本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑 的技术。该独特技术可实现质粒DNA的时间和空间特异性转染，有助于众多神经科学家研究大脑发育过程。
本文内容
摘要
摘要
为了理解在发育中脑部特定区域表达的基因（包括信号分子和轴突导向分子）的功能，需要进行局部基因转染或基因敲除。通过结合特定的CRE品系实现局部区域的基因靶向敲入或敲除是可行的，但这种方法费时、费力且成本高昂。因此，一种简便的转染方法——在体电穿孔技术，因其操作时间短，可在制备转基因动物之前方便地检测候选基因的潜在功能1,2。此外，在体电穿孔可用于尚无特异性CRE品系的脑区，并有助于减少胚胎致死性3,4。本文介绍了一种结合两种不同类型电极的在体电穿孔方法，可实现向发育中脑部靶区域进行简单且便捷的基因转移。首先，采用光纤光源对胚胎进行固定，使较小的胚胎（自E9.5起）能够清晰可见，便于将DNA溶液精准注射至脑室，并将针状电极插入目标脑区5,6。脑部的区域模式化（如皮层区域）发生在胚胎发育早期，因此从E9.5开始的早期电穿孔对于全面理解脑区模式化事件具有重要意义。其次，毛细管的精确形状可避免因插入而对子宫造成损伤。此外，针状电极由钨丝和铂丝制成，使用砂纸打磨至尖锐，并以指甲油进行绝缘处理7，本实验方案对此方法进行了详细描述。该独特技术可将质粒DNA转染至脑部特定局限区域，并实现对小型胚胎的电穿孔。这将为研究细胞分化、细胞迁移以及早期胚胎阶段轴突导向的众多科研人员打开新的研究窗口。此外，该技术还可使研究人员将质粒DNA转染至发育中脑部的深部区域（如丘脑和下丘脑），而这些区域目前尚缺乏足够的区域特异性CRE品系用于功能获得（GOF）或功能缺失（LOF）分析。
方案
1. 注射用毛细管和DNA溶液的制备
- 使用大提法（Maxi-prep）或等效方法纯化质粒DNA，并将其终浓度调整为2-3 μg/μl。取100 μg DNA，加入10 μl快绿染料（1%母液）和TE缓冲液（10 mM Tris碱，1 mM EDTA溶液，pH 8.0），加样至总体积100 μl，使注射混合液中DNA的终浓度为1 μg/μl。质粒DNA的浓度可根据质粒大小及其转染效率进行调整，需各自单独测试确定。
- 将DNA溶液在室温下以14,000 RPM离心5分钟，收集上清液以去除任何残留物。
- 使用微量移液器拉制仪拉制玻璃毛细管。用镊子夹断管尖，使尖端直径为20–30 μm。从尖端起测量800 μm至1 mm处，检查其外径小于60 μm（图1A）。
- 将毛细管连接至显微操作仪，并注入矿物油。为将DNA溶液注入毛细管中，将管尖浸入溶液并吸入DNA溶液。
2. 安装铂电极
本实验采用铂丝电极（Nepe gene，CUY611P2-1）对大脑浅层区域（如皮层）进行电穿孔（图1F）。
3. 微电极的制备
使用微电极将基因导入脑深部区域（即丘脑和下丘脑）（图2B-E）。
- 将钨丝（用于负极）和铂丝（用于正极）的一端缠绕在镀金针脚上，并用Parafilm固定。将导线插入棉签杆内，并用Parafilm包裹两端（图1B）。
- 用砂纸均匀打磨导线尖端，使其外径达到20–30 μm，并确保从尖端起60 μm至800 μm-1 mm范围内的直径符合要求（图1C和D）。
- 在导线上涂一层薄薄的指甲油以实现绝缘。待指甲油干燥后，使用浸有丙酮的棉签将尖端约200 μm处的指甲油擦除。 重要提示：为防止损伤小鼠子宫，尖端800 μm-1 mm范围内的直径不得超过70 μm（图1E）。
4. 手术准备
- 麻醉一只怀孕的小鼠（E9.5–E15.5）。我们以药用级戊巴比妥钠进行麻醉示范（表 II；每克体重 50 μg，腹腔注射，等待 5 分钟）。作为戊巴比妥钠的替代麻醉剂，可使用氯胺酮/赛拉嗪注射或气体麻醉剂（短时操作推荐使用气体麻醉）。注射时应注意避免刺中任何器官，否则可能导致子宫损伤或动物死亡。成功进行腹腔注射后，存活率超过 95%。手术也可在开放空气环境中进行。在开始手术前，通过夹捏动物脚趾测试其无反应性，以确认麻醉效果。
