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方法文章

新生儿缺氧的生化检测

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DOI：

10.3791/2948

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2011年8月24日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biochemistry, Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Loma Linda University

本文内容

摘要

本文描述了一种检测新生儿缺氧缺血生化标志物的方法。该方法采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）。

摘要

新生儿缺氧缺血的特征是组织灌注不足或全身性缺氧。该状况被认为可导致或加重多种已有明确记载的新生儿疾病，包括神经系统功能障碍1-3。由于氧化磷酸化受阻，三磷酸腺苷（ATP）的生成减少2。为补偿这种能量缺乏状态，含高能磷酸键的分子被降解。这导致腺苷水平升高，随后被进一步降解为次黄嘌呤、黄嘌呤，并最终转化为尿酸。该降解过程的最后两个步骤由黄嘌呤氧化还原酶催化完成。在常氧条件下，该酶以黄嘌呤脱氢酶的形式存在，但在缺氧-再灌注条件下会转化为黄嘌呤氧化酶（XO）4, 5。与黄嘌呤脱氢酶不同，XO在嘌呤降解过程中会产生过氧化氢作为副产物4, 6。这种过氧化氢与其他缺氧期间产生的活性氧（ROS）共同作用，可将尿酸氧化为尿囊素，并与脂质膜反应生成丙二醛（MDA）7-9。大多数哺乳动物（人类除外）具有尿酸酶，可将尿酸转化为尿囊素。然而在人类中，尿囊素只能通过活性氧介导的尿酸氧化反应生成。因此，尿囊素被认为是人类氧化应激的标志物，而在具有尿酸酶的哺乳动物中则不是。

我们描述了采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱-质谱联用法（GCMS）来检测新生儿缺氧缺血生化标志物的方法。大多数检测使用人血。动物血也可使用，但需注意尿酸酶可能产生乙醛酸。早在1963年，嘌呤代谢物就已被关联到缺氧状态，且次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸作为新生儿缺氧生化指标的可靠性已被多位研究者证实10-13。用于定量嘌呤类化合物的HPLC方法快速、可靠且可重复。用于定量氧化应激相对较新标志物——乙醛酸的GC/MS方法改编自Gruber et al7。该方法可避免某些干扰因素，并仅需少量样本。MMDA的合成方法已在其他文献中描述14, 15。基于GC/MS的丙二醛（MDA）定量方法改编自Paroni et al 和 Cighetti et al16, 17。黄嘌呤氧化酶活性通过HPLC定量蝶呤转化为异黄蝶呤的过程进行测定18。该方法被证明具有足够的灵敏度和可重复性。

方案

1. 样本采集与处理

  1. 在冰上保存的6ml K3E EDTA K3管中采集血样。
  2. 采样后2分钟内，在4°C条件下以1500 g离心10分钟。
  3. 将上清液（血浆）转移至1.5ml微量离心管中。
  4. 在4°C条件下以18000 g离心30分钟。
  5. 移取上清液分装至不同的微量离心管中，用于嘌呤（200μl）、尿囊素（50μl）、MDA（100μl）和XO（120μl）分析。注意避免红细胞污染样品。可根据可用血浆总体积，调整用于MDA、XO和嘌呤分析的血浆体积。

2. 准备用于嘌呤和黄嘌呤氧化酶分析的内标物2-氨基嘌呤（2-AP）

  1. 称取 0.01351 g 2-AP，加入 8 ml 已用 2–5 滴 HCl 酸化的水中。如果 2-AP 未溶解，则需添加更多酸。将最终体积定容至 10 ml。
  2. 使用紫外-可见分光光度计测定 2-AP 储备液的实际浓度。（λmax 315，ε 4000）。
  3. 确定 2-AP 储备液浓度后，计算用于嘌呤测定的 1×10-7 mol 2-AP 内标和用于 XO 测定的 1×10-8 mol 2-AP 内标所需的体积。

