本文介绍了对小鼠或大鼠进行基本尸体解剖的操作步骤，以及采集基本器官和较难获取的样本类型，用于组织学、微生物学和PCR评估。
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本文内容
摘要
摘要
从安乐死动物身上可采集多种样本类型，以帮助诊断或发现动物群体中的感染性病原体。正确采集组织用于后续组织学处理，可能影响检测结果的质量。本文介绍了基本的大体检查操作，包括识别心脏、肝脏、肺、肾脏和脾脏的方法，以及如何采集这些器官。此外，还演示了四种较难的组织/样本采集技术。肺组织的采集与灌注尤其具有挑战性，因为需要用固定液充分膨胀肺组织，才能使组织内部得到良好固定，并实现全面的组织学评估。本文逐步演示了如何取出肺并用固定液进行膨胀，以确保在24小时内实现组织的最佳固定效果。脑组织的采集同样具有挑战性，因其质地柔软且易受损。本文逐步演示了如何暴露并从颅腔中取出脑组织，同时将对组织的损伤降至最低。肠系膜淋巴结是检测多种常见感染性病原体的良好样本类型，因为肠道病毒在淋巴结中的存留时间比在粪便中排泄的时间更长。本文演示了定位并无菌采集肠系膜淋巴结的逐步操作步骤。最后，可通过细菌培养或PCR检测尸检时采集的鼻腔和/或支气管分泌物吸出物，以鉴定呼吸道感染性病原体。本操作描述了如何获取并制备呼吸道吸出物样本，用于细菌培养和PCR检测。
方案
1. 尸检准备工作
- 任何大体尸检（大体解剖）的重要部分都包括动物的病史及所见病变的描述。
- 阅读您组织病理学切片的兽医病理学家可能未曾见过该动物，因此依赖您提供背景信息。
- 在对动物实施安乐死后之前，准确描述您所观察到的现象。例如：“雌性小鼠；笼中五只之一；C57BL/6N；头部向右侧倾斜”或“棕色雄性大鼠；品系未知；动物有搔抓行为；背部近尾部和头部区域出现斑片状脱毛”。
- 使用清晰、描述性强且客观的语言。如果“轻度”、“中度”和“重度”之间的界限明确，则这些修饰词可能有用。通常不建议使用食物或日常物品来类比描述。
- 称重和测量动物、病变或器官通常很有帮助。您认为的“脾脏肿大”可能在另一位观察者看来属于正常大小。说明脾脏大小为3cm × 1.5cm则提供了更客观的信息。
- 摄影记录可能具有极高价值。
- 在处理活体动物、可能具有传染性的尸体或甲醛等化学物质时，须遵守所有相关的职业健康安全规定并佩戴个人防护装备。
2. 心脏、肺、肝、肾和脾的大体尸检定位与检查
- 在动物安乐死前，准备好所需的全部用品。至少应包括解剖板或类似的工作台面、镊子、剪刀、容器标签、固定液，以及可能需要的任何培养基或收集管/杯。
- 简要评估动物的状态、行为和活动情况。观察并记录呼吸模式（如快速、浅表呼吸）以及行走能力与步态（如跛行、转圈、震颤）。
- 根据所在机构的标准操作程序对动物实施安乐死，并始终遵循美国兽医医学协会（AVMA）的指导准则。
- 评估动物的体况，检查皮肤和被毛是否存在异常、消瘦或脱水情况。记录任何人为干预措施、植入物或手术瘢痕。
- 检查所有体表开口（耳、眼、鼻、肛门、生殖器开口及口腔）。建议使用解剖显微镜进行更细致的观察。
- 将已安乐死的小鼠或大鼠尸体仰卧置于洁净的解剖板或类似工作台面上。
- 使用剪刀从肛门至下颌沿腹侧全长切开皮肤，翻起皮肤并切开腹壁，暴露腹腔内脏器、唾液腺和包皮/阴蒂腺，以及颈部和腋下淋巴结。通过在肋骨两侧各向上侧方剪两刀，再在胸骨顶端横向剪一刀，剪开肋骨 cage，以充分暴露胸腔内脏器，打开足够空间以便彻底检查肺的所有肺叶。
- 检查肌肉骨骼结构的外观。
- 全面评估所有器官是否存在异常。具体查找并识别胸腔内的心脏和肺；具体查找并识别腹腔内的肝脏、肾脏和脾脏。注意任何颜色变化、大小差异，以及器官缺失或位置异常的情况。记录表面质地、是否存在额外组织（如肿块）、积液囊腔，或腹腔/胸腔内是否存在游离液体。
- 观察胃肠道内容物情况或内容物缺失情况，特别注意管壁增厚、肿块和/或出血现象。用手术刀或剃刀片对肾脏进行切开检查（左侧为纵向切面，右侧为横切面，位于中线但偏中心位置），以检查实质组织是否存在异常。检查肠系膜是否有肿大的淋巴结和/或肿块。
- 检查泌尿生殖系统，观察是否存在阻塞、积液囊腔、出血或其他异常情况。
3. 用于组织病理学检查的心脏、肝脏、肾脏和脾脏的死后采集
- 准备适当大小并贴好标签的容器，容器内装有适量的10%中性缓冲福尔马林（NBF），固定液体积应为组织体积的20倍，以达到20:1的固定液与组织比例。
