一个 体外 一种从纯化蛋白和细胞裂解液中制备具有功能活性的糖皮质激素受体（GR）•hsp90蛋白复合物的方法。该方法包括对重组GR进行免疫吸附，随后通过高盐洗脱去除结合蛋白，再进行蛋白复合物的重新组装。文中讨论了辅助因子和缓冲条件的重要性，以及该方法的潜在应用。
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摘要
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Hsp90 是一种必需且含量丰富的分子伴侣蛋白，已被发现可调控超过 150 种真核信号蛋白，包括参与细胞周期、肿瘤发生、细胞凋亡及多种真核信号通路的转录因子（如核受体、p53）和蛋白激酶（如 Src、Raf、Akt 激酶）。 1,2在hsp90的众多“客户”蛋白中，类固醇受体•hsp90复合物的组装过程研究最为清楚图1). 本文介绍一种可调节的糖皮质激素受体（GR）免疫沉淀检测方法 体外 GR•hsp90 重建方法可被广泛用于研究真核生物 hsp90 的功能活性、hsp90 介导的类固醇受体配体结合以及分子伴侣共因子的需求。例如，该检测可用于验证 hsp90 共因子的需求性，以及外源性化合物添加对重建过程的影响。
糖皮质激素受体（GR）一直是研究hsp90的一个特别有用的系统，因为该受体必须与hsp90结合才能形成开放的配体结合裂隙，从而可被类固醇接近并结合3。内源性的、未结合配体的GR存在于哺乳动物细胞的细胞质中，以非共价键形式与hsp90结合。在内源性GR•hsp90异源复合物中，GR的配体结合裂隙处于开放状态，能够结合类固醇。如果hsp90从GR上解离，或其功能受到抑制，则受体将无法结合类固醇，必须重新形成GR•hsp90异源复合物后，其类固醇结合活性才能恢复4。可通过单克隆抗体从细胞胞质中免疫沉淀GR，并通过蛋白质印迹法检测与GR结合的hsp90等蛋白。通过将免疫沉淀物与[3H]类固醇孵育，可测定免疫沉淀所得GR的类固醇结合活性。
先前的实验表明，Hsp90 介导的糖皮质激素受体（GR）配体结合裂隙的开放需要 Hsp70 的参与，而 Hsp70 是另一种对真核细胞存活至关重要的分子伴侣。Hsp90 和 Hsp70 的生化活性由共伴侣蛋白 Hop、Hsp40 和 p23 催化5。含有 Hsp90、Hsp70、Hop 和 Hsp40 的多蛋白伴侣复合物内源性存在于真核细胞胞质中，而网织红细胞裂解液则提供了富含伴侣蛋白的蛋白质来源6。
在本方法中，糖皮质激素受体（GR）从细胞胞质溶胶中通过免疫吸附获得，并在温和的盐条件下去除内源性的hsp90/hsp70分子伴侣系统。经盐处理去除伴侣蛋白的GR随后与网织红细胞裂解物、ATP和K+共同孵育，从而重建GR•hsp90异源复合物并恢复其类固醇结合活性7。该方法可用于检测各种分子伴侣共因子、新蛋白以及实验性hsp90或GR抑制剂对hsp90介导的类固醇结合功能的影响，以确定其功能意义8-11。
方案
1. 含有功能性糖皮质激素受体的细胞胞质提取物的制备
- 技术说明：所有缓冲液均应冷藏，本方案的每一步骤（包括离心和孵育）均应在冰上或 4 °C 下进行，除非另有说明。低温对于防止糖皮质激素受体（GR）及其蛋白复合物降解至关重要。
- 使用冷藏离心机，收集约 ˜1–5 ml 细胞沉淀，该细胞应表达高浓度的功能性 GR。富含 GR 的细胞来源示例包括小鼠成纤维细胞 L929 细胞（表达高水平的内源性 GR）以及感染了重组 GR 杆状病毒（例如 p2Bac-mGR 杆状病毒12）的 Sf9 细胞。每升 Sf9 杆状病毒细胞培养可获得约 15–20 ml 紧密沉淀的细胞。细胞在收获前应处于指数生长期。将细胞悬液在 5,000 × g 条件下离心 5 分钟。
- 用 15 ml Hank's 平衡盐溶液将细胞沉淀洗涤三次。每次洗涤之间，轻轻重悬沉淀，随后在 5,000 × g 条件下离心 5 分钟。最后一次洗涤后，彻底移除上清液。
- 配制 7.5 ml 匀浆缓冲液，其中包含 HEM 缓冲液（10 mM HEPES、1 mM EDTA、20 mM 钼酸钠，pH 7.4）、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）以及 3 片研碎的 Complete-Mini 蛋白酶抑制剂片剂。PMSF 和 Complete-Mini 片剂可防止后续步骤中发生蛋白水解。Complete-Mini 片剂可用研钵和研杵轻松研磨成细粉。向细胞沉淀中加入 1.5 倍体积的匀浆缓冲液。....