公式 1：
与稀释计算相关的化学公式，显示目标体积的计算方程。

公式 2：
摩尔浓度计算中所需体积的公式；化学计量，浓度。

  1. 将计算好的体积分装至不同的微量离心管中，并在真空离心浓缩仪中蒸发至干燥。

3. 嘌呤的高效液相色谱测定

  1. 将血浆（200 μl）转移至 Microcon YM-10 离心过滤装置中，在 4°C、14000 g 条件下离心 1.5 小时。
  2. 弃去滤液，并将其转移至含有 1×10-7 mol 2-AP 的微量离心管中。务必记录加入含 2-AP 微量离心管中的滤液体积。涡旋振荡样品 10–20 秒。
  3. 使用高效液相色谱（HPLC）分析样品。每个样品进样三次，每次 50 μl。样品注入配备 Supelguard LC-18-S 保护柱的 Supelcosil LC-18-S 色谱柱（15 cm × 4.6 mm，5 μm）。应采用 表 1 中描述的梯度条件以获得良好的峰分离效果：溶剂 A—水，溶剂 B—甲醇，溶剂 C—50 mM 甲酸铵缓冲液，pH 5.5。
 时间流速 (ml/min)%A%B%C
1 1.000.00.0100.0
216.001.000.00.0100.0
317.001.00100.00.00.0
422.001.00100.00.00.0
527.001.000.0100.00.0
632.001.000.0100.00.0
733.001.00100.00.00.0
838.001.00100.00.00.0
939.001.000.00.0100.0
1045.001.000.00.0100.0

表1. 高效液相色谱法测定嘌呤化合物的溶剂更换。

  1. 测定样品中嘌呤的浓度。根据表2中所述的保留时间和波长，通过测定次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸的峰面积进行定量。测定2-AP的峰面积。计算次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸相对于2-AP的峰面积比值，并利用标准曲线将比值转换为微摩尔浓度（μmol/L）。
 保留时间*实测 λmax*文献报道 λmax19文献报道 εmax19
尿酸~3.5 min288 283 [2]11,500 [2]
次黄嘌呤 ~7.0 min248 248[1]10,800 [1]
黄嘌呤~9.5 min267267 [2]10,200 [2]
2-氨基嘌呤~12.5 min305 314 [2]4,000 [2]

表2. 嘌呤和内标物的典型保留时间及λmax。 *通过高效液相色谱（HPLC）测定，采用等度洗脱条件：50 mM 甲酸铵缓冲液（pH 5.5），流速为1 mL/min。 pH值以[ ]表示。

  1. 所有样品均需进行三份平行测定，但仅当变异系数小于10%时，方可将数值用于后续分析。

4. 尿囊素的气相色谱/质谱测定

  1. 加入50μl 10μM DL-Allantoin-5-13C;1-15在样品采集和处理过程中，向预留的50 μl血浆中加入N（内标），用于尿囊素测定。
  2. 向该血浆溶液中加入100 μl乙腈。
  3. 将混合物涡旋振荡10-20秒，然后在4°C、20,000 g条件下离心10分钟。
  4. 移去上清液，放入GC/MS小瓶中，并在氮气下干燥2.
  5. 干燥后，加入50 μl衍生化试剂 N-叔丁氧羰基丁基二甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）与吡啶（1:1 体积比）混合，盖紧瓶盖，在 50°C 下孵育 2 小时。该衍生化反应可稳定产生 m/z 为 398.0 和 400.0 的可定量峰，分别对应尿囊素和 DL-尿囊素-5-13C;1-15N，分别20.
  6. 使用配备自动进样器的安捷伦科技 GC 6890N 气相色谱仪和 MS 5973 质谱仪分析样品。采用安捷伦 122-5532G 毛细管柱（柱长 25.7 m，内径 0.25 mm）进行化合物分离。以氦气为载气，流速为 1.5 ml/min。进样量为 1 μl 衍生化产物，采用分流模式进样（分流比 20:1，分流流速 29.4 ml/min，总流速 33.8 ml/min）。初始柱温设为 100°C，保持 2 min，随后以 10°C/min 的速率升至 180°C，保温 4 min，再以 20°C/min 的速率升至 260°C，并维持该温度至运行结束。每次样品分析后，用正己烷连续进样 2 次以清洗色谱柱。
  7. 使用选择离子监测模式定量尿囊素，监测尿囊素的398.0 m/z离子和DL-尿囊素-5-的400.0 m/z离子13C;1-15N. 利用已制备的标准曲线，将尿囊素/（重同位素标记的尿囊素）的离子丰度比转换为尿囊素的微摩尔浓度。
  8. 所有样本均设三个重复进行分析，但仅采用变异系数小于10%的数值进行后续分析。

