本文介绍了一种研究外毛细胞（OHC）运动反应的可靠方法，包括电致运动、慢运动和弯曲运动。通过外加交变电场刺激引发OHC运动，该方法结合了高速图像记录、基于LED的照明以及最新一代的图像分析软件。
本文内容
摘要
摘要
外毛细胞（OHCs）是位于哺乳动物内耳中耳蜗的听觉器官——柯蒂氏器内的柱状感觉运动细胞。其名称“毛细胞”源于其顶端特有的静纤毛束，这是检测和转导声能的关键结构1。外毛细胞能够在电、机械和化学刺激下发生形变——伸长、缩短和弯曲——这种运动反应被认为是听觉信号在耳蜗内实现放大所必需的关键机制2。
外毛细胞（OHC）的刺激可引发两种不同的运动反应：i）电致运动，又称快速运动，是指由密集排列在外毛细胞质膜上的运动蛋白在电驱动下发生构象改变，从而引起微秒级的长度变化；ii）慢速运动，是指涉及细胞骨架重组的毫秒至秒级的形态变化2, 3。外毛细胞的弯曲运动与电致运动相关，可由侧质膜上运动蛋白的非对称分布，或对这些运动蛋白的非对称电刺激（例如施加垂直于细胞长轴的电场）所导致4。机械和化学刺激主要引发慢速运动反应，尽管细胞及其环境的离子条件变化也可能激活嵌入质膜的运动蛋白5, 6。由于外毛细胞的运动反应是耳蜗放大器的关键组成部分，因此在听觉频率范围（人类约为20 Hz至20 kHz）内对这些运动反应进行定性和定量分析，是听觉研究领域的重要课题7。
结合高速摄像机、基于LED的照明系统以及先进图像分析软件的新型成像技术，现已能够对离体外毛细胞（OHCs）在外加交变电场（EAEF）作用下的运动反应进行可靠且定性与定量的研究8。该方法简单且无创，克服了以往多数研究手段的局限性9-11。此外，基于LED的照明系统具有极高的亮度，且对样品产生的热效应可忽略不计；同时由于采用了视频显微技术，其光学分辨率至少比传统光学显微技术高10倍12。例如，利用本文所述的实验装置，可在10 kHz频率下常规且可靠地检测到细胞长度约20 nm的变化，而在较低频率下，该分辨率还可进一步提高。
我们相信，这种实验方法将有助于加深对耳外毛细胞运动潜在的细胞和分子机制的理解。
方案
1. 外毛细胞的分离
- 从豚鼠、小鼠或您所使用的哺乳动物模型中取出颞骨，开始本实验操作。
- 接着使用锤骨钳打开颞骨，暴露耳蜗，并将其浸入Leibovitz L-15培养基中。小心去除多余的骨组织，同时保持骨性外壳完整。尽管该操作是适用于所有哺乳动物颞骨的通用方法，但在处理体型极小的动物颞骨时，可能需要对技术细节进行微调。在老年动物中，鼓室通常已发生钙化，这会为操作带来额外困难。
- 在显微镜下观察，打开耳蜗的顶端区域，使用#11手术刀片尖端、微型尖头挑针和精细镊子去除血管纹和螺旋韧带。
- 用镊子将柯蒂氏器从耳蜗蜗轴上分离，并置于含1 mg/ml胶原酶的L-15培养基中，室温孵育5分钟。
- 若需要获取耳蜗基底回的外毛细胞，先用挑针去除覆盖耳蜗基部的骨性外壳，再用手术刀片将螺旋结构从颞骨分离，然后取出柯蒂氏器。
- 使用50 μL Hamilton注射器将柯蒂氏器转移至记录室。随后通过针头反复回流以实现细胞解离。
2. 实验设置
- 外部交变电场（EAEF）发生器及其与图像采集系统连接的示意图（图1）。控制电路由House Ear研究所工程核心部门专门设计实现。
- 本实验所用装置包括一台Axiovert 135TV倒置显微镜（Zeiss，Thornwood，NY），配备基于LED的替代照明系统（High Power LED System-36AD3500，Lightspeed Technologies，Campbell，CA）、两个电子显微操作器（Eppendorf "Patchman"，德国）、一台由PC控制的超高速Photron Fastcam X 1024 PCI相机（Photron USA Inc.）安装在Keller端口，以及另一台常规CCD相机安装在三目端口。Fastcam相机能够以高频率（最高达100,000 fps）和高分辨率（例如1024 x 1024像素@1,000 fps，512 x 128@10,000 fps，384 x 96@18,000 fps等）采集图像。高速相机获取的图像可直接在PC显示器上观察，而CCD相机则连接至另一台独立显示器。基于LED的照明系统具有两种工作模式：低功率模拟模式和高功率数字模式。所有初步操作（如电极定位、细胞定位、调焦等）均在低功率模拟模式下完成。高功率照明通过相机快门开启而启动，并在快门关闭时关闭，以利于热量散发。运行在同一PC上的自研软件（同样由House Ear研究所工程核心部门开发）控制高速相机、LED照明系统以及EAEF的触发。前部端口配备的传统数码相机可根据需要拍摄静态图像（图2 A）。
- 电极（两根直径为0.25 mm的银丝，尖端间距0.8 mm）通过其中一个电子显微操作器进行定位。电极位置通过视觉和显微图像实时监测；当图像焦平面发生变化时，表明电极已接触实验腔室底部。初始阶段，使用外部电极对电场进行校准。该电极测量不同位置的电势，生成电场的“分布图”。若将单个孤立的外毛细胞置于电极尖端之间，并使其长轴与施加的EAEF方向平行，则细胞将以与电场相同频率发生伸长和缩短运动。若细胞垂直于电场方向放置，则可观测并研究另一种类型的外毛细胞反应（弯曲运动）（图2 B）。
3. EAEF 刺激与图像采集
- 可选择四种不同的刺激方案（图 3）：
