我们介绍了农杆菌介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）实验在棉花中的详细操作流程。采用源自烟草脆裂病毒（TRV）的VIGS载体，诱导棉花GrCLA1基因（Cloroplastos alterados 1）的RNA沉默。在接种后2周内的苗期即可观察到由GrCLA1基因沉默引起的白化表型。
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摘要
摘要
棉花（Gossypium hirsutum）是全球最重要的农作物之一。在新品种的分子育种方面已开展了大量工作。然而，由于棉花基因组庞大、存在基因重复和多倍体现象、生长周期较长以及遗传转化困难1，其大规模基因功能研究进展落后于大多数现代植物物种。为了促进棉花中高通量的功能遗传学/基因组学研究，我们致力于开发快速高效的瞬时转化实验体系，以评估棉花基因功能。
病毒诱导的基因沉默（Virus-Induced Gene Silencing, VIGS）是一种基于宿主转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS）机制而开发的强大技术，用于抑制病毒增殖2,3农杆菌介导的VIGS已成功应用于多种双子叶植物物种，例如 茄科，拟南芥 以及豆科物种和包括大麦、小麦和玉米在内的单子叶植物物种，用于多种功能基因组学研究3,4由于这种快速高效的方法无需植物转化且能克服功能冗余问题，因此特别适用于棉花等难以进行转化的作物物种的功能基因组学研究。
在本研究中，我们报道了农杆菌介导的棉花病毒诱导基因沉默（VIGS）系统的详细实验方案。在多种病毒VIGS载体中，烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）可侵染多种宿主植物，能够在整株植物中高效扩散，同时仅引起轻微的症状5。为监测基因沉默效率，选用GrCLA1作为目标基因，该基因为 拟南芥叶绿体变异1 基因AtCLA1在棉花中克隆并插入VIGS双元载体pYL156。 CLA1 基因参与叶绿体发育6，且先前的研究表明功能缺失 AtCLA1 在真叶上导致白化表型7，为沉默效率提供了良好的可视化标记。在转染后约两周 农杆菌 浸润后，白化表型开始在真叶上显现，所有重复实验中基因沉默效率均达到100%。内源基因表达的沉默也通过RT-PCR分析得到验证。值得注意的是，该沉默效应在我们测试的所有棉花品种中均能高效发生，包括德克萨斯州多种 commercially grown varieties。这种快速且高效的农杆菌介导的VIGS检测方法为在棉花中进行全基因组水平的大规模基因功能分析提供了极为有力的工具。
方案
1. 培养棉花幼苗
- 将陆地棉（Gossypium hirsutum）品种 Fibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WR 和 Deltapine 90 的种子播种于装有 Metro Mix 700（SunGR, Beavile, WA）的盆中（直径 7 cm）。
- 将盆置于托盘中，用塑料罩盖住，于生长室中保持 23°C、光照强度 120 μE m-2 S-1、光周期为 12 小时光照/12 小时黑暗的条件下培养。
- 当两片子叶完全长出后，移去塑料罩。
- 约两周后，选取具有两片完全展开子叶的植株进行 VIGS 检测。此阶段真叶尚未出现（图 1）。
2. 构建携带 GrCLA1 基因的 VIGS 载体
- 以雷蒙德氏棉（G. raimondii）叶片组织的cDNA文库为模板，使用引物GrCLA1-F（5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3'）和GrCLA1-R（5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3'）通过PCR扩增棉花Cloroplastos alterados 1基因（GrCLA1）。
- 用EcoRI和KpnI酶切GrCLA1的PCR产物，并通过连接....
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讨论
VIGS 已被证明是通过瞬时敲低内源基因表达来进行功能基因组学分析的有力工具。在本研究中，我们利用基于 TRV 的双元载体开发了一种农杆菌介导的 VIGS 方法。棉花的 CLA1（GrCLA1）基因被用作可视化标记以监测基因沉默效率。我们在所有测试品种中均持续获得了 100% 的基因沉默效率，表现为在侵染后约两周开始，真叶上出现白化表型。然而，CLA1 沉默的棉花植株几乎无法发育至纤维或种子阶段，这可能是由于叶绿体发育受到严重缺陷所致。棉花 VIGS 技术的成功建立为开展目的基因的功能缺失研究提供了替代方案，并为即将进入的后基因组时代棉花功能遗传学/基因组学研究奠定了基础8。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 S.P. Dinesh-Kumar 博士和 Yule Liu 博士提供 TRV-VIGS 载体，感谢 Chuck Kenerley 博士、Terry Wheeler 博士、Jim Starr 博士以及拜耳作物科学公司提供棉花种子。本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助 L.S.，美国国立卫生研究院（NIH）资助 P.H.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 滚筒式摇床 | Glas-Col | 099A TC108 | 农杆菌培养 |
| 培养箱 | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | 农杆菌培养 |
| 紫外/可见光分光光度计 | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | 测定OD值 |
| 基因脉冲仪 | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | 电穿孔 |
| 脉冲控制器 | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | 电穿孔 |
| 微量电穿孔比色皿 | Bio-Rad | 165-2081 | 电穿孔 |
| 1 ml 注射器 | BD Biosciences | 30962 | 农杆菌接种 |
| Metro Mix 700 培养基 | SUNGR | SKU# 553001 | 幼苗培养 |
| 陶土花盆 | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | 幼苗培养 |
| MES 一水合物 | USB Corp., Affymetrix | 18886 | 浸润缓冲液 |
| 乙酰丁香酮 | Sigma-Aldrich | D134406 | 浸润缓冲液 |
参考文献
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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