5. 用于 MDA 分析的内标物甲基丙二醛（MMDA）的制备

  1. 在100 ml圆底烧瓶中加入523 μl 3-乙氧基甲基丙烯醛和1477 μl 7 M NaOH。加入搅拌子。
  2. 将烧瓶置于45°C水浴中搅拌，直至反应完全。反应时间约为140分钟。通过每隔10分钟取10 μl液体样品，用50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7）稀释105倍，并使用紫外-可见分光光度计测定吸光度，监测反应进程。当275 nm处的吸光度达到约0.658时，反应完成。随着反应进行，溶液颜色将由黄色变为橙色。
  3. 让反应继续进行额外15分钟。
  4. 向圆底烧瓶中加入5 ml去离子蒸馏水，并将溶液转移至分液漏斗中。再用3 ml水冲洗烧瓶内容物至漏斗中。向分液漏斗中再加入2 ml水。
  5. 用5 ml二氯甲烷萃取溶液3次。每次萃取后弃去有机相。
  6. 第三次萃取后，将水相转移至圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪蒸干至干燥。
  7. 将产物重悬于3 ml乙醇中，并转移至已预先称重的15 ml离心管中。用额外2 ml乙醇冲洗烧瓶，并将洗涤液加入离心管中。
  8. 加入5 ml苯，在温水中孵育直至产物完全溶解，然后立即将离心管置于冰上10分钟。在15000 g离心5分钟，弃去上清液。
  9. 向沉淀物中加入5 ml乙醇和5 ml异丙基醚。通过在温水中孵育并周期性轻轻倾斜离心管使沉淀物溶解。溶解后，将离心管置于冰上10分钟。使用乙醇和异丙基醚重复此重结晶过程2次。过程中可能形成一些不溶的白色块状产物。
  10. 最后一次重结晶步骤后，尽可能除去上清液，并用真空离心浓缩仪干燥所得产物。称量含有合成产物的离心管重量。
  11. 向离心管中加入5 ml水，涡旋混匀，并过滤除去任何残留的固体。
  12. 使用紫外-可见分光光度计测定MMDA的最终浓度。MMDA在50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7）中的λmax为274 nm，摩尔消光系数为29900 M-1cm-1 14。

