慢病毒介导的嗅觉感觉神经元遗传操作与可视化 体内

摘要

我们介绍一种利用慢病毒技术对单个嗅觉感觉神经元轴突及其终末分支进行遗传操作和可视化的方法 体内.

摘要

精确嗅觉环路的发育依赖于嗅觉感觉神经元（OSN）轴突准确投射至嗅球（OB）中的突触靶区。目前对OSN轴突生长与靶向投射的分子机制仍了解甚少。迄今为止，在特定时间范围内调控基因表达并进而对单个OSN轴突及其终末分支形态进行可视化观察仍具有挑战性。为了在特定时间窗内于单细胞水平研究基因功能，我们开发了一种基于慢病毒的技术以调控OSN中的基因表达 体内通过显微注射将慢病毒颗粒递送至嗅觉上皮（OE）中的嗅觉神经元（OSNs）。表达盒随后永久整合到被转导的OSN基因组中。绿色荧光蛋白（GFP）的表达可标记被感染的OSN，并清晰显示其完整形态，包括轴突终末分支。由于显微注射与报告基因检测之间的时间间隔较短，该方法可将基因功能研究聚焦于发育过程中的极窄时间窗口。采用此方法，我们已在注射后仅三天至长达三个月内检测到GFP表达。通过慢病毒显微注射，我们已成功实现基因的过表达以及shRNA介导的基因敲低。该技术可在单细胞水平上提供OSN胞体及轴突的精细形态学信息。 体内，从而允许在嗅觉发育过程中对候选基因功能进行表征。

方案

1. 准备

该操作属于生物安全二级，因此所有以下准备工作均在进行显微注射操作的生物安全柜中完成。

1. 准备并预热37°C水浴垫：将水注入一个塑料储物袋中，密封后放置在已清空的加热块培养箱上。此装置可用于小鼠注射后的恢复。
2. 在生物危害废物容器中加入10%次氯酸钠溶液，体积应足以浸没本实验过程中产生的全部废弃物。
3. 在生物安全柜内准备一个小的敞口培养皿，盛装70%乙醇，另准备一个培养皿盛装灭菌去离子水（ddH2O）。
4. 用70%乙醇喷洒5μL容量的Hamilton注射器及其33号针头（活塞完全拉出），进行表面消毒；反复从乙醇培养皿中吸取并完全排出乙醇至少5次，以完成注射器的灭菌。
5. 通过反复吸取并推出无菌水至少5次，清洗注射器套管。将注射器安全放置于超净台内，静置晾干。
6. 从-80°C冰箱中取出病毒储备液，置于冰上解冻。每只小鼠显微注射需使用2μL病毒原液，滴度为10⁹ 感染单位/mL。慢病毒可从商业渠道获取，或根据已有方案在实验室自行制备（Lois et al., 2002）。
7. 准备一个注射平台，使其高于生物安全柜表面——可使用一个10cm培养皿，并在其上覆盖一张Kimwipe纸巾。
8. 在注射工作站附近放置酒精擦拭巾。

