微离子电渗法是指在微移液管内外电势差的作用下，离子从微移液管中移动的过程。生物活性分子由此以与电流成正比的方式递送。我们通过乙酰胆碱微离子电渗法结合微操作技术，来研究微循环中内皮依赖性血管舒张作用。
本文内容
摘要
摘要
微离子电渗法通过微电极尖端施加电流，从而在实验制备的特定部位递送溶质。微离子电渗法可通过可重复地将神经递质和神经肽递送至神经元，模拟突触传递12。由于液体体积位移可忽略不计，因此可避免对实验制备造成机械干扰。将这些技术应用于微循环3后，可在活体条件下于显微水平研究血管舒张和血管收缩的机制in vivo4,5。这种局部递送的关键优势在于，可在微血管网络的特定部位研究血管运动反应，而不会引发全身性或反射性的血压和组织血流变化，从而揭示微血管的内在特性。
微离子电渗入法的一个局限性在于，难以准确确定递送到目标部位的试剂精确浓度6。然而，试剂从微电极尖端的释放量与推出电流的强度和持续时间成正比2,7，因此在既定的实验条件下，可容易地确定可重复的刺激-反应关系（如下所述）。影响微离子电渗入递送的其他因素包括溶质浓度及其在溶液中的电离状态。微电极尖端的内径应为˜ 1 μm或更小，以最大限度减少扩散性“泄漏”，这种泄漏可通过施加保留电流来抵消。因此，使用向外的（正向）电流将阳离子推出，而使用负向电流将其保留在微电极内部。
使用精密的电子拉制仪可方便地制备微电极8。微电极由含丝状结构的玻璃毛细管拉制而成，当从后端（“后向填充”）填充溶液时，该丝状结构可将溶液“虹吸”至微电极尖端。操作时，将连接有注射器的微毛细管插入微电极后端，该注射器内含有所需溶液，随后将溶液注入微电极的内腔。显微操作仪可实现微电极在实验样本中的精确定位。安装在可移动底座上的显微操作仪可根据微血管网络的拓扑结构（如下所述）灵活地布置在样本周围。
本实验方案展示了将乙酰胆碱（ACh+ Cl-）通过微离子电渗法施加于小鼠提睾肌肌瓣中的微动脉，以诱导内皮依赖性血管舒张（参见相关方案：JoVE ID#2874）。刺激信号的传递与数字化图像采集通过电子触发器实现同步。使用Cx40BAC-GCaMP2转基因小鼠9，可在活体微循环中观察微动脉内皮细胞内钙离子响应，从而揭示血管舒张的细胞内机制。
方案
1. 动物护理与使用
在获得机构动物护理和使用委员会的审查与批准后，使用至少12周龄的雄性小鼠。通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在整个手术过程和实验操作期间，根据需要（每30-60分钟一次；以脚趾或尾部夹捏时无回缩反应为指标）追加初始剂量的10-20%作为补充麻醉剂以维持麻醉状态。实验操作完成后，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠使小鼠深度麻醉，随后以颈椎脱位法实施安乐死。
2. 微量移液器与微电泳
- 使用水平拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备微电泳移液管（内部尖端直径约 1 μm）。我们的移液管具有约 5 mm 的锥形部分以增加刚性；较长的锥形部分则更柔软。
- 用 1 M ACh（图1A-C）溶解于 18.2 MΩ 水中，从后端填充移液管。进行后端填充时，将微毛细管连接至装有待测激动剂的注射器上的 0.2 μm 滤器（图1）。这些装置可自行制备（见下文），也可从商业供应商处购买。将微毛细管插入移液管的后端，在移液管填充过程中缓慢抽出微毛细管，从而将 ACh 溶液注入管腔。手持移液管使其尖端朝下，轻轻弹击移液管以排除气泡。
- 将移液管固定在安装于显微操作器的持针器中（图2）。持针器内含一根银丝，连接移液管内的 ACh 溶液至外部插针，该插针再连接至微电泳程序控制器的正极端。另一根银丝固定在组织制备物边缘，连接至负极端，当移液管尖端推进至覆盖组织的生理盐水溶液中时，形成完整电路。
- 当移液管尖端位于小动脉壁附近时，施加维持电流以防止血管舒张（或荧光反应）。维持电流的大小取决于移液管尖端尺寸（内径 = 1 μm）和激动剂浓度，但在特定参数下具有高度可重复性（对于 1 M ACh 和 1 μm 尖端，我们使用约 200 nA）。维持电流在电子触发器（补充图1）启动时停止，该触发器与图像采集的开始同步，同时启动推出电流。
