一个 体外 一种从纯化蛋白和细胞裂解液中制备具有功能活性的糖皮质激素受体（GR）•hsp90蛋白复合物的方法。该方法包括对重组GR进行免疫吸附，随后通过高盐洗脱去除结合蛋白，再进行蛋白复合物的重新组装。文中讨论了辅助因子和缓冲条件的重要性，以及该方法的潜在应用。
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摘要
摘要
Hsp90 是一种必需且含量丰富的分子伴侣蛋白，已被发现可调控超过 150 种真核信号蛋白，包括参与细胞周期、肿瘤发生、细胞凋亡及多种真核信号通路的转录因子（如核受体、p53）和蛋白激酶（如 Src、Raf、Akt 激酶）。 1,2在hsp90的众多“客户”蛋白中，类固醇受体•hsp90复合物的组装过程研究最为清楚图1). 本文介绍一种可调节的糖皮质激素受体（GR）免疫沉淀检测方法 体外 GR•hsp90 重建方法可被广泛用于研究真核生物 hsp90 的功能活性、hsp90 介导的类固醇受体配体结合以及分子伴侣共因子的需求。例如，该检测可用于验证 hsp90 共因子的需求性，以及外源性化合物添加对重建过程的影响。
糖皮质激素受体（GR）一直是研究hsp90的一个特别有用的系统，因为该受体必须与hsp90结合才能形成开放的配体结合裂隙，从而可被类固醇接近并结合3。内源性的、未结合配体的GR存在于哺乳动物细胞的细胞质中，以非共价键形式与hsp90结合。在内源性GR•hsp90异源复合物中，GR的配体结合裂隙处于开放状态，能够结合类固醇。如果hsp90从GR上解离，或其功能受到抑制，则受体将无法结合类固醇，必须重新形成GR•hsp90异源复合物后，其类固醇结合活性才能恢复4。可通过单克隆抗体从细胞胞质中免疫沉淀GR，并通过蛋白质印迹法检测与GR结合的hsp90等蛋白。通过将免疫沉淀物与[3H]类固醇孵育，可测定免疫沉淀所得GR的类固醇结合活性。
先前的实验表明，Hsp90 介导的糖皮质激素受体（GR）配体结合裂隙的开放需要 Hsp70 的参与，而 Hsp70 是另一种对真核细胞存活至关重要的分子伴侣。Hsp90 和 Hsp70 的生化活性由共伴侣蛋白 Hop、Hsp40 和 p23 催化5。含有 Hsp90、Hsp70、Hop 和 Hsp40 的多蛋白伴侣复合物内源性存在于真核细胞胞质中，而网织红细胞裂解液则提供了富含伴侣蛋白的蛋白质来源6。
在本方法中，糖皮质激素受体（GR）从细胞胞质溶胶中通过免疫吸附获得，并在温和的盐条件下去除内源性的hsp90/hsp70分子伴侣系统。经盐处理去除伴侣蛋白的GR随后与网织红细胞裂解物、ATP和K+共同孵育，从而重建GR•hsp90异源复合物并恢复其类固醇结合活性7。该方法可用于检测各种分子伴侣共因子、新蛋白以及实验性hsp90或GR抑制剂对hsp90介导的类固醇结合功能的影响，以确定其功能意义8-11。
方案
1. 含有功能性糖皮质激素受体的细胞胞质提取物的制备
- 技术说明：所有缓冲液均应冷藏，本方案的每一步骤（包括离心和孵育）均应在冰上或 4 °C 下进行，除非另有说明。低温对于防止糖皮质激素受体（GR）及其蛋白复合物降解至关重要。
- 使用冷藏离心机，收集约 ˜1–5 ml 细胞沉淀，该细胞应表达高浓度的功能性 GR。富含 GR 的细胞来源示例包括小鼠成纤维细胞 L929 细胞（表达高水平的内源性 GR）以及感染了重组 GR 杆状病毒（例如 p2Bac-mGR 杆状病毒12）的 Sf9 细胞。每升 Sf9 杆状病毒细胞培养可获得约 15–20 ml 紧密沉淀的细胞。细胞在收获前应处于指数生长期。将细胞悬液在 5,000 × g 条件下离心 5 分钟。
- 用 15 ml Hank's 平衡盐溶液将细胞沉淀洗涤三次。每次洗涤之间，轻轻重悬沉淀，随后在 5,000 × g 条件下离心 5 分钟。最后一次洗涤后，彻底移除上清液。
- 配制 7.5 ml 匀浆缓冲液，其中包含 HEM 缓冲液（10 mM HEPES、1 mM EDTA、20 mM 钼酸钠，pH 7.4）、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）以及 3 片研碎的 Complete-Mini 蛋白酶抑制剂片剂。PMSF 和 Complete-Mini 片剂可防止后续步骤中发生蛋白水解。Complete-Mini 片剂可用研钵和研杵轻松研磨成细粉。向细胞沉淀中加入 1.5 倍体积的匀浆缓冲液。