2. 将慢病毒颗粒显微注射至嗅上皮

本方法中进行的所有动物实验均按照IACUC批准的指南操作。所使用的动物模型为Mus musculus品系C57BL/6J，本研究所展示的所有实验均采用该品系。

1. 通过低温麻醉法麻醉新生小鼠：取出一只出生后0至3天（P0-P3）的小鼠，将其置于冰上预先剪开的手套中，持续5分钟，以实现低温麻醉。
2. 在等待小鼠完全麻醉期间，用已灭菌的哈密尔顿注射器吸取2μL病毒原液。
3. 将小鼠放置在注射平台上。轻柔地从耳部向颈部顶端方向牵拉头部皮肤，使鼻腔区域皮肤绷紧，便于注射操作。
4. 将针头从鼻腔顶部穿入，深入皮下约3mm，以到达嗅上皮。每次注射微量注射0.5μL病毒溶液，每侧选择两个注射位点（左右两侧共四个注射点，每只小鼠共需2μL病毒）。各注射位点应彼此错开。为精确定位注射部位，可观察颅骨背侧表面，寻找嗅球轮廓的投影。出生时因皮肤和颅骨半透明，该轮廓隐约可见。每侧进行两次注射：第一次注射位于嗅球轮廓前方、中轴线附近；第二次注射位于嗅球轮廓外侧，但针头需向内侧倾斜进针，以便到达位于嗅球腹侧下方的嗅上皮。注意避免穿刺进入嗅球内部！
5. 使用Kimwipe纸巾轻轻吸干从注射部位或鼻孔溢出的残留病毒溶液或血液。立即将使用过的Kimwipe纸巾丢弃至含稀释液体漂白剂的生物危害容器中。
6. 将完成注射的小鼠置于水浴孵育箱中。
7. 对所有待注射小鼠重复步骤1–4，注意每只小鼠需使用约2μL病毒原液。
8. 让小鼠在水浴孵育箱中恢复30分钟，随后将其放回原始育幼笼中。
9. 将使用过的微注射平台、消毒湿巾及其他额外清洁用纸制品丢弃至含液体漂白剂的生物危害废弃物容器中。
10. 按照准备步骤中的方法，通过反复吸入和推出乙醇，再用水冲洗，清洁哈密尔顿注射器。最后让注射器自然晾干。
11. 为获得最大转导效率，可在4小时后重复此操作一次。感染的嗅觉神经元可在细胞全长范围内于短短三天内被观察到。

3. 漂浮的嗅球切片免疫组织化学

1. 在预定时间点处死注射后的小鼠，并用4%多聚甲醛灌注固定组织。解剖取出嗅球（OB），在多聚甲醛中孵育过夜，随后在PBS中含30%蔗糖的溶液中孵育过夜。在干冰上用O.C.T.包埋介质进行包埋。
2. 使用冷冻切片机获取厚度为60μm的冠状面嗅球切片。将切片用5mL 1×PBS（pH 7.4）转移至10cm培养皿中。切片应保持漂浮于PBS中，以使O.C.T.充分溶解。将漂浮的切片连同PBS一起转移至50mL锥形管中。
3. 让切片自然沉降至管底，抽真空去除PBS时注意勿吸走切片。用20mL PBS清洗组织切片，重复沉降和抽真空步骤。用10mL PBS重悬组织，并将漂浮的切片转移至15mL锥形管中用于免疫染色。待切片沉降后，小心抽去PBS上清液而不扰动组织。用含0.3% Triton X-100的1×PBS（pH 7.4）（即PBS-Tx）重悬切片，使去垢剂穿透细胞膜。室温孵育10分钟。吸去上清液，并用PBS-Tx重复孵育两次。
4. 将组织切片在封闭液（含5%马血清的PBS-Tx）中室温孵育2小时。
5. 用PBS-Tx在室温下至少清洗两次，每次15分钟。
6. 在PBS-Tx中配制2mL一抗溶液。本实验所用抗体详见试剂与设备部分。
7. 用一抗溶液替换第二次PBS-Tx封闭洗涤液。将样品置于缓慢摇动平台（约30rpm）上，4°C孵育24–48小时，以确保抗体充分渗透进入60μm厚的漂浮切片中。
8. 孵育结束后，可用移液器小心回收一抗溶液，并于4°C保存，两周内可重复使用最多两次，且染色强度无明显下降。
9. 用PBS-Tx在室温下轻轻旋转洗涤切片三次，每次20分钟。
10. 在PBS-Tx中配制2mL二抗稀释液。抽去最后一次洗涤液，加入二抗溶液至组织切片中。用铝箔包裹染色管外壁以避光，防止荧光染料发生光漂白。将包裹好的管子置于缓慢摇动平台上，4°C过夜孵育。
11. 孵育结束后抽去二抗溶液。用PBS-Tx在室温下洗涤一次，每次20分钟；再用PBS（pH 7.4）额外清洗两次，每次20分钟。使用Fluoromount G将染色后的组织切片封片于载玻片上。
12. 使用荧光显微镜观察染色切片中呈阳性感染的嗅觉感觉神经元（OSN）轴突及其轴突终末。
13. 为构建标记的OSN轴突及终末树突的三维图像，利用共聚焦显微镜沿z轴方向对目标嗅球组织切片（厚度60μm）进行一系列光学切片扫描。
14. 随后可将该Z轴图像序列合并投影，重建出单个标记OSN轴突及其完整终末树突结构的360°旋转视角图像。任一特定旋转角度均可捕获并导出为图像文件（如JPG、TIFF格式），用于二维展示。