- 将小鼠或大鼠尸体仰卧置于洁净的解剖板或类似工作台面上，暴露目标组织。
- 使用镊子和剪刀从尸体上取下目标组织。
- 应仔细修整组织，去除脂肪及不必要的结缔组织；组织应无血液残留，必要时可用生理盐水冲洗。严禁使用蒸馏水或自来水冲洗组织。
- 将组织放入盛有10% NBF的容器中。
4. 肺组织的死后采集与灌注
- 准备适当大小并贴好标签的容器，装入适量的10%中性缓冲福尔马林（NBF），调整10% NBF的用量，使固定液体积与组织体积的比例达到20:1。
- 将小鼠或大鼠尸体仰卧置于洁净的解剖板或类似工作台面上。
- 暴露气管、心脏和肺脏。
- 使用剪刀和镊子去除覆盖在胸腹前侧及颈部区域的皮肤和肌肉组织。
- 用剪刀和镊子沿肋骨两侧向上各做一条侧向切口，再在锁骨附近横向剪开一条切口，从而移除肋骨笼，充分暴露心脏和肺脏，形成足够大的操作空间，以便彻底检查肺的所有肺叶。
- 剪除从胸骨和肋骨延伸至下颌的颈部肌肉，包括覆盖在气管表面的肌肉。
- 将剪刀插入肋骨笼前缘下方，分别在左右两侧各剪一刀，以去除覆盖在气管上方的骨段。
- 用镊子夹住靠近下颌的气管，将剪刀置于镊子上方，完全剪断气管。
- 用镊子轻轻向上牵拉气管，同时用剪刀剪断前方的组织连接，直至将整个胸腔组织（包括气管、肺和心脏；有时称为“pluck”）完整从体内取出。
- 将肺组织平放在工作台面上。
- 用一段缝合线或棉线松松地绑在气管周围，注意不要扎紧。
- 用注射器吸取固定液，并安装一根足够细、可插入气管的针头。对于小鼠，使用1 ml或3 ml注射器配26号针头效果良好；对于大鼠，使用5 ml注射器配18号针头效果良好。
- 将针头插入气管开口处，用镊子夹住针头周围的气管组织，开始缓慢向肺内注入固定液。
- 将肺充盈至完全膨胀为止，避免过度或不足充盈。完全充盈肺所需的固定液量因动物的年龄、品系和健康状况而异。
- 过度充盈的表现为液体从肺组织渗出并产生泡沫。
- 充盈不足的表现为肺组织扁平，各区域未完全膨胀。
- 从气管中拔出针头。
- 收紧环绕气管的缝合线或细绳，防止固定液从肺中回流。
- 将充盈后的肺放入固定液中，固定液与组织的体积比约为20:1。
5. 脑组织的死后采集
- 准备适当大小并贴好标签的容器，容器中装有适量的10%中性缓冲福尔马林（NBF）。调整10% NBF的用量，使固定液与组织的体积比达到20:1。
- 将已处死的小鼠或大鼠尸体腹侧向下放置在干净的解剖板或类似工作台面上。
- 使用剪刀和镊子，去除覆盖在颅骨顶部的皮肤和肌肉组织。
- 用剪刀将头部从尸体上完全剪下。
- 使用小剪刀，将剪刀的下刃插入枕骨大孔（即颅骨通向脊髓管的开口），剪刀尖端始终保持向上，沿颅骨正中线直接向上剪开。
- 使用镊子将两侧颅骨向后翻开，暴露脑组织。
- 如条件允许，将暴露的脑组织连同颅骨一起放入固定液中。这样可在脑组织从颅骨中取出前使其充分固定变硬，若实验要求如此。许多病理学家更倾向于在脑组织仍位于颅骨内时进行切片。
- 轻柔地将颅骨翻转倒置，利用重力帮助脑组织自然脱落。
- 使用弯头镊子，从嗅球开始，沿着脑组织外缘小心地将镊子滑入脑下方，经过大脑向小脑方向推进。若发现结缔组织或神经阻碍脑组织脱落，可用镊子轻轻夹除。
- 将脑组织放入固定液中，固定液体积与组织体积之比约为20:1。
6. 肠系膜淋巴结（MLN）的死后采集
- 用于 PCR 分析的组织采集应采用无菌技术操作。应使用火焰灭菌、高压灭菌或同等方法灭菌的器械。
- 准备无菌的 Eppendorf 管、无菌剪刀和镊子。
- 将已实施安乐死的小鼠或大鼠尸体仰卧置于洁净的解剖板或类似工作台面上。
- 使用灭菌的剪刀和镊子，从生殖区域向肋骨基部切开腹前壁，去除皮肤和肌肉组织，暴露肠管。
- 肠系膜淋巴结（MLN）位于腹腔内，分布在沿结肠走行的肠系膜组织中，紧邻盲肠。
- 为定位肠系膜淋巴结，首先找到盲肠，即肠道中体积较大、呈逗点状的结构。结肠自盲肠延伸而出，常可通过其中的粪便颗粒加以识别。肠系膜淋巴结位于紧邻盲肠的结肠系膜内，表现为白色肠系膜组织中的一个黄色、卵圆形或球形的小组织团块，通常比周围肠系膜和脂肪组织略厚且质地稍硬。必要时可参考解剖学教科书以辅助定位。
- 采用无菌技术并使用无菌器械摘取肠系膜淋巴结，并将其放入已标记识别信息的 Eppendorf 管中。
7. 死后呼吸道吸出物的采集