- 连续单频刺激（图 3 A）。注意，可通过自制控制软件选择刺激模式、频率、幅度和波形类型（红色圆圈所示）。
- 脉冲串单频刺激（图 3 B）。脉冲串的持续时间以及脉冲串之间的间隔时间也可选择。
- 线性扫描刺激（图 3 C）。可选择起始频率和终止频率。
- 多模式刺激（图 3 D）。可在单次实验中组合使用单频刺激和线性扫描刺激。选择相应参数后，控制软件将配置系统，并允许操作者通过点击计算机屏幕上的一个按钮，启动与光刺激同步的视频记录和细胞刺激。
- 图像以 AVI 格式采集，用于后续高频分析。
4. 代表性结果
- 在本视频中，两个分离的外毛细胞在受到平行或垂直于其长轴的外部交变电场刺激时，分别表现出长度或曲率的变化。（视频 #2）。
- 使用 ProAnalyst 软件（Xcitex Inc., Cambridge, MA）对离体外毛细胞的运动反应进行离线分析。该软件中的“特征追踪”（Feature Tracking）功能可逐帧提供两点之间的距离（图4）。当细胞缩短时，选在细胞顶端（顶膜板；红色）和基部（基极；绿色）的两点间距离减小，而细胞伸长时该距离增大。视频展示了软件逐帧分析长度变化的过程。图像底部的面板显示了运动轨迹。在此示例中，长度的总变化约为 6.5 像素。
- ProAnalyst 软件中的“轮廓追踪”（Contour Tracking）功能可识别细胞边缘，并自动测量光学切片的面积（图5）。
- 将聚苯乙烯微球加入灌流溶液后，它们会随机且牢固地附着在细胞质膜上（图6A）。可同时选择不同的微球，软件能够逐帧自动追踪所有被选微球。通过这种方式，可将细胞划分为多个区段，并独立评估每个区段的运动性（图6A）。
- 通过选择位于细胞图像侧缘的微球，还可独立评估各节段的长度变化以及一个节段相对于另一个节段的角度变化（弯曲）（图6B）。
图1. 电声流发生器及其与图像采集系统连接的示意图。
图2. A) 实验装置的照片。B) 显微镜载物台的细节图，插图展示了电极以及位于两电极之间、其长轴与电场方向平行的单个OHC。
图3. A) 用于单频刺激的自制控制软件用户界面，所选参数以红色圆圈标出。B) 用于脉冲单频刺激的自制控制软件用户界面。C) 用于线性扫描刺激的自制控制软件用户界面。D) 用于多刺激模式的自制控制软件用户界面。
图 4. 使用 ProAnalyst 软件的“特征追踪”功能，在一个外毛细胞的基部（绿色）和顶端（红色）分别选取两个点的单帧图像。细胞下方的曲线显示了在电刺激作用下，所选两点间距离的周期性变化。移动垂直标线可选择不同的帧进行单独分析。
图 5. ProAnalyst 中的“轮廓追踪”功能可检测细胞边缘，并自动测量光学切片的面积。
图6. A) 分离的外毛细胞（OHC）表面附着聚苯乙烯微球的捕获图像（上图），以及同一图像中五个微球被分别选中的情况（下图）。每个微球被赋予不同颜色，其位移可逐帧自动独立追踪、分析和比较。B) 通过选择位于细胞边缘的聚苯乙烯微球，可定义任意长度的线段，利用图像分析软件可逐帧自动评估这些线段的长度变化，以及一个线段相对于其他线段的方向变化（即细胞弯曲）。
视频 1. 豚鼠外毛细胞的分离。点击此处观看视频
视频 2. 与外耳道电场方向平行和垂直的外毛细胞，显示典型的电致运动性和弯曲反应。点击此处观看视频
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讨论
本文介绍的实验方法能够在 kHz 频率范围内评估外毛细胞（OHC）的运动反应，且对细胞运动无任何限制。通过采用不同的刺激方案、添加标记物（如微球），以及改变细胞相对于电场的方向，可深入探究外毛细胞运动的新特征，其细节水平是以往方法无法达到的。其他方法，例如使用光电二极管9或激光多普勒测振技术10，均需严格控制细胞的位置。而本方法则不同，所有测量均在属于同一细胞的点之间进行，每个位移仅与细胞形状的变化相关，而不受细胞相对于外部参考系整体移动的影响。此外，还可方便地获得外毛细胞横截面积的可靠测量结果，从而实现对外毛细胞体积快速变化的估算。同时，随着更快、更灵敏的相机和更先进的图像分析软件的持续发展，该方法的质量将不断得到提升。该技术的一个不足之处在于无法控制细胞膜上的跨膜电位，但这一局限性同样存在于当前所有用于评估 kHz 频率范围内外毛细胞运动的方法中。
因此，本文所述方法可能是听力研究中的一个重要工具，能够为揭示外毛细胞运动反应的细胞和分子机制提供新的重要线索
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目R01DC10146/R01DC010397、NIDCD P30 DC006276研究核心以及HEI支持。其内容仅由作者负责，不代表NIH或HEI的官方观点。作者声明不存在现有或潜在的利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies 公司 GIBCO 产品 | 21083 | |
| 胶原酶（IV型） | Sigma-Aldrich | C5138 | 在L-15中浓度为1mg/mL |
参考文献
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
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