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阿尔茨海默病模型小鼠学习与记忆缺陷的莫里斯水迷宫检测

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DOI：

10.3791/2920

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2011年7月20日

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Brain Research Center, University of British Columbia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Morris水迷宫是一种用于检测依赖海马的学习和记忆能力的行为学任务。它已广泛应用于啮齿类动物模型的神经生物学、神经药理学以及神经认知障碍研究中。

摘要

莫里斯水迷宫（MWM）由神经科学家 Richard G. Morris 于1981年首次建立，用于检测依赖海马的学习能力，包括空间记忆的获得和长期空间记忆1。MWM 是一种相对简单的实验程序，通常包括为期六天的测试，其主要优势在于能够区分空间记忆（隐藏平台）与非空间记忆（可见平台）条件2-4。此外，MWM 的测试环境可减少气味轨迹的干扰5，因此该任务被广泛应用于空间学习与记忆的神经生物学和神经药理学研究。MWM 在验证阿尔茨海默病等神经认知障碍的啮齿类动物模型中发挥着重要作用6, 7。在本实验方案中，我们讨论了在阿尔茨海默病转基因模型小鼠中常用的 MWM 测试学习与记忆的典型操作流程及数据分析方法。

方案

1. 准备

  1. 设备准备
    1. 准备一个直径为150 cm、深度为50 cm的圆形水池（图1）。若使用黑色小鼠，则应采用白色水池；若使用白色小鼠，则应采用黑色水池。
    2. 布置房间，确保在测试过程中被测试动物无法看到实验操作者。可通过使用帘子或房间隔板实现。
    3. 在房间内放置高对比度的空间线索，和/或在水池内壁上放置位于水面以上位置的视觉提示。
    4. 在水池中放置一个直径为10 cm的平台——白色水池使用白色平台，黑色水池使用透明有机玻璃平台。向水池中注水，使平台顶部高出水面1 cm。让水温平衡至室温（22 °C）。根据初始水温，此过程可能需要一至三天；也可加入热水以加快平衡过程。
  2. 软件准备
    1. 在计算机软件中对水池进行校准，以便摄像头能够将基于像素的信息转换为实际物理距离信息。将水池划分为四个象限。将平台所在区域设为可变区域，以便每次实验可更改位置。设置5个平台子区域——每个象限各一个，另加水池中心一个。保存校准设置，并在后续测试日中持续使用。（参见示例图2）。
    2. 将单次实验最长时间设为60秒。若小鼠在此前找到平台，应设置软件在小鼠到达平台时自动终止实验。
    3. 设置程序在实验人员离开测试区域时自动开始轨迹追踪。使用软件包提供的任何“减少反射”功能选项。
    4. 记录运动路径长度、逃逸潜伏期以及在每个象限中停留的时间。

2. 第1天：可见平台

  1. 计算机程序
    1. 将水迷宫校准信息载入追踪软件中。
    2. 设置5次试验，试验间间隔应符合实验需求。编程设定每次试验中平台位置和起始方向均不同。参见表1中的示例方案。
  2. 测试流程
    1. 将小鼠从饲养环境转移至行为实验房间。将小鼠置于无法看到水池或空间线索的区域。在开始测试前，让小鼠适应新环境至少30分钟。
    2. 在平台上放置一个标志物以增加其可见性。
    3. 开始测试时，用镊子夹住小鼠尾根部将其从笼中提起。在将其带至测试区域时用手支撑小鼠。以尾根部提起小鼠，轻柔地将其面朝水池边缘放入水中，随后迅速离开测试区域。
    4. 如果小鼠在60秒截止时间前找到平台，允许其在平台上停留5秒，然后将其放回原笼。如果小鼠未能找到平台，则将其放置于平台上，并让其停留20秒后再放回原笼。
    5. 对所有小鼠重复上述操作。每次后续试验均应按照软件设定，使用不同的平台位置和起始方向。
    6. 测试完成后，将小鼠送回饲养设施。在返回动物房前，需将小鼠擦干并确保其体温恢复正常。
    7. 为准备次日实验，从平台上移除标志物，并向水池中添加额外的水，使平台完全淹没至水面以下1 cm处。