- 使用刀片和 50% 乙醇去除腹部毛发。用聚维酮碘和酒精（70%）交替擦拭消毒皮肤。
- 用精细剪刀在腹部正中线做切口，小心将所有子宫角取出，并置于围绕切口放置的、预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS）浸湿的棉纱布上。始终用 PBS 保持子宫湿润。
- 用食指和中指夹持一根柔性光纤电缆，并将其置于子宫角下方。使用前用 70% 乙醇清洁光纤。无需显微镜或放大镜即可观察。将子宫置于光纤光源与拇指之间，轻轻挤压，使胚胎更贴近子宫壁。
5. DNA 注射与电穿孔
- 当胚胎位置固定后，将玻璃毛细管小心插入目标脑室，并注入约 1 μl 的 DNA 溶液（图 2A）。
- 若对大脑表层进行电穿孔，且使用铂丝电极进行电穿孔时，将电极置于子宫外，根据制造商说明施加建议的方波电流脉冲（表 I）。若对大脑深层区域进行电穿孔，使用微电穿孔针型电极。将细钨丝负极插入已注射 DNA 的脑室内，将铂电极插入子宫，并使目标区域位于两电极之间，然后施加建议的方波电流脉冲（表 I）（图 2B）。
6. 电穿孔后处理
- 将子宫角放回原位，并加入 500 μL 预热至 37 °C 的 PBS。
- 用外科缝线缝合内层，使用 9 mm 自动夹闭器关闭外层。
- 将动物置于加热垫上 2 小时，以使其从麻醉中恢复。可给予卡洛芬或丁丙诺啡等镇痛药以缓解术后疼痛。
7. 典型结果：
图32展示了在不同时间点使用铂金丝电极对pCAG-EYFP质粒进行皮层电穿孔的若干示例。大脑在胚胎期13.5天（E13.5）、14.5天（E14.5）和15.5天（E15.5）进行电穿孔，并在出生后第6天（P6）取材。RORc抗体染色显示了第4层的位置，而GFP抗体染色揭示了EYFP转染细胞的位置，两幅图像进行了叠加（图 3A和B）。标记的皮层细胞所处的皮层层数在每次实验中明显不同（图32），这表明时间依赖性的电穿孔可实现皮层层特异性的基因功能获得（GOF）或基因功能缺失（LOF）。
胚胎的存活率和细胞转染效率因胚胎年龄及电穿孔位置而异。样本列于表1中，但应根据脑组织的不同发育阶段和部位，针对每次电穿孔实验优化条件。
使用铂金丝电极对丘脑和下丘脑等深部组织进行电穿孔时，通常效率较低（表1）。该问题可通过使用可到达脑深部区域的微电极来解决。图3和图4展示了在发育中的间脑进行pCAG-EYFP质粒电穿孔的示例。将质粒DNA溶液注入3rd 在E11.5时的脑室并通过微电穿孔技术（图. 3C4C）。电穿孔区域局限于丘脑，此处大部分轴突投射至大脑皮层（图 3B4B）。通过EYFP可观察到轴突投射至大脑皮层第4层的情况，EYFP可充满整个神经元。图. 3A4A
图1. 毛细管正确形状的示意图。（A）使用微移液管拉制仪将玻璃毛细管拉制成特定形状。用镊子夹断尖端，使其直径为20–30 μm。从尖端测量800 μm至1 mm的距离（红色括号），并确保外径小于60 μm（绿色括号）。（B）将钨丝或铂丝的一端缠绕在镀金插针上，并用Parafilm固定。然后使用砂纸处理其尖端，使其外径为20–30 μm，且从尖端1 mm处起60 μm长度范围内保持该尺寸。（C）整形前的钨丝图像。（D）整形后的钨丝图像。（E）涂覆一层薄指甲油后的钨丝图像。E中的比例尺为10 μm（C–E中最小刻度）。（F）铂电极（Nepa gene. CUY611P2-1）。F中的比例尺为2 mm。
图2. 手术操作示意图。（A）向大胚胎侧脑室注射示意图（左侧）及向3rd 心室或小型胚胎（右侧）。(B) 采用铂金棒状电极（左侧）和针型电极（右侧）进行电穿孔的示意图。
图3. 在E13.5（A）、E14.5（B）和E15.5（C）时对小鼠端脑进行pCAG-EYFP电穿孔，并在P6时取材。脑组织进行冠状切片，分别用GFP抗体或RORc抗体染色，图像合并显示。（A）在E13.5时电穿孔pCAG-EYFP质粒，可转染大量第4层神经元，其位置与第4层标记物RORc重叠。（B）在E14.5时电穿孔pCAG-EYFP质粒，转染的细胞位于第4层神经元更表层的位置。（C）在E15.5时电穿孔标记了大量表层神经元，如第2/3层神经元。
