从部分胰腺切除患者中分离人类胰岛

摘要

用于研究的2型糖尿病胰岛供应不足。本文分享了我们从接受部分胰腺切除术的患者中分离胰岛的实验方案。该方法为获得足量的2型糖尿病患者及临床匹配的非糖尿病受试者的胰岛提供了独特途径，可用于基础与临床研究。

摘要

2型糖尿病发病机制及朗格汉斯胰岛功能障碍的研究 ¹ 由于器官捐献者提供的2型糖尿病胰岛数量有限，相关研究一直受到阻碍²在此，我们分享从接受部分胰腺切除术的2型糖尿病和非糖尿病患者中分离胰岛的实验方案，这些患者的胰腺组织因不同的胰腺疾病（良性或恶性胰腺肿瘤、慢性胰腺炎以及胆总管或十二指肠肿瘤）而被切除。所有参与患者均已签署知情同意书，且本研究已获得当地伦理委员会批准。手术标本立即送至病理科，由病理医师挑选质地柔软、外观健康的胰腺组织用于胰岛分离，同时保留受损组织以供诊断使用。我们发现，若要分离出超过1,000个胰岛，起始胰腺组织量至少需达到2 g。本方案的关键步骤还包括：在注射含酶培养液时应使组织明显膨胀，随后将其切碎，以增大表面积，促进消化。

为了扩大本方案的适用性，以涵盖偶尔可获得大量（>15 g）人胰腺组织的情况，我们使用了Ricordi消化室（50 ml）进行组织消化。在消化过程中，我们手动振荡Ricordi消化室³，振荡强度根据样本的组织纤维化程度进行调整。随后采用不连续Ficoll梯度离心法将胰岛与腺泡组织分离。我们注意到，组织沉淀应足够小，以便能够均匀地重悬于密度为1.125 g/ml的Ficoll培养基中。分离后，我们将胰岛在无应激条件（无振荡或旋转）下，于37 °C、5% CO₂环境中培养至少48小时，以促进其功能恢复。本方案的广泛应用及其未来的优化，有望实现从糖尿病患者及临床匹配的非糖尿病供体中及时获取大量人胰岛，从而极大推动2型糖尿病的研究。

方案

1. 手术室中胰腺组织的采集

1. 外科医生对胰腺进行部分切除。
2. 将胰腺标本置于冰盒中后，立即送至病理科。

2. 胰岛分离的组织选择

1. 病理学家选择质地柔软且健康的组织，保留受损组织用于诊断。纤维化组织以及可用组织量少于 2 g 的标本不用于胰岛分离。
2. 将胰腺组织浸入 Euro Collins 溶液中，并置于冰上运送至实验室。

3. 人胰岛的分离

1. 称取胰腺组织重量，然后将其放入一个10 cm培养皿中。
2. 在500 ml锥形瓶中加入150 ml RPMI培养基。
3. 在250 ml锥形瓶中，将130 ml RPMI培养基与100 mg/ml DNase及20 ml 5 mg/ml Liberase RI混合，配制消化酶溶液。用注射器吸取10 ml该溶液，用于注射胰腺组织。
4. 将消化酶溶液注入胰腺组织，力求使其均匀膨胀。若因纤维化而无法膨胀，则消化可能失败。随后，将组织在冰上切成约4 mm³大小的组织块。

4. 人胰腺消化循环

1. 按照图1所示组装消化回路。Ricordi室中的流体流向为 在 在底部 出 在腔室的顶部。
2. 将剩余的消化酶溶液加入500 ml烧瓶中，直至总体积达到300 ml，并插入温度计。
3. 将胰腺组织转移至腔室中，插入滤网（孔径： 600 μm）和三个氮化硅珠（直径：15 mm），关闭腔室，启动泵并将流速设定为140 ml/min。
4. 当电路的温度达到 37 °C开始计时，并定期取样以确定消化终止时间。使用二苯硫腙（2 mg/ml）染色，可在显微镜下观察消化组织中的胰岛。⁴.
5. 将胰岛从周围腺泡组织中分离后，立即将加热线圈置于冰上以终止消化，并向回路中加入 200 ml 冷洗涤培养基（900 ml RPMI 1640，含 5.5 mM 葡萄糖和 10% FBS）。
6. 将从样品管中流出的胰岛溶液收集至250 ml锥形管中，持续收集直至管路排空。

图1. 人胰腺消化循环系统 人胰腺消化循环系统包括一个含有筛网（孔径：600 μm）和三颗氮化硅弹珠（直径：15 mm）的里科迪室（Ricordi chamber）。蠕动泵（流速：140 ml/min）将液体从室中流出并导入组织收集瓶。箭头表示液体流动方向。通过将加热线圈浸入37 °C水浴中，以维持酶消化所需的适宜温度。

5. 消化后洗涤

1. 将含有胰岛溶液的 250 ml 锥形管在 1000 rpm、4 °C 条件下离心 5 分钟。
2. 弃去上清液，用洗涤培养基（900 ml RPMI 1640，含 5.5 mM 葡萄糖和 10% FBS）重悬胰岛沉淀，并等分至 50 ml 锥形管中。（可选：可分装至更多锥形管以提高洗涤效果。）在 1000 rpm、4 °C 条件下离心 5 分钟。
3. 弃去上清液，通过手动轻轻振荡使沉淀松散。