6. MDA 的 GC/MS 测定

  1. 将0.11 g丁基化羟基甲苯（BTH）加入9 ml乙醇中，定容至10 ml，配制0.5 mM BTH乙醇溶液。随后取10 μl该浓缩溶液加入990 μl乙醇中进行稀释。
  2. 在避光的微量离心管中，将4.92μl苯肼加入995μl水中，配制50 mM苯肼溶液。涡旋混匀。
  3. 在样本采集和处理过程中，向预留用于MDA检测的100μl血浆中加入5μl 10μM MMDA。
  4. 然后向 MMDA/血浆混合物中加入 10μl 0.5mM BTH，随后加入 200μl 1M 枸橼酸钠 pH 4. 该pH值对于样品的正确衍生化至关重要。pH值过高或过低均会导致MDA水平出现偏差。.
  5. 加入去离子蒸馏水，将最终混合物稀释至终体积为480μl。
  6. 加入20 μl 50 mM苯肼溶液，盖紧瓶盖，在25°C下于旋转摇床上孵育30分钟。
  7. 加入1 ml 己烷，涡旋振荡1 min，然后以3000 rpm离心10 min。
  8. 将有机层转移至GC/MS小瓶，通过氮气吹扫将溶液浓缩至100μl2 流
  9. 使用自动进样器在气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）上分析样品。采用安捷伦122-5532G毛细管柱（25.7 m长度，0.25 mm内径）进行化合物分离。以氦气为载气，流速为0.6–0.8 ml/min。进样量为2 μl衍生化产物，采用分流模式（分流比20:1，分流流速23.0 ml/min，总流速27.1 ml/min）。初始柱温设为110°C，保持1 min后以40°C/min的升温速率升至250°C，并维持该温度至运行结束。每次样品分析后，用2次正己烷进样清洗色谱柱。
  10. 使用选择离子监测模式检测 MDA 和 MMDA，监测质荷比分别为 144.00 m/z（MDA）和 158.00 m/z（MMDA）。根据标准曲线将 MDA/MMDA 离子丰度比转换为微摩尔浓度。
  11. 样品需设三个重复，仅使用变异系数小于10%的数值。

7. 黄嘌呤氧化酶的高效液相色谱测定

  1. 黄嘌呤氧化酶功能的检测依赖于对合适底物（生蝶呤）及其产物（异黄蝶呤）水平的灵敏测定。将血浆与底物在0分钟（对照）或4小时条件下孵育，测定孵育依赖性的底物向产物的转化情况。
  2. 向每支试管（0和4小时）中加入240 μl 0.2 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）和4.63 μl 7.083×10-3 M生蝶呤，并在37°C预孵育5分钟。
  3. 通过向每支试管中加入60 μl血浆启动酶促反应。
  4. 立即向对照管（0分钟）中加入300 μl 4% HClO4，而另一组混合物则继续孵育4小时后，再加入300 μl 4% HClO4终止反应。
  5. 加入HClO4后，剧烈振荡试管，然后在4°C、15000 g条件下离心15分钟。
  6. 吸取500 μl上清液，加入20 μl 5 M K2CO3进行中和。剧烈振荡试管，然后在4°C、15000 g条件下再次离心15分钟。
  7. 取350 μl中和后的溶液，加入含有1×10-8 mol 2-AP的微量离心管中。
  8. 使用配备扫描荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC）分析样品。每个样品进样三次，每次50 μl。样品将注入Wacosil 5C-18-200 250 mm × 6.0 mm，5 μm色谱柱，并配备Supelguard LC-18-S保护柱。为获得良好的峰分离与鉴定效果，应采用以下等度洗脱条件：95% 20 mM KPO4缓冲液（pH 2.2）和5%甲醇，流速为1 ml/min。将荧光检测器的激发波长设定为345 nm，发射波长设定为410 nm。
  9. 通过荧光检测器谱图中的峰面积计算生蝶呤和异黄蝶呤相对于2-AP的比值。谱图中的第一个峰（约5分钟）对应2-AP，第二个且最大的峰为生蝶呤，异黄蝶呤峰最后洗脱。
  10. 计算0小时与4小时孵育时间点之间异黄蝶呤/2-AP峰面积比值的差值，并利用该数值根据标准曲线计算XO活性。
  11. 所有样品均需设三个重复进行分析，但仅采用变异系数小于10%的数据。

8. 代表性结果：

高效液相色谱法（HPLC）对嘌呤类化合物进行定量分析的示例如图1A所示。次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸具有特定的保留时间和发射波长，从而可实现嘌呤类化合物的同步定量分析（表2）。当实验操作正确时，各组分应实现良好分离，且色谱峰形尖锐、呈单峰。随后通过标准曲线将这些峰面积转换为浓度，浓度范围见表3。由于本实验的样品处理步骤极少，可能出现的唯一与样品相关的问题是红细胞裂解。若在样品离心前红细胞发生裂解，血浆将呈现橙红色，无法用于缺氧性缺血的评估。嘌呤测定过程中可能遇到的其他问题主要涉及HPLC系统和色谱柱（图1B）。若HPLC系统中存在气泡，保留时间将发生偏移，且系统压力会剧烈波动。若保护柱需要更换，则系统压力将升高，色谱峰变宽，并出现双峰或三峰现象。