3. 第2-5天：隐藏平台

  1. 计算机程序
    1. 将泳池校准数据载入追踪软件中。
    2. 设置5次试验，试验间间隔应符合实验需求。编程设定平台位置在所有试验和测试天数期间保持不变，但每次试验的起始方向每天均有所不同。
  2. 测试流程
    1. 对于黑色小鼠，向泳池中加入无毒的白色粉末状广告颜料，并充分混匀。加入足量颜料，确保水面以下的平台无法从水面可见。对于白色小鼠，应使用黑色泳池、清水以及透明的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）平台。
    2. 执行步骤 2.2.3 至 2.2.6。

4. 第6天：探针试验

  1. 计算机程序
    1. 将水迷宫校准数据载入追踪软件中。
    2. 创建一个无平台区域的试验，并设定一个起始方向。优先选择距离第2至第5天所用平台象限最远的起始方向。将试验时长设为60秒。
  2. 测试流程
    1. 从水迷宫中移除平台。
    2. 按照步骤2.2.3至2.2.6进行操作。

5. 数据分析

  1. 对每一天的每只小鼠，将5次试验的结果取平均值，得到每个测试对象的单一路径长度和逃避潜伏期。适当地计算综合误差。对于第6天，仅需收集每只小鼠的路径长度、逃避潜伏期以及在目标象限停留的时间。
  2. 如果在第1天各组之间存在差异，则可能是视力问题，而非学习与记忆能力的问题。只有在第1天未观察到组间差异的情况下，才继续进行后续分析。
  3. 使用适用于您数据集的统计方法比较第2至第5天的学习曲线。曲线越陡峭，表示任务掌握速度越快；曲线越平缓，表示任务掌握存在缺陷。第2天至第5天的数据采用重复测量方差分析（ANOWA）进行分析。
  4. 对于第6天，使用适用于您数据集的统计方法比较小鼠在先前学习到的目标象限中停留时间所占的百分比。在目标象限停留时间百分比越高，表明记忆保持水平越高。

6. 代表性结果

我们采用 Morris 水迷宫实验来研究缺氧对阿尔茨海默病（AD）发病机制的影响（7），以及丙戊酸（VPA）在转基因 AD 模型小鼠中治疗 AD 的药理潜力（6）。图 3 是我们在关于 VPA 对 APP23 AD 小鼠模型记忆缺陷影响的研究中报道的代表性结果（6）。在第 1 天（可见平台试验）中，VPA 处理组与对照组在逃避潜伏期（图 3A）和路径长度（图 3A）上均无差异，表明两组小鼠具有相似的运动能力和视觉功能。据此我们推断，小鼠能够看到带有标志的平台以及周围环境中的提示线索，并具备正常的游泳能力。在第 2 至第 5 天（隐藏平台试验的第 1 至第 4 天），结果显示两组在逃避潜伏期（图 3C）和路径长度（图 3D）上存在差异，提示 VPA 处理组小鼠随时间推移表现显著优于对照组。最后一天（第 6 天）的探针试验结果表明，与对照组相比，VPA 处理组小鼠进入此前放置隐藏平台的第三象限的次数显著增加（图 3E）。这些数据表明，VPA 治疗可显著改善 APP23 小鼠中出现的记忆缺陷。

水置换实验装置；用于流体动力学研究的圆柱形水箱。
图1. 莫里斯水迷宫可见平台测试日的设备设置。 使用房间隔板将水池与实验人员隔开。空间线索位于墙壁上，也可根据需要放置在水池内壁、水面以上。水池中注满清水，平台位于水面以上1 cm处。平台上放置了旗帜以增强可见性。

培养皿分析软件界面；图像显示微生物生长测量装置。
图 2. Any-Maze™ 视频追踪系统屏幕截图，展示水池校准过程。 水池由一台带 RTV24 数字转换器的黑白模拟追踪摄像头从上方拍摄。软件中定义了多个区域，整个水池被划分为四个象限。另设有一个平台区域，该区域在不同试验中位置可变，共有五个可能位置：西北（NW）、东北（NE）、西南（SW）、东南（SE）或中心（Center）。添加了一条穿过中心的带刻度线（标线），以便软件将像素距离转换为实际物理距离。

