我们介绍了农杆菌介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）实验在棉花中的详细操作流程。采用源自烟草脆裂病毒（TRV）的VIGS载体，诱导棉花GrCLA1基因（Cloroplastos alterados 1）的RNA沉默。在接种后2周内的苗期即可观察到由GrCLA1基因沉默引起的白化表型。
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摘要
摘要
棉花（Gossypium hirsutum）是全球最重要的农作物之一。在新品种的分子育种方面已开展了大量工作。然而，由于棉花基因组庞大、存在基因重复和多倍体现象、生长周期较长以及遗传转化困难1，其大规模基因功能研究进展落后于大多数现代植物物种。为了促进棉花中高通量的功能遗传学/基因组学研究，我们致力于开发快速高效的瞬时转化实验体系，以评估棉花基因功能。
病毒诱导的基因沉默（Virus-Induced Gene Silencing, VIGS）是一种基于宿主转录后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS）机制而开发的强大技术，用于抑制病毒增殖2,3农杆菌介导的VIGS已成功应用于多种双子叶植物物种，例如 茄科，拟南芥 以及豆科物种和包括大麦、小麦和玉米在内的单子叶植物物种，用于多种功能基因组学研究3,4由于这种快速高效的方法无需植物转化且能克服功能冗余问题，因此特别适用于棉花等难以进行转化的作物物种的功能基因组学研究。
在本研究中，我们报道了农杆菌介导的棉花病毒诱导基因沉默（VIGS）系统的详细实验方案。在多种病毒VIGS载体中，烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）可侵染多种宿主植物，能够在整株植物中高效扩散，同时仅引起轻微的症状5。为监测基因沉默效率，选用GrCLA1作为目标基因，该基因为 拟南芥叶绿体变异1 基因AtCLA1在棉花中克隆并插入VIGS双元载体pYL156。 CLA1 基因参与叶绿体发育6，且先前的研究表明功能缺失 AtCLA1 在真叶上导致白化表型7，为沉默效率提供了良好的可视化标记。在转染后约两周 农杆菌 浸润后，白化表型开始在真叶上显现，所有重复实验中基因沉默效率均达到100%。内源基因表达的沉默也通过RT-PCR分析得到验证。值得注意的是，该沉默效应在我们测试的所有棉花品种中均能高效发生，包括德克萨斯州多种 commercially grown varieties。这种快速且高效的农杆菌介导的VIGS检测方法为在棉花中进行全基因组水平的大规模基因功能分析提供了极为有力的工具。
方案
1. 培养棉花幼苗
- 将陆地棉（Gossypium hirsutum）品种 Fibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WR 和 Deltapine 90 的种子播种于装有 Metro Mix 700（SunGR, Beavile, WA）的盆中（直径 7 cm）。
- 将盆置于托盘中，用塑料罩盖住，于生长室中保持 23°C、光照强度 120 μE m-2 S-1、光周期为 12 小时光照/12 小时黑暗的条件下培养。
- 当两片子叶完全长出后，移去塑料罩。
- 约两周后，选取具有两片完全展开子叶的植株进行 VIGS 检测。此阶段真叶尚未出现（图 1）。
2. 构建携带 GrCLA1 基因的 VIGS 载体
- 以雷蒙德氏棉（G. raimondii）叶片组织的cDNA文库为模板，使用引物GrCLA1-F（5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3'）和GrCLA1-R（5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3'）通过PCR扩增棉花Cloroplastos alterados 1基因（GrCLA1）。
- 用EcoRI和KpnI酶切GrCLA1的PCR产物，并通过连接反应将其插入pYL156（pTRV-RNA2）载体中。
- 在含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上筛选克隆，通过限制性内切酶酶切和测序验证重组质粒。
- 通过电穿孔法将质粒转化至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101中，并在28°C的LB液体培养基中恢复培养。在含有LB+卡那霉素（50 μg/mL）+庆大霉素（25 μg/mL）的平板上筛选转化子。细菌可于–80°C条件下保存在25%甘油中，用于长期使用。
3. 进行VIGS接种
- 接种前3天，将携带pYL192 (TRV):RNA1、pYL156 (TRV):RNA2（空载体）和pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 的Agrobacterium tumefaciens 冻存甘油菌株划线接种于含有50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL庆大霉素的LB琼脂平板上。将平板置于28°C培养24小时。
- VIGS侵染前2天，从上述平板中分别挑取各质粒的单菌落，接种至5 mL LB液体培养基中，培养基中添加50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL庆大霉素；将菌液置于28°C、50 rpm转速的滚瓶摇床中过夜培养。
- 将上述菌液转移至含50 mL LB液体培养基的三角瓶中，培养基中添加50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL庆大霉素，以及10 mM MES（2-(4-吗啉代)乙磺酸）和20 μM乙酰丁香酮。将菌液置于28°C、50 rpm摇床中过夜培养。