4. 代表性结果

利用此处所述方法，我们可通过慢病毒转导嗅觉感觉神经元 体内迄今为止，我们已利用GFP和mCherry荧光报告基因，以及通过免疫细胞化学检测myc标签融合蛋白，对感染的嗅觉感觉神经元（OSNs）进行了可视化。该技术可获得大量感染的OSNs，同时感染呈足够随机分布，从而实现单个神经元的标记，便于进行单细胞形态学分析。通过共聚焦显微镜，可在嗅球（OB）组织切片的天然环境中对轴突及其轴突终末进行成像（图1）。通常，完整的OSN轴突终末分支结构可被完整捕获于一个40-50μm 光学切片。对感染的嗅觉感觉神经元轴突末端进行高倍放大，可对嗅小球层中的轴突分支形态进行详细分析。

图1. 单个嗅觉感觉神经元轴突的轨迹及其终末分支。 A) 一只P7小鼠嗅球的冠状切面，显示嗅神经层（ONL）经OMP免疫染色呈红色，小球层（GL）经OMP和Vglut2双重免疫染色呈灰色。一条表达GFP（绿色）的单个嗅觉感觉神经元轴突在ONL内延伸，并穿入小球结构。B) 轴突终末分支在小球内的形态，由GFP表达清晰显示。Vglut2以灰色共染色，标示出GFP阳性轴突形成终末分支的整个小球区域。C) 嗅上皮（OE）中经慢病毒转染并表达GFP（绿色）的OSN。DAPI染色（蓝色）显示嗅上皮的细胞结构。GFP的表达使得OSN细胞体及其在OE中的细胞突起得以可视化。D) 通过shRNA敲低Rap1GAP2表达的OSN轴突及其终末形态。将携带双表达盒的慢病毒（在小鼠U6启动子下表达Rap1GAP2 shRNA，在CMV启动子下表达GFP）应用于OE。与仅表达GFP的对照组相比，感染后的嗅觉轴突终末表现出更为简化的终末分支结构。比例尺 = 20μm。

讨论

慢病毒显微注射可将基因构建体永久性地转入嗅觉感觉神经元（OSN）的基因组DNA中。该方法使我们能够通过过表达或shRNA介导的基因敲低，对候选基因进行短期或长期的功能操控。此外，我们还可以在现有的转基因小鼠品系中对单个OSN进行荧光标记，以观察气味受体群体的共定位情况。慢病毒转导OSN必须通过显微注射完成。我们曾尝试将慢病毒悬液灌注至鼻腔以实现OSN转导，但未获成功。因此，我们选择通过鼻背表面进行显微注射，将病毒递送至嗅上皮（OE）的内层，即OSN胞体所在的位置。

与已建立的腺病毒操作相比，使用慢病毒具有多种优势。慢病毒转导可整合到基因组中，从而实现长期研究；而腺病毒仅能实现瞬时转染，基因操作的时间窗口有限（Doi et al., 2005）。我们已在显微注射后长达三个月的时间点检测到慢病毒转导的嗅觉感觉神经元（OSNs）。成年啮齿类动物OSNs的寿命通常为1至3个月。因此，慢病毒感染的OSNs可在其生命周期的大部分时间内被观察，从而便于研究OSN轴突生长、突触形成与维持、气味刺激反应以及细胞更替过程。此外，慢病毒还能感染前体细胞，从而实现对OSNs更长时间的可视...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微注射 新生小鼠使用5μHamilton 注射器（Hamilton #7647-01），配备 33 号针头（Hamilton #7762-06）。 免疫细胞化学试剂： 一抗：兔多克隆抗体GFP（Molecular Probes# A-6455），鸡多克隆抗OMP抗体（定制）（Chen et al., 2005），豚鼠多克隆抗VGlut2抗体（Millipore# AB2251）。二抗：Cy2标记的驴抗兔抗体（Jackson Immunolab# 711-225-152），Cy3标记的驴抗鸡抗体（Jackson Immunolab# 703-165-155）和Cy5标记的山羊抗豚鼠抗体（Jackson Immunolab# 106-175-008）。切片用含50 ng/mL DAPI染色质染液的Fluoromount G（Southern Biotech# 0010-01）封片于玻璃载片上。 共聚焦成像： 使用 Olympus Flouview FV1000 共聚焦显微镜采集Z轴层扫图像，并利用 Olympus FV10-ASW 2.01 共聚焦图像采集与分析软件对图像进行收集和处理，生成三维投影。