行为实验结果；柱状图、折线图比较对照组与VPA组在逃避潜伏期和路径长度上的差异。
图3. 莫里斯水迷宫实验的代表性结果。 携带人源瑞典突变型APP基因的7月龄APP23转基因小鼠在接受每日丙戊酸（n=30只）或溶剂对照溶液（n=30只）注射一个月后进行检测。 （A） 在可见平台测试的第一天，VPA处理组与对照组APP23小鼠逃至可见平台的潜伏期相似。>0.05，通过学生t检验。 (B) VPA处理组与对照组APP23小鼠在可见平台测试中逃至平台前的游泳距离相似。>0.05，通过学生t检验。 (C) 在隐藏平台测试中，经VPA处理的APP23小鼠找到隐藏平台的逃逸潜伏期在第3天显著缩短rd 和 4th 天，P<0.001（通过ANOVA分析）。 (D) 经VPA处理的APP23小鼠在第3天逃至隐藏平台前的游泳路径更短rd 和 4th 天，P< 0.01，通过方差分析（ANOVA）。 (E) 在第6天的探针试验中，VPA处理的APP23小鼠进入先前隐藏平台所在第三象限的次数显著多于对照组。* P<0.005，经学生t检验。（改编并重印自 实验医学杂志 205，2781-2789，2008，洛克菲勒大学出版社，最初发表于《实验医学杂志》doi:10.1084/jem.20081588。（6）

 第1天第2天第3天第4天第5天第6天
 平台位置起始方向平台位置：西南（SW） 起始位置如下： 无平台。
试验1SWSWNNEN
试验2NWNSWES 
试验3NESNEWW 
试验4中心EEWSE 
试验5SEWSSNN 

表1. 水迷宫实验方案示例*
* 注意在第1天，平台位置和起始方向均发生变化；而在第2至第5天，平台位置保持不变，仅起始方向改变。第6天不放置平台，仅进行一次试验。第6天的起始方向距离先前平台位置最远（西南方向），以确保小鼠在进入先前习得的平台象限前需游过一定距离。

讨论

年龄、性别、物种和品系差异会影响小鼠在莫里斯水迷宫（MWM）中的表现（8）。研究表明，老年小鼠在MWM中的表现较差，而雄性啮齿类动物的表现优于雌性；此外，小鼠比大鼠更容易出现漂浮行为（9, 10）。因此，所有实验中应尽量使这些因素保持一致。另有证据表明，处于应激状态的动物在MWM中表现更差（11），因此应监测并控制可能引起应激的环境因素，如温度、光照和噪音，确保任务期间条件恒定。

披露

所有实验均按照英属哥伦比亚大学动物护理与使用委员会以及加拿大卫生研究院指南进行。

致谢

本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、汤森家族以及杰克·布朗和家族阿尔茨海默病研究基金会（资助对象：W. S.）的支持。W. S. 担任加拿大阿尔茨海默病研究讲席。P.L. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会亚历山大·格雷厄姆·贝尔博士研究生奖学金以及迈克尔·史密斯健康研究基金会高级研究生奖学金的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AnyMaze 视频追踪系统Stoelting 公司
水彩颜料Reeves Poole 集团白色，粉末状

参考文献

  1. Morris, R. G. M. Spatial localization does not require the presence of local cues. Learning and Motivation. 12, 239-260 (1981).
  2. O'Keefe, J. A review of the hippocampal place cells. Prog Neurobiol. 13, 419-439 (1979).
  3. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20, 11-21 (1957).
  4. Eichenbaum, H., Stewart, C., Morris, R. G. Hippocampal representation in place learning. J Neurosci. 10, 3531-3542 (1990).
  5. Block, F. Global ischemia and behavioural deficits. Progress in Neurobiology. 58, 279-295 (1999).
  6. Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
  7. Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. , 18727-18732 (2006).
  8. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
  9. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning. Int J Neurosci. 48, 29-69 (1989).
  10. Lipp, H. P., Wolfer, D. P. Genetically modified mice and cognition. Curr Opin Neurobiol. 8, 272-280 (1998).
  11. Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural Plast. 6, 41-52 (1998).

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