- 准备所需用品——无菌移液管、无菌剪刀和镊子、用于冲洗呼吸道的无菌溶液，以及干净的解剖板或类似的工作台面。
- 将已处死的小鼠或大鼠尸体仰卧置于解剖板上。
- 对于大鼠的支气管吸出物，通过气管进入呼吸道；对于大鼠的鼻腔吸出物，可通过气管或鼻咽道进行采集；对于小鼠的支气管或鼻腔吸出物，均通过鼻咽道进入呼吸道。
- 若需同时采集鼻腔和支气管吸出物，应先进行支气管吸出物的采集，并使用新的无菌移液管进行鼻腔吸出物的采集。
- 气管通路（推荐用于大鼠的方法）：
- 将颈部区域的皮肤向后翻起，暴露皮下组织。
- 去除唾液腺和颈部肌肉，以暴露气管。
- 使用无菌器械切开气管，以便进入管腔。在整个采集过程中保持无菌操作（进入步骤 7.7）。
- 鼻咽道通路（适用于鼻腔和支气管吸出物采集；由于小鼠气管较细，此为推荐方法）：
- 该操作可用于采集鼻腔和支气管吸出物。
- 使用火焰灭菌或高压灭菌的器械切断颞下颌（下颌）关节，并将下颌骨从上颌骨分离，以暴露鼻咽道。在整个采集过程中保持无菌操作（进入步骤 7.7）。
- 用无菌移液管吸取约 1 ml 的采样液。采样液可为生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）或胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth）。（根据所采集的吸出物类型，进入步骤 7.8 或 7.9。）
- 支气管吸出物：
- 将移液管无菌插入气管管腔，方向朝向尾部，缓慢将采样液注入支气管和肺部。然后将采样液从支气管和肺部吸回移液管中，并将移液管从气管中取出。并非所有液体都会被回收。若检测需要更多液体，可重复此步骤。
- 鼻腔吸出物：
- 将移液管无菌插入鼻咽道（小鼠）或气管管腔（大鼠），方向朝向头部，缓慢将采样液注入鼻腔。
- 通过移液管尖端接触鼻腭，或观察液体被压入鼻腔（可见鼻孔处形成弯月面或透过半透明的口腔腭可见液体）来确认已到达鼻腔。液体不应从口腔流出；若出现此情况，应重新调整移液管方向。
- 将采样液从鼻腔吸回移液管中，并将移液管从鼻咽道或气管中取出。
- 将样本无菌转移至适当的培养基或容器中用于检测。
8. 代表性结果
图 1. 小鼠的腹腔和胸腔器官。当动物初次打开时，这些器官通常可见（未移动任何器官以暴露腹腔内其他器官）。a) 胸腺，b) 心脏，c) 肺，d) 膈肌，e) 肝，f) 小肠，g) 盲肠，h) 膀胱。
图 2. 小鼠的腹腔及腹膜后器官。若将肠道和肝脏抬起或移除，即可观察到这些器官。a) 肝脏（作为参考），b) 肠道（作为参考），c) 胃，d) 脾脏，e) 肾脏，f) 降结肠，g) 子宫。
图 3. 雄性生殖器官。在体型较大且性成熟的雄性个体中，这些器官可能更大。a) 精囊和凝固腺，b) 睾丸（通过腹股沟环从阴囊推入腹腔，小鼠和大鼠的腹股沟环保持开放），c) 膀胱，d) 包皮腺，e) 附睾。
图4. 雌性生殖器官。a) 非妊娠子宫（小鼠和大鼠具有双角子宫），b) 卵巢，埋藏于卵巢脂肪垫中，c) 膀胱，d) 阴蒂腺（相当于雄性的包皮腺）。
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讨论
研究结束时的数据采集可能需要对动物进行死后检查。应详细描述所观察到的病变，并记得检查所有组织。这些操作流程主要旨在优化针对传染病监测的剖检和样本采集，但大多数步骤也可轻松调整，用于针对疑似疾病事件或暴发的专项调查，此时可能仅需采用其中一部分操作。许多步骤同样适用于研究结束时更为常见的剖检，此类剖检通常作为整体形态学评估的一部分，并结合采集特定研究样本以供后续分析。
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披露
作者均为 Charles River 实验室啮齿类动物诊断实验室的员工，该实验室对外提供这些商业服务。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 切板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| 小剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm 刀片，3.5" 长度，直型 |
