小鼠永久性大脑中动脉结扎的应用

摘要

大脑中动脉（MCA）结扎是一种用于在动物模型中研究局灶性脑缺血的技术。该方法通过开颅暴露大脑中动脉，并采用电凝法进行结扎。与其他现有方法相比，该技术可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。

摘要

局灶性脑缺血是临床上患者中最常见的卒中类型之一。由于其重要的临床意义，长期以来人们一直致力于开发合适的动物模型，以研究缺血性损伤发生过程中的一系列事件。这些技术包括采用多种不同动物模型建立的短暂性或永久性、局灶性或全脑性缺血模型，其中最常用的是啮齿类动物。

永久性大脑中动脉结扎法在文献中也被称为pMCAo，被广泛用作啮齿类动物的局灶性缺血模型^1-6。该方法最初由Tamura等人于1981年在大鼠中描述⁷。在此方案中，通过开颅手术暴露大脑中动脉（MCA），并用电凝法阻断其近端区域。梗死区域主要涉及皮层，有时也包括纹状体，具体取决于阻断位置。该技术现已成熟，并在许多实验室中广泛应用^8-13。早期对该技术的应用促成了“梗死核心”和“半暗带”的定义与描述^14-16，目前常用于评估潜在的神经保护化合物^{10, 12, 13, 17}。尽管最初的研究是在大鼠中进行的，但经过 slight modifications 后，永久性大脑中动脉结扎法也已成功应用于小鼠^18-20。

该模型可产生可重复的梗死区域，并提高术后存活率。人类约80%的缺血性脑卒中发生在大脑中动脉（MCA）区域。 ²¹ 因此，这是卒中研究中一个非常相关的模型。目前，可用于卒中患者的有效治疗手段十分有限，因此迫切需要良好的模型来测试潜在的药理学化合物并评估生理学结果。该方法还可用于研究细胞内低氧应答机制。 体内.

本文介绍了在C57/BL6小鼠中进行大脑中动脉结扎手术的方法。我们详细描述了术前准备、大脑中动脉结扎手术操作以及使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法对梗死体积进行定量分析。

方案

本方案已获得罗切斯特大学动物研究伦理使用委员会（UCAR）的批准。实验过程中应遵循无菌操作技术。必须佩戴无菌手套和口罩。

表1中列出了本实验方案中使用的所有仪器、材料、化学品和工具。

1. 术前准备

1. 术前2小时、手术结束时以及术后24小时内每3-5小时，对小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。
2. 使用高压灭菌器对所有手术器械、纱布块和棉签进行灭菌。手术过程中将手术工具置于70%乙醇中保存，使用前在无菌纱布上晾干。用70%乙醇喷洒操作区域。
3. 使用麻醉蒸发器，以3%异氟烷-20%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。通过流量计调节氧气流量。通过脚趾或尾部夹捏测试麻醉深度（应无反应）。以2%（v/v）异氟烷维持麻醉水平。
4. 向小鼠眼睛涂抹人工泪液，并在手术过程中注意避免损伤眼睛。将小鼠置于侧卧位，右侧朝下。
5. 使用动物专用剪刀剃除左眼与左耳根部之间左侧区域的毛发。使用棉签交替涂抹聚维酮碘溶液和70%乙醇，轻轻擦拭该区域进行清洁。必要时重复操作。
6. 将小鼠置于连接直肠探针的加热垫上，以维持体温在37°C。使用矿物油润滑后插入直肠探针。
7. 将小鼠置于显微镜下，右侧朝下，用胶带固定。在纱布块上剪出一个窗口，覆盖手术区域。

2. 手术操作与大脑中动脉结扎

1. 使用精细的直剪刀在左眼与左耳根部之间做一垂直切口。用弯止血钳保持手术区域开放。
2. 使用弹簧剪刀在颞肌上做一横向切口，并用镊子缓慢牵拉，使颞肌轻微脱离颅骨。
3. 在颧弓与鳞状骨交界处，用18G针头进行小范围的颞下颅骨开窗，操作时用弯镊固定下颌骨。
4. 使用骨钳去除小块颅骨以暴露大脑中动脉（MCA）。此过程中应避免损伤颧弓和眶内组织。若组织出现过度干燥，可用无菌PBS棉签涂抹湿润。
5. 使用小型血管电凝器结扎大脑中动脉远端部分。
6. 将颞肌复位至原始位置，并用5-0外科尼龙缝线缝合切口。
7. 停止麻醉，移除直肠探头。皮下注射第二剂布托啡诺（0.05 mg/kg）。将小鼠放回保持在37°C并配有加热板的笼中。
8. 术后24小时内密切观察小鼠是否出现不适症状（食欲或饮水减少、弓背姿势、呼吸加快、毛发竖立）。术后每3–5小时皮下注射一次布托啡诺，持续至24小时。在此期间为小鼠提供恢复期凝胶食物。