 次黄嘌呤 (μM)黄嘌呤 (μM)尿酸 (μM)黄嘌呤氧化酶 ((nmol 产物)/min)丙二醛 (μM)尿囊素 (μM)
足月常氧 1.13-19.3 (64)0.02-3.69 (61)107.20-726.12 (63)2.47x10-6 - 3.92x10-3 (20)0.44-3.76 (53)NA
足月呼吸窘迫1.78-12.59 (27)0.07-11.8 (24)225.40-653.32 (27)0 - 1.03x10-5 (8)0.82-2.73 (24)NA
足月缺氧0.38-31.80 (13)0.11-2.88 (13)235.65-1348.13 (13)1.20x10-5 -236.44 (9)0.95-2.15 (7)NA
早产常氧 1.54-4.39 (9)0.03-1.77 (9)178.92-593.49 (9)2.46x10-5 - 5.44x10-4 (2)0.95-2.74 (8)2.30-5.26 (67)
早产呼吸窘迫3.04-8.04 (2)NA327.56-365.11 (2)NA2.40-3.46 (3)NA

最小值-最大值 (n)

表3. 嘌呤、黄嘌呤氧化酶、丙二醛和尿囊素的代表性浓度范围。

图 2 展示了尿囊素 GC/MS 定量分析的一个示例。图 2。由于衍生化尿囊素和重标记衍生化尿囊素的质荷比已知，可采用选择离子监测模式在质谱中识别这些化合物。若检测操作正确，在相同的保留时间将观察到两个峰：一个对应于尿囊素（398.00 m/z），另一个对应于重标记尿囊素（400.00 m/z）。随后通过标准曲线将这些峰面积转换为浓度，浓度范围见表 3。若检测操作不当，样品未充分衍生化，则可能无法检测到峰，或峰无法准确反映定量结果。再次强调，若红细胞发生裂解，则血浆样本不能用于评估新生儿缺氧缺血性氧化应激水平。

MDA 定量结果与尿囊素相似，但两者的保留时间不同。在约 3.5 分钟的保留时间处可观察到 MDA 的 144.00 m/z 峰，而在约 4 分钟的保留时间处可观察到 MMDA 的 158.00 m/z 峰（图 3）。随后通过标准曲线将这些峰转化为浓度，范围如 表 3 所示。如果实验操作不当或样品未正确进行衍生化处理，在选择 144.00 m/z 和 158.00 m/z 时可能无法观察到任何峰。需要注意的是，若由于口服推注给药或静脉输注脂质导致血浆中脂质过量，血浆将呈现乳白色外观，此时无法用于评估新生儿缺氧缺血性氧化应激水平。

基于高效液相色谱法（HPLC）测定黄嘌呤氧化酶功能的一个示例如图4所示。若实验操作正确，荧光检测器应出现三个峰，分别对应蝶呤（pterin）、异黄蝶呤（isoxanthopterin）和2-AP。通过标准曲线，这些峰可转换为浓度，其范围见表3。在PDA检测器生成的光谱中，也应出现对应于异黄蝶呤和2-AP的峰。若酶活性缺失，则不会观察到对应于异黄蝶呤的峰。由于该实验检测的是酶的功能，样品的反复冻融可能会影响结果。

显示尿酸和嘌呤分离的色谱图；在 λ max 248-305 nm 处的光谱线。
HPLC 色谱图，化合物分离，紫外检测，保留时间，尿酸，黄嘌呤峰。
图 1. 嘌呤类化合物鉴定的 HPLC 谱图。A）若实验操作正确时的代表性结果。B）当 HPLC 系统、色谱柱或保护柱存在问题时的代表性结果。