比例尺：200 μm。
图4. 将EYFP转染至丘脑-皮层轴突（TCA）。（A）通过GFP抗体染色显示TCA在皮层第4层的终末分布，RORc抗体染色用于标示第4层的位置。两幅图像来自同一组织切片并进行合并。（B）丘脑内电穿孔的位置也通过GFP抗体染色和RORc染色显示，其中RORc的表达局限于丘脑11。（C）示意图展示丘脑电穿孔及TCA投射路径。比例尺：200 μm
讨论
在本实验方案中，我们仅描述了使用不同形状的电极将 pCAG-EYFP 转染至小胚胎脑部特定区域这一技术的优势。关于不同启动子转染效率的比较此前已有报道，结果显示具有细胞类型特异性1。然而，该技术也存在局限性，例如转染仅为瞬时表达，且效果因质粒而异；该方法不具有细胞特异性，且难以控制被转染细胞的数量。因此，将本方案与其他技术相结合，可进一步拓展多种操作方法的可能性。首先，在质粒DNA中引入细胞特异性启动子可实现特定细胞类型的转染，例如神经元、胶质细胞和星形胶质细胞。其次，由于转染为瞬时表达，因此不适合需要研究基因在后期生命阶段功能的研究人员。因此，结合转座酶技术使质粒DNA整合到基因组中，可实现稳定转染8。此外，采用tet-on或tet-off系统可实现对神经细胞中基因表达时间或细胞类型特异性表达的调控8。另一种选择是将本方案与他莫昔芬诱导型Cre-ER(T)重组酶9及报告小鼠10相结合。
这种对组织的广泛可及性将彻底改变神经科学领域所采用的实验设计。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由理化学研究所脑科学研究所（RIKEN Brain Science Institute, BSI）、人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program, HFSP）（授予T.S.）以及理化学研究所青年研究学者计划（RIKEN Junior Research Associate Program, JRA）（授予M.K.）资助。理化学研究所脑科学研究所（BSI）、人类前沿科学计划（HFSP）（授予T.S.）以及理化学研究所青年研究学者计划（JRA）（授予M.K.）资助了本研究。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 裸露钨丝直径 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| 裸露铂丝直径 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| 电极棒 | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| 玻璃毛细管 | Stoelting Co. | 50611 | |
| 显微操作器 | KD Scientific | KDS310 | |
| 剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| 脉冲发生器 | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm 自动夹 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| 镀金针脚 | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc 抗体 | Perseus Proteomics | H3925 |
参考文献
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