- 在所需孵育时间结束后，移除细胞培养基。
- 用PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。
- 向培养皿中加入400μl 1X裂解试剂，刮取贴壁细胞，并将其转移至微量离心管中。
- 短暂离心，沉淀细胞碎片。
- 取20μl细胞裂解液上清与100μl荧光素酶检测试剂混合，使用化学发光仪测定发光值。
4. 代表性结果：
在低氧条件下培养2天的K562细胞（人白血病细胞系）中，与常氧条件相比，缺氧诱导了HIF-1α蛋白的增加，该结果通过Western印迹检测得到证实（图1）。
在低氧条件下培养经HRE-荧光素酶修饰的293细胞（胚胎肾细胞系），检测到低氧细胞中HIF-1α活性显著升高（图2）。
图 1：缺氧细胞中 HIF-1α 水平升高。K562 细胞在常氧和缺氧（缺氧舱）条件下培养 48 小时，随后使用特异性针对 HIF-1α 的抗体进行 Western blot 分析。使用特异性针对肌动蛋白（actin）的抗体作为上样对照。
图2：HIF-1α 活性。将经HRE-荧光素酶修饰的293细胞在缺氧和常氧条件下培养48小时，随后裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒和发光仪检测荧光素酶信号。结果以相对光单位（RLU）表示。
讨论
在缺氧条件下，不同细胞类型的增殖和存活情况差异很大。因此，您应调整起始接种的细胞数量或培养板的数量，以确保实验中有足够的细胞或蛋白质用于后续分析。
氯化钴法具有成本低、速度快的优点。该产品通过诱导HIF-1/3α来模拟缺氧环境，但也可能调控其他基因。请确认该产品是否适用于您的研究项目，需验证其在独立于“模拟缺氧”效应之外，对特定细胞功能和表型可能产生的其他影响。另一种常用于模拟缺氧的药物是甲磺酸去铁胺（DFO，终浓度为100 μM）。使用这些药物可使实验人员多次打开培养皿/培养板/培养瓶，而不会影响“缺氧状态”。
气体混合物中的氧气浓度可根据实验需求和细胞类型而调整，因为不同组织和细胞类型的缺氧值存在差异。实际上，某些细胞在5% O2条件下即处于缺氧状态，而另一些细胞则需要低于1% O2才能达到缺氧。在气体混合物中加入5%CO2是为了稳定培养体系的pH值，其余气体通常为氮气。
缺氧培养箱的优势在于无需使用可能独立于氧张力而改变细胞行为的药物。然而，并非所有类型的实验都适合使用缺氧培养箱，因为每次打开培养箱时氧气会重新进入，从而减弱缺氧状态。在实验设计中应考虑这一因素；缺氧/复氧是一种特定条件，可能影响某些细胞类型。另一种选择是使用缺氧工作站（连接预混合气体钢瓶或气体混合系统）或更大的缺氧培养箱（带手套操作箱的缺氧处理舱），可在持续缺氧环境中更换培养基和操作细胞。过去十年中已有多种缺氧培养箱实现商业化，应根据实验室的用途、项目需求、空间、尺寸和预算进行选择。务必始终确保培养箱的正确使用和良好状态，以保证准确的培养条件。通常在使用培养箱时，可通过选择不同的气体混合比例（如1%、5%、10%氧气）来调节缺氧水平。
关于HIF-1α的检测，需要注意某些癌细胞系在常氧条件下即表达HIF-1α。因此，使用常氧对照以确定这些细胞系中HIF的基础水平至关重要。在非恶性细胞中，细胞受到刺激或处于应激状态时，HIF-1α也可能在常氧条件下出现。若细胞处于饥饿状态，也可能出现类似情况，因此请确保细胞培养物得到充分的营养供应并妥善维护。
披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| 氯化钴（II） | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| 培养箱气密室 | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-荧光素酶质粒 | Addgene | Plasmid 26731 |
参考文献
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