3. TTC 染色与脑卒中体积测定

1. 手术后24小时，深度麻醉小鼠，使用微型蠕动泵以中等流速经心脏灌注4%（w/v）TTC磷酸盐缓冲液（PBS）15分钟，随后灌注4%多聚甲醛溶液10分钟。取出脑组织并置于4%多聚甲醛溶液中过夜。
2. 将脑组织放入切片模具中，使用剃须刀片将脑组织切成1 mm厚的切片。
3. 将切片置于毫米刻度尺旁，使用连接解剖显微镜的数码相机拍摄切片图像。
4. 使用Image J软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）通过从对侧半球总面积中减去同侧未梗死区域面积来计算脑梗死面积。通过叠加各切片的梗死面积来计算脑梗死体积²²。

4. Image J 软件使用说明

1. 在 Image J 软件中，通过点击文件菜单打开待分析的图像文件。
2. 点击程序中的“直线（straight line）”选项卡。在标尺的两个边缘之间绘制一条直线。点击“分析（analyze）”菜单并选择“设置比例尺（set scale）”。将已知距离设为 1，长度单位设为 mm。
3. 点击“自由手绘圆（freehand circle）”选项卡。绘制一个圆圈以勾勒对侧半脑的轮廓。点击“分析（analyze）”菜单并选择“测量（measure）”。计算窗口将弹出，显示所绘制圆的面积。
4. 在同侧半脑周围绘制另一个圆圈，排除梗死（白色）区域。按照步骤 4.3 所示方法测量该区域面积。新数值将被添加至计算窗口中。第一个和第二个数值之间的差值即为梗死面积，在下方公式中以 A 表示。
5. 通过重复步骤 4.2 至 4.4，计算每张切片中的脑卒中面积。将各切片中计算出的脑卒中面积求和（∑A_n）。考虑到每张切片厚度为 1 mm，该总和即代表脑卒中体积。
   ∑A_n × 1 mm（每张切片厚度）= 脑卒中体积

5. 代表性结果：

通过永久性结扎小鼠大脑中动脉（MCA）所获得的梗死灶主要位于皮质。然而，如果在大脑中动脉的豆纹动脉分支近端进行结扎，则可能产生皮质下损伤。MCA结扎后的脑卒中体积可能介于10mm³至35mm³之间^{19, 23}。Moyanova等¹⁹使用TTC染色法计算的脑卒中体积为10mm³至22mm³，而Filiano等²³通过MRI图像测定的脑卒中体积则为20mm³至35mm³。造成这些差异的可能原因包括结扎位置的精确性以及测量脑卒中体积所采用的不同方法。

图1显示了野生型C57/BL6小鼠在永久性大脑中动脉结扎术后24小时经TTC染色的脑组织。梗死部位呈白色（图1A、B）。图1A和B从不同角度展示了梗死区域。图2显示了从前往后依次切取的1 mm厚TTC染色脑组织切片（图2A-G）。术后24小时计算梗死体积，梗死体积约为23 mm³。

图1. 脑卒中部位示意图。 A-B：大脑中动脉结扎后24小时的TTC染色全脑图像。白色区域代表梗死区。

图 2. 代表性结果。 （A>G），MCAL 术后 24 小时的 1 mm 脑组织切片经 TTC 染色。切片按从前向后的顺序排列。白色区域代表梗死灶。

讨论

永久性大脑中动脉结扎法相较于其他现有方法，可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。该方法操作简便，手术时间短（˜30分钟）使该方法更加实用。该方法在小鼠和大鼠中均被广泛应用。

该技术需要在体视显微镜下进行侵入性手术，因此操作者必须具备显微镜下手术的经验，并熟练掌握成功的开颅技术。在正式实验开始前，最好先在实验室中建立稳定一致的梗死模型。为了获得可重复的结果，每次手术都必须在相同的确切位置结扎大脑中动脉（MCA）。如果希望产生皮层下梗死，应将MCA在豆纹动脉分支近端处结扎。该动脉被完全结扎，闭塞为永久性，因此该模型不允许通过MCA实现再灌注。尽管本演示中未包含此步骤，但最好使用多普勒探头测量受累区域的血流，以确认动脉是否完全结扎。

操作者在暴露和凝固大脑中动脉（MCA）时应格外小心，避免损伤或穿破该动脉。开颅手术应极为谨慎地进行，以防止对颧骨造成任何损伤。由于手术区域非常接近梗死区域，因此在开颅或烧灼过程中应避免对皮质表面造成任何损伤。可使用FST 18015-00烧灼器设备或双极烧灼器替代本演示中使用的FST...