色谱质谱结果，离子丰度随时间变化，离子398和400的峰分析。
图 2. 用于尿囊素定量的气相色谱/质谱（GC/MS）图谱。 质荷比（m/z）为398.00的离子峰对应尿囊素。质荷比（m/z）为400.00的离子峰对应重标记尿囊素。

色谱图显示在保留时间3.59和4.18分钟处出现离子丰度峰。
图3. MDA定量分析的气相色谱/质谱（GC/MS）谱图。 质荷比（m/z）为144.00的离子峰对应MDA，质荷比（m/z）为158.00的离子峰对应MMDA。

色谱结果；荧光峰；示意图；保留时间；分析物分离分析。
图4. 黄嘌呤氧化酶活性测定的高效液相色谱图。 A) 0分钟孵育时间的代表性结果；B) 4小时孵育时间的代表性结果。注意4小时孵育时间下异黄蝶呤峰（约17分钟处）更高。在荧光光谱中，2-AP在约5分钟时首先洗脱，蝶呤在约10分钟时随后洗脱。

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讨论

本文所述方法可用于评估新生儿缺氧缺血情况。该方案结合了能量（ATP）缺乏、氧化应激、氧化损伤以及酶活性等多类标志物的检测，以全面获取反映缺氧缺血存在与否甚至其严重程度的生化图谱。尽管该方法具有实用价值，但仍存在一些潜在局限性。首先，进行全部检测需要采集约1–2 ml血液以获得足够的血浆。对于成人或儿童而言这并非问题，但在处理新生儿样本时需格外谨慎，尤其是早产儿。我们通过优先选择关键检测项目并在必要时稀释部分样品来应对这一问题。其次，MMDA的合成可能较为困难；然而，可使用氘代MDA作为MMDA的替代物，作为内标使用。

尽管存在这些局限性，所描述的方法在评估新生儿缺氧缺血以及与氧化还原稳态失衡相关的其他疾病方面仍提供了有用的工具。此外，除黄嘌呤氧化酶（XO）外，所有这些生物标志物均可在尿液中检测，从而为监测新生儿提供了一种无创手段。

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致谢

本工作由美国国立卫生研究院 R01 NR011209-03 项目资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 ml K3E EDTA K3 管Fisher Scientific2204061
5702R 离心机Fisher Scientific05413319配备 13&16MM 适配器
1.5 ml 微量离心管USA Scientific, Inc.1615-5599
2-氨基嘌呤Sigma-AldrichA3509
Varian Cary 100 分光光度计Agilent Technologies0010071500
Savant SpeedVacThermo Fisher Scientific, Inc.SC210A-115
微孔离心滤膜装置Fisher ScientificUFC501596
Supelcosil LC-18-S 色谱柱Sigma-Aldrich58931
Supelcosil LC-18-S Supelguard 保护柱及柱套Sigma-Aldrich59629
HPLCWaters
GCMS 小瓶Fisher Scientific03376607
DL-尿囊素-5-13C;1-15NCDN IsotopesM-2307批号 #L340P9
MTBSTFAThermo Fisher Scientific, Inc.48920
吡啶Sigma-Aldrich270970
5973E 气相色谱/质谱检测器 (GC/MSD)Agilent TechnologiesG7021A5975E 气相色谱/质谱仪 (GC/MS) 的部件编号
3-乙氧基甲基丙烯醛Sigma-Aldrich232548
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881
二氯甲烷Sigma-Aldrich270997
苯Sigma-Aldrich401765
二异丙基醚Sigma-Aldrich38270
BHTSigma-AldrichB1378
乙醇Sigma-Aldrich459844
苯肼Sigma-AldrichP26252

参考文献

  1. Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
  2. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
  3. Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
  4. Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
  5. Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
  6. Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
  7. Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
  8. Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
  9. Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
  10. Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
  11. Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
  12. Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
  13. Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
  14. Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
  15. Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
  16. Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
  17. Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
  18. Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
  19. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
  20. Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).

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