3. 显微操作
- 使用铁磁性不锈钢加工制作了一个用于X-Y显微镜载物台的定制平台。该平台的尺寸（1/8英寸 × 12英寸 × 13英寸）可为实验准备提供充足空间，便于按需布置显微操作器（图2A）。将显微操作器固定在磁性底座上（图2B），可根据实验准备的需要进行定位。这些装置直接放置在所制备平台的周围，用于将微电极移至感兴趣的位置（图2C）。
4. 代表性结果
- 将微量移液管尖端置于小动脉旁时，乙酰胆碱（ACh）会引起荧光反应（保持电流以防止ACh泄漏）。当刺激强度低于阈值时，无明显效应。然而，随着刺激强度增加，沿小动脉的内皮细胞钙离子荧光反应在更远的距离上逐渐增强，且在刺激部位的荧光强度也随之增加（图3）。
图1. 微离子电泳移液管后填充方法。A) 将微毛细管（绿色箭头）固定在压缩接头（蓝色箭头）中，该接头连接一个0.2 μm滤器（紫色箭头），再与装有1M ACh的注射器相连。B) 从微离子电泳移液管的尾端将微毛细管插入，推动溶液以充满移液管的管腔。C) 移液管充满后，将管尖朝下，轻轻弹击锥形部位上方，以去除气泡（黑色箭头）。
图2. 用于微操作器定位的定制平台。A) 将一块铁磁性不锈钢平台放置在定制的MVX10显微镜底座上，该底座包含一个X-Y平移台。B) 圆形磁性底座固定在紧凑型三轴微操作器的底部。C) 微操作器围绕实验样品布置（参见相关实验方案：JoVE ID#2874），以研究特定感兴趣区域。其紧凑的尺寸和多功能性可实现多个微移液管的同时使用。
图3. 小动脉中的钙荧光。 随着刺激强度的增加，衬在小动脉壁上的内皮细胞的钙荧光增强。
前3个图显示了对 A) 250 nA、B) 500 nA 和 C) 1000 nA 排出电流（均为500 ms脉冲持续时间）的荧光反应图像。A-C图中用方括号标示出内皮细胞钙荧光增强的距离（分别约为130、270和400 μm）。每个图中小动脉上的参考线表示在刺激部位记录乙酰胆碱（ACh）荧光反应（F/Fo）的位置。D) 随时间变化的F/Fo记录，对应逐渐增强的ACh刺激。随着排出电流的增加，F/Fo的幅度和持续时间均增加。注意，100 nA的刺激低于阈值，无任何效应。
补充图1. 电子触发器的电路图。 该电路与个人计算机的并行端口相连。激活后可提供一个恒定的5V TTL脉冲。7805芯片是一个5V电压稳压器，连接至9–12V直流电源（使用适当电压的电池亦可）。7805的输出为四通道双向开关及整个电路的输出端供电。通过1K电阻的输入信号来自计算机。
讨论
本文所述方案展示了用于微离子电渗法的微移液管的制备与实施方法。通过递送乙酰胆碱（ACh）来演示麻醉小鼠微动脉中内皮依赖性血管舒张背后的钙信号机制。我们的结果表明，ACh引起内皮细胞钙荧光增加的作用距离随微离子电渗微移液管施加的推出电流强度的增加而增大（图3）。在静息条件下未观察到荧光增强，表明ACh从微移液管中的泄漏可忽略不计。在100 nA刺激强度下无反应（图3，图注）说明内皮细胞钙浓度升高需要达到一定的刺激强度阈值。这些技术可轻松适用于其他血管活性物质及组织样本的实验。
实际注意事项：在使用微离子电渗法研究小动脉反应性时，应注意以下几点。尽管确定递送激动剂的实际浓度较为困难，但在同一制备样本内及不同样本之间，刺激-反应曲线具有可重复性。可通过保持脉冲持续时间恒定（例如 500 ms）并改变推出电流（例如 250、500 和 1000 nA；图3）来完成此类实验。或者，也可保持推出电流恒定（例如 500 nA），而改变脉冲持续时间（例如 250、500 和 1000 ms）。若需参考特定激动剂浓度的作用，可通过灌流适当溶液来实现5。由于溶质推出的驱动力是电荷移动，因此待递送的物质必须带有净电荷，才能从微移液管中被置换出来。为确保目标物质为主要的电荷载体，应将其溶解于高浓度（例如乙酰胆碱为 1 M），以尽量减少电渗效应。当此过程需要调节微移液管填充液的 pH 值时，必须设置溶剂对照，以确认是否存在非特异性效应。