6. Ficoll 梯度纯化

1. 用密度为1.125 g/ml、pH 7.4的Ficoll介质重悬沉淀，然后缓慢覆盖10 ml等份的密度分别为1.080、1.060和1.037 g/ml的Ficoll介质。
2. 将Ficoll梯度在2400 rpm、4°C条件下离心20分钟。

7. 胰岛的收集与培养

1. 离心后，可通过其在梯度中的分布区分不同的组织组分。
2. 弃去由脂肪和结缔组织构成的上层。
3. 小心收集位于1.037–1.060 g/ml界面处的第一层胰岛聚集体。该层含有纯度最高的分离胰岛。为实现高效分离，应将各组分分别收集。
4. 收集位于1.060–1.080 g/ml界面处的第二层胰岛聚集体，其纯度较低。
5. 通过向每根锥形管中加入洗涤液（900 ml RPMI 1640，含5.5 mM葡萄糖和10% FBS），将Ficoll梯度稀释至总体积50 ml。在4°C条件下以1000 rpm离心5分钟。
6. 用抽吸法弃去上清液。操作时需小心，因Ficoll梯度可能导致沉淀物较松散。
7. 用洗涤液（900 ml RPMI 1640，含5.5 mM葡萄糖和10% FBS）重悬沉淀物，并在4°C条件下以1000 rpm离心5分钟。随后使用胰岛培养基重复洗涤一次。
8. 将胰岛重悬于培养基中，置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育24–48小时，之后进行后续处理。

结果

本方案平均每克胰腺组织可获得约500个胰岛，但不同批次之间差异较大，主要归因于纤维化程度和胶原酶活性的差异。我们首先在组织处理过程中使用二噻嗪（Dithizone）染色，然后在分离后24小时进行手工挑选，由此实现了>90%的胰岛纯度。为评估纯化后胰岛的质量，我们在静态条件下使用25 mM葡萄糖刺激胰岛素分泌2小时进行检测。结果显示，胰岛素分泌水平与来自ECIT胰岛分离与移植中心所获得胰岛的结果相当。由于从部分胰腺切除术获得的胰岛并不用于胰岛移植，因此总胰岛当量（IEQ）的评估不被视为关键因素。

重要的是，我们的方法使我们能够在2005年至2008年间从25例接受部分胰腺切除术的患者中分离出胰岛，用于功能研究⁵。这些胰岛通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，以及Western印迹和免疫组织化学方法分析了特定蛋白的表达。从部分胰腺切除标本中分离的胰岛还可用于比较非糖尿病与糖尿病胰岛的基因和蛋白表达谱、超微结构特征及功能反应。由于接受部分胰腺切除术的患者数量多于器官捐献者，因此本方案有助于收集足够数量的样本和数据，以进行可靠的统计学分析。

讨论

通过我们的方案，可以从部分胰腺切除术获取的胰腺组织中分离出人胰岛。该方案的成功依赖于若干关键步骤的精细操作。为保持β细胞的活性，必须将标本快速冰上运输至实验室。此外，组织消化时间需根据组织纤维化程度及消化液的酶活性进行经验性优化。手动施加于Ricordi腔室的机械力强度亦需如此调整。因此，为获得较高的胰岛得率，本方案最好由专职科研人员或技术助理完成。除非团队已具备胰岛分离经验，初次尝试失败属正常现象。

我们的胰岛分离方案与标准的人胰岛分离方法之间存在几个关键差异：1）尽管我们使用的胰腺组织在手术过程中经历了数小时的缺血，但会立即在现场进行处理。这与来自脑死亡供体用于胰腺/胰岛移植的胰腺组织不同，后者在分配和运送至胰岛分离机构期间会持续缺血数小时。2）我们将胶原酶直接注射到胰腺组织中，而标准方案则是将其灌注至胰管内。3）我们采用不连续的Ficoll梯度分离胰岛，而不是使用COBE细胞处理器从连续的Ficoll梯度中收集胰岛。

当手术标本纤维化程度过高或组织量过少而无法分离出足够数量的胰岛时，仍可通过激光显微切割技术（LCM）¹⁰获取组织。该方法几乎可从所有标本中获得基因表达数据，即使胰岛分离失败或产量极低亦可实现。然而，LCM无法获得可用于功能研究的活细胞，且其获取的组织量通常不足以进行蛋白质组学分析。因此，将LCM与本研究的胶原酶消化方案并行使用，可能是处理手术标本最有效的方法。

在从部分胰腺切除术中采集组织用于胰岛分离时，必须仔细评估患者的临床病史和代谢状态。部分胰腺切除术患者可能患有3c型糖尿病，即继发于导致手术的胰腺疾病所引起的糖尿病⁶。在2010年于我科接受该手术的43例参与患者中，32例为非糖尿病患者，5例患有2型糖尿病，6例患有3c型糖尿病。这些数据与既往研究一致，表明在患有胰腺癌或慢性胰腺炎的患者中，有相当比例存在糖代谢异常和糖尿病⁶。若糖尿病在出现导致胰腺手术症状前至少一年已被诊断，则视为原发性糖尿病⁷。还应检测患者体内针对胰岛自身抗原的抗体水平，以评估糖尿病是否存在潜在的自身免疫病因⁸。由于接受胰腺切除术的患者可能患有未确诊的糖尿病或存在葡萄糖耐受不良，所有非糖尿病患者均应在手术前接受口服葡萄糖耐量试验⁹。