- 次日，以4000 rpm离心5分钟收集农杆菌细胞；用侵染缓冲液（含10 mM MgCl2、10 mM MES和200 μM乙酰丁香酮）重悬菌体沉淀，并将菌液在600 nm处的OD值调整至1.5。
- 将菌液置于室温下静置3小时。
- 农杆菌侵染前，用25 G针头在棉花子叶的下表面穿刺打孔，注意不要完全穿透子叶。每个子叶区域打1至2个孔（根据组织软硬度决定）（图2）。
- 将pYL192 (TRV):RNA1和pYL156 (TRV):RNA2或pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1 的农杆菌菌液按1:1比例混合；使用1 mL无针注射器，从子叶下表面的伤口处手动注射混合菌液（图3）。
- 用塑料罩覆盖植株，并将侵染后的植株置于室温、弱光条件下过夜培养。
- 将植株转移至生长室，培养条件为23°C、光照强度120 μE m-2 S-1、12小时光照/12小时黑暗的光周期。
注意：植物在23°C或温室条件（25-28°C）下均能进行VIGS实验。当温度相对较低（23至25°C）时，接种更容易，表型也比在较高（28-30°C）或波动温度下更为均一。用罩子覆盖植物也可提高VIGS的效率。
- 在侵染后7~8天观察基因沉默表型。由pYL156 (TRV):RNA2-GrCLA1介导的沉默植株真叶开始表现出白化表型（图4）。用携带pYL156 (TRV): RNA2的农杆菌侵染的植株作为对照。
- 利用从对照和基因沉默棉花植株中提取的RNA，通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测内源基因的表达水平，以验证基因沉默效率。
注意：VIGS处理的植株应置于封闭的隔离条件下培养，实验结束后应将植株进行高压灭菌并妥善处理，因为TRV具有较广的寄主范围，且属于应报告的病原体。
4. 代表性结果：
在用农杆菌混合物进行手部浸润后约两周，由GrCLA1基因沉默引起的白化表型在真叶上明显显现。在超过50株植物的多次实验中，基因沉默效率接近100%。沉默植株在新生叶片上表现出均匀分布且极为显著的白化表型，而在较老的叶片上则呈现嵌合状（图4）。
图1. 一株约两周大的棉花幼苗，具有两片完全展开的子叶，用于农杆菌浸润。
图 2. 使用 25 G 针头在棉花子叶的下表面打微小孔洞，以促进农杆菌浸润。
图 3. 使用无针头注射器通过伤口位点将农杆菌混合液手工浸润注入棉花子叶中
图 4. 在VIGS沉默的棉花植株上出现白化表型。展示了四个品种：A）Fibermax 832；B）Phytogen 480WR；C）Phytogen 425RF；D）Deltapine 90。
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讨论
VIGS 已被证明是通过瞬时敲低内源基因表达来进行功能基因组学分析的有力工具。在本研究中，我们利用基于 TRV 的双元载体开发了一种农杆菌介导的 VIGS 方法。棉花的 CLA1（GrCLA1）基因被用作可视化标记以监测基因沉默效率。我们在所有测试品种中均持续获得了 100% 的基因沉默效率，表现为在侵染后约两周开始，真叶上出现白化表型。然而，CLA1 沉默的棉花植株几乎无法发育至纤维或种子阶段，这可能是由于叶绿体发育受到严重缺陷所致。棉花 VIGS 技术的成功建立为开展目的基因的功能缺失研究提供了替代方案，并为即将进入的后基因组时代棉花功能遗传学/基因组学研究奠定了基础8。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 S.P. Dinesh-Kumar 博士和 Yule Liu 博士提供 TRV-VIGS 载体，感谢 Chuck Kenerley 博士、Terry Wheeler 博士、Jim Starr 博士以及拜耳作物科学公司提供棉花种子。本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助 L.S.，美国国立卫生研究院（NIH）资助 P.H.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 滚筒式摇床 | Glas-Col | 099A TC108 | 农杆菌培养 |
| 培养箱 | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | 农杆菌培养 |
| 紫外/可见光分光光度计 | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | 测定OD值 |
| 基因脉冲仪 | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | 电穿孔 |
| 脉冲控制器 | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | 电穿孔 |
| 微量电穿孔比色皿 | Bio-Rad | 165-2081 | 电穿孔 |
| 1 ml 注射器 | BD Biosciences | 30962 | 农杆菌接种 |
| Metro Mix 700 培养基 | SUNGR | SKU# 553001 | 幼苗培养 |
| 陶土花盆 | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | 幼苗培养 |
| MES 一水合物 | USB Corp., Affymetrix | 18886 | 浸润缓冲液 |
| 乙酰丁香酮 | Sigma-Aldrich | D134406 | 浸润缓冲液 |
参考文献
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
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重印与许可