还应进行单独电流通过的适当对照实验（例如使用充满等渗盐水的微移液管）。应确定药物从释放位点扩散的有效作用距离，最简便的方法是通过实验观察生理反应（例如推出乙酰胆碱后引起的血管舒张或细胞内钙离子升高）随微移液管与靶点之间距离增加而消失的现象。实际操作中，有效扩散距离很大程度上受微移液管尖端在组织中位置的影响；例如，若尖端压入组织导致其开口被堵塞，则推出效果将受损。过多的结缔组织尤其会造成干扰，应在手术准备过程中将其从组织表面清除。还应注意避免微移液管尖端处的目标物质耗尽。使用相对较短的脉冲（例如 ≤ 1 s）可将此问题降至最低。当持续施加电流（例如数秒）时，激动剂从尖端排出的速度可能超过其通过扩散从微移液管内主体填充液中补充的速度。
由于微离子电泳置换的体积可忽略不计，若需改变局部离子环境（例如，递送去极化的 K+ 刺激），则无法通过微离子电泳有效实现，而可通过压力喷射具有目标成分的大量液体轻松实现。对小动脉进行局部刺激时，使用尖端内径为 2–3 μm 的微移液管，配合 4–5 psi（28–35 kPa）的喷射压力，并通过电磁阀控制脉冲持续时间（例如，1 秒），效果良好10。当需要从小口径移液管对微血管持续递送试剂时，宜采用具有适当尖端内径（例如，˜10 μm）的微移液管进行压力喷射11,12。使用已知高度的静水柱并配备止流阀，可提供一种低成本、定义明确且可开关的恒定压力源。流速由移液管尖端的内径和驱动压力决定。与所有实验操作相同，必须设置溶剂对照，以排除压力喷射本身的非特异性效应。
披露
所有涉及动物的实验程序和方案均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院的规定执行 实验动物护理和使用指南 本文的制作由斯坦福光子学公司（Stanford Photonics）赞助。
致谢
作者实验室的研究工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 R37-HL041026、R01-HL086483 和 R01-HL056786（SSS），以及美国公共卫生服务局资助的 F32-HL097463 和 T32-AR048523 项目（PB）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| 水平毛细管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 氯化乙酰胆碱 | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| Luer 接头适配器 | Martech | AC1343 | 用于固定微毛细管 |
| 0.2 μm 尼龙钛滤膜 | Sun Sri | 42204-NN | 低滞留体积，以最小化样品损失 |
| 5 ml 注射器 | BD Biosciences | 309603 | |
| 移液管支架 | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| 银丝 | Warner Instruments | AG10W | 直径 0.25 mm |
| 三轴微操纵器 | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | 操纵器组件如图所示 |
| 微离子电渗电流编程器 | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| 触发装置 | 定制 | custom | 电路设计见补充图1 |
| 不锈钢板 | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | 根据设计要求 |
| 增强型数字相机 | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | 与 Piper 控制软件集成 |
参考文献
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
重印与许可
