结合外加交变电场刺激与高速图像分析研究外毛细胞运动性

摘要

本文介绍了一种研究外毛细胞（OHC）运动反应的可靠方法，包括电致运动、慢运动和弯曲运动。通过外加交变电场刺激引发OHC运动，该方法结合了高速图像记录、基于LED的照明以及最新一代的图像分析软件。

摘要

外毛细胞（OHCs）是位于哺乳动物内耳中耳蜗的听觉器官——柯蒂氏器内的柱状感觉运动细胞。其名称“毛细胞”源于其顶端特有的静纤毛束，这是检测和转导声能的关键结构¹。外毛细胞能够在电、机械和化学刺激下发生形变——伸长、缩短和弯曲——这种运动反应被认为是听觉信号在耳蜗内实现放大所必需的关键机制²。

外毛细胞（OHC）的刺激可引发两种不同的运动反应：i）电致运动，又称快速运动，是指由密集排列在外毛细胞质膜上的运动蛋白在电驱动下发生构象改变，从而引起微秒级的长度变化；ii）慢速运动，是指涉及细胞骨架重组的毫秒至秒级的形态变化^{2, 3}。外毛细胞的弯曲运动与电致运动相关，可由侧质膜上运动蛋白的非对称分布，或对这些运动蛋白的非对称电刺激（例如施加垂直于细胞长轴的电场）所导致⁴。机械和化学刺激主要引发慢速运动反应，尽管细胞及其环境的离子条件变化也可能激活嵌入质膜的运动蛋白^{5, 6}。由于外毛细胞的运动反应是耳蜗放大器的关键组成部分，因此在听觉频率范围（人类约为20 Hz至20 kHz）内对这些运动反应进行定性和定量分析，是听觉研究领域的重要课题⁷。

结合高速摄像机、基于LED的照明系统以及先进图像分析软件的新型成像技术，现已能够对离体外毛细胞（OHCs）在外加交变电场（EAEF）作用下的运动反应进行可靠且定性与定量的研究⁸。该方法简单且无创，克服了以往多数研究手段的局限性^9-11。此外，基于LED的照明系统具有极高的亮度，且对样品产生的热效应可忽略不计；同时由于采用了视频显微技术，其光学分辨率至少比传统光学显微技术高10倍¹²。例如，利用本文所述的实验装置，可在10 kHz频率下常规且可靠地检测到细胞长度约20 nm的变化，而在较低频率下，该分辨率还可进一步提高。

我们相信，这种实验方法将有助于加深对耳外毛细胞运动潜在的细胞和分子机制的理解。

方案

1. 外毛细胞的分离

1. 从豚鼠、小鼠或您所使用的哺乳动物模型中取出颞骨，开始本实验操作。
2. 接着使用锤骨钳打开颞骨，暴露耳蜗，并将其浸入Leibovitz L-15培养基中。小心去除多余的骨组织，同时保持骨性外壳完整。尽管该操作是适用于所有哺乳动物颞骨的通用方法，但在处理体型极小的动物颞骨时，可能需要对技术细节进行微调。在老年动物中，鼓室通常已发生钙化，这会为操作带来额外困难。
3. 在显微镜下观察，打开耳蜗的顶端区域，使用#11手术刀片尖端、微型尖头挑针和精细镊子去除血管纹和螺旋韧带。
4. 用镊子将柯蒂氏器从耳蜗蜗轴上分离，并置于含1 mg/ml胶原酶的L-15培养基中，室温孵育5分钟。
5. 若需要获取耳蜗基底回的外毛细胞，先用挑针去除覆盖耳蜗基部的骨性外壳，再用手术刀片将螺旋结构从颞骨分离，然后取出柯蒂氏器。
6. 使用50 μL Hamilton注射器将柯蒂氏器转移至记录室。随后通过针头反复回流以实现细胞解离。

2. 实验设置

1. 外部交变电场（EAEF）发生器及其与图像采集系统连接的示意图（图1）。控制电路由House Ear研究所工程核心部门专门设计实现。
2. 本实验所用装置包括一台Axiovert 135TV倒置显微镜（Zeiss，Thornwood，NY），配备基于LED的替代照明系统（High Power LED System-....

讨论

本文介绍的实验方法能够在 kHz 频率范围内评估外毛细胞（OHC）的运动反应，且对细胞运动无任何限制。通过采用不同的刺激方案、添加标记物（如微球），以及改变细胞相对于电场的方向，可深入探究外毛细胞运动的新特征，其细节水平是以往方法无法达到的。其他方法，例如使用光电二极管⁹或激光多普勒测振技术¹⁰，均需严格控制细胞的位置。而本方法则不同，所有测量均在属于同一细胞的点之间进行，每个位移仅与细胞形状的变化相关，而不受细胞相对于外部参考系整体移动的影响。此外，还可方便地获得外毛细胞横截面积的可靠测量结果，从而实现对外毛细胞体积快速变化的估算。同时，随着更快、更灵敏的相机和更先进的图像分析软件的持续发展，该方法的质量将不断得到提升。该技术的一个不足之处在于无法控制细胞膜上的跨膜电位，但这一局限性同样存在于当前所有用于评估 kHz 频率范围内外毛细胞运动的方法中。

因此，本文所述方法可能是听力研究中的一个重要工具，能够为揭示外毛细胞运动反应的细胞和分子机制提供新的重要线索

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leibovitz’s L-15	Life Technologies 公司 GIBCO 产品	21083
胶原酶（IV型）	Sigma-Aldrich	C5138	在L-15中浓度为1mg/mL