| 中号剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| 大剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| 弯头镊子 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5"，带齿，轻微弯曲 |
| 显微解剖镊 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| 组织镊 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | 鼠齿型 |
| 火焰灭菌器 | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| 手术刀 | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| 移液管 | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| 高压灭菌袋 | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | 用于 Pasteur 移液管 |
| 移液球 | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf 管 | Sarstedt Ltd | SafeSeal 微量管 2mL，货号#72.695 | |
| Eppendorf 管 | Argos | 5mL 微量管 货号#T20765-C | |
| 注射器 | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL 货号#309604 20mL 货号#309661 | |
| 针头 | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| 中性缓冲甲醛 | VWR international | 20L 10% NBF，货号#16004-128 | |
| 生理盐水 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 缓冲血库生理盐水，货号#23-309-178 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | BD Biosciences | TSB：脱水粉末，货号#211825 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | HA 缓冲液，货号#P3813-10PAK | |
| 小号甲醛杯 | VWR international | 4oz 货号#36318-852 8oz 货号#36318-860 16oz 货号#36318-858 | |
| 大号甲醛杯 | OakRidge Products | 32oz 容器 货号#0432-1100 | |
| 特大号甲醛杯 | VWR international | HDPE 多用途 160oz 容器 货号#89038-282 | |
| 缝合材料 | Henry Schein | 编织丝线外科缝合线，货号#100-5000, M766750 | 用于小鼠肺膨胀 |
| 细绳 | Staples | 货号#QUA-46173 | 用于大鼠肺膨胀 |
参考文献
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- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. , CRC Press. (1988).
- King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
- Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
- Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
- Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
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