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讨论
上述检测方法可进行调整，以测试多种影响基于hsp90/hsp70分子伴侣系统功能以及糖皮质激素受体（GR）类固醇结合能力的条件。该方法是对先前报道的技术4,8,9,17的改进，旨在利用电泳技术的最新进展，并使其更易于被更广泛的研究群体所采用。可在方案第4步所述的GR•hsp90异源复合物重建混合物中，加入其他感兴趣的辅助因子或蛋白质，以观察其对类固醇结合、异源复合物中蛋白质-蛋白质相互作用及辅助因子需求的影响。例如，通过逐步增加活性氧物种的浓度，可模拟缺血-再灌注对hsp90功能的影响。此外，可加入具有特定修饰的纯化蛋白质（如乙酰化的hsp90）或潜在的hsp90抑制剂（如新型格尔德霉素类似物），以评估其对类固醇结合和异源复合物形成的作用。
除电泳、蛋白质印迹和类固醇结合实验外，还可采用其他下游实验方法。例如，免疫沉淀的多蛋白复合物已成功通过流式细胞术进行分析18,19。免疫吸附的GR•hsp90复合物也可用于检测hsp90/hsp70的核苷酸状态，或通过原子力显微镜进行观察17。除GR外的其他hsp90客户蛋白也可.......
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披露
电泳试剂和图像分析软件由 Bio-Rad 提供。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM086822、Hope 心脏研究所基础科学奖以及 M. J. Murdock 慈善信托大学科学研究计划资助。部分电泳试剂和图像分析软件由 Bio-Rad 公司慷慨提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sf9 昆虫细胞 | Invitrogen | 用于杆状病毒表达重组小鼠糖皮质激素受体（GR） | |
| L929 细胞 | ATCC | CRL-2173 | 用于内源性小鼠 GR 胞质液制备（可替代杆状病毒表达系统） |
| FiGR 杂交瘤细胞 | ATCC | CRL-2173 | 用于制备含抗 GR 单克隆抗体的腹水（可替代纯化的 BuGR2 抗体） |
| Complete-Mini 蛋白酶抑制剂，无 EDTA | Roche Group | 11836170001 | |
| 蛋白 A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| 兔网织红细胞裂解液 | Green Hectares (Oregon, WI) | 内源性 hsp90/hsp70 分子伴侣系统的丰富来源 | |
| 肌酸磷酸激酶 | Sigma-Aldrich | C3755 | 用于 ATP 再生系统 |
| 磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich | P7936 | 用于 ATP 再生系统 |
| 抗 GR 小鼠单克隆抗体（BuGR2） | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | 用于 GR 免疫吸附以及作为 Western 印迹中的一抗 |
| 抗 hsp90 小鼠单克隆抗体（AC88） | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | 作为 Western 印迹中的一抗使用 |
| 抗 hsp70 小鼠单克隆抗体（N27F3-4） | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | 作为 Western 印迹中的一抗使用 |
| 小鼠血清来源的 IgG | Sigma-Aldrich | 038K7690 | 作为免疫吸附阴性对照中的非免疫抗体使用 |
| 抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶偶联物 | Sigma-Aldrich | A4416 | 作为 Western 印迹中的二抗使用 |
| Experion 微流控电泳系统 | Bio-Rad | 7007001 | 可替代传统的 SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] 地塞米松 | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | 遵循安全操作规范 |
参考文献
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M.
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