- 通过 Dounce 匀浆器（50 次冲程）或冻融法（3 个循环）裂解细胞。Dounce 匀浆可能更有利于维持完整的内源性 GR•hsp90 蛋白复合物，且操作更快。冻融法则允许研究者在此步骤暂停实验，并在后续时间继续操作。进行 Dounce 匀浆时，应将匀浆器置于冰桶中，以防止蛋白降解。冻融法可通过液氮、干冰或 -20 °C 孵育使含有细胞沉淀与匀浆缓冲液混合物的离心管冻结，然后在 30 °C 水浴中解冻来完成。
- 通过超速离心将含 GR 的胞质溶胶与破裂细胞的颗粒物质分离。将匀浆液转移至耐用的超速离心管中，按质量配对平衡后，在 100,000 × g 条件下离心 30 分钟。
- 收集胞质溶胶（上清液），分装为每份 500 μl，置于 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 长期保存。为最大限度保留功能性 GR 活性，分装后应在液氮中速冻，或在甲醇-干冰浴中孵育 30 秒后再储存。操作时需注意避免冷却试剂直接接触皮肤。
2. 从细胞胞质溶胶中免疫吸附糖皮质激素受体
- 技术说明：图2提供了本方案步骤2-5的示意图概览。
- 制备含有针对糖皮质激素受体（GR）的单克隆免疫球蛋白G（IgG）抗体的免疫吸附混合物，用于吸附步骤1中制备的受体。在1.5 ml微量离心管中，加入100 μl解冻的含GR胞质溶胶、200 μl TEGM缓冲液（8 mM TES、4 mM EDTA、50 mM NaCl、20 mM钼酸盐、10% (v/v)甘油，pH 7.6）、100 μl 20%蛋白A-琼脂糖（PAS）悬液（v/v，用TEGM缓冲液配制）以及5 μg抗GR单克隆IgG抗体（例如BuGR2）。TEGM缓冲液中添加钼酸盐以帮助稳定GR-hsp90异源复合物，这可能有助于检测内源性异源复合物的类固醇结合活性13。
- 抗GR抗体可作为纯化蛋白从商业途径获得。或者，可通过向免疫吸附混合物中加入10 μl含抗GR IgG的腹水来获取。腹水由注射了抗GR杂交瘤细胞（例如FiGR杂交瘤细胞14）的小鼠产生，通过Bradford法测定，实验中所用腹水的抗体浓度约为0.5 μg/μl。
- 使用含GR的胞质溶胶、TEGM缓冲液和PAS（如上所述）以及5 μg不识别GR、hsp90或其他分子伴侣蛋白的IgG（称为“非免疫”抗体）制备阴性对照样品。
- 由于PAS微珠相对较大，在将PAS从20%悬液转移至样品管时，请使用剪切过的P-200移液枪头。剪切枪头的制备方法是将市售P-200枪头末端切去2-3 mm，从而增大枪头孔径。
- 将样品置于垂直旋转摇床上，持续旋转孵育至少2小时。样品可孵育长达8小时而不损失活性。
- 免疫吸附孵育结束后，通过离心去除抗体-PAS沉淀物（“免疫沉淀”）中的未结合蛋白。使用预冷离心机在10,000 × g条件下离心1分钟，分离上清液与免疫沉淀物，随后用1 ml TEGM缓冲液洗涤两次并涡旋振荡。每次离心后及洗涤之间，弃去上清液时注意不要扰动沉淀物。
- 第二次洗涤结束后，彻底移除所有上清液。为确保沉淀物不被意外吸出，最终上清液吸取时应使用压扁的P-200移液枪头。压扁枪头可通过镊子压扁市售P-200枪头制得。
3. 内源性hsp90与GR免疫沉淀物的解离（“盐脱除”）
- 向在步骤2中制备的洗涤免疫沉淀物中加入355 μl TEG缓冲液（不含钼酸钠的TEGM缓冲液）和45 μl 5 M NaCl（终浓度NaCl = 0.5 M）。
- 将样品置于垂直旋转摇床上，持续旋转孵育1.5小时。孵育时间最长可达2小时；但更长时间可能导致蛋白回收率降低和功能活性下降。
- 通过离心去除免疫沉淀物中的未结合蛋白。在10,000 × g下离心1分钟。依次用1 ml TEG缓冲液和1 ml 10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）各洗涤一次。
- 第二次洗涤结束后，使用压口P-200移液器吸头小心吸除全部上清液，注意勿扰动免疫沉淀物。
4. 使用分子伴侣、辅助因子和ATP重建GR•hsp90异源复合物
- 技术说明：通过在下述制备的重建混合物中加入额外的蛋白质、辅因子、激活剂或感兴趣的抑制剂，可测试多种实验条件。重建混合物的总体积应为 <120 μl.
- 向第3步制备的每份去盐免疫沉淀物中加入一种复溶混合液，其包含 50 μl 分子伴侣来源 5 μl ATP生成系统（10 mM HEPES、50 mM ATP、250 mM 磷酸肌酸、20 mM 醋酸镁、100 U/ml 肌酸磷酸激酶，pH 7.4）
- 可通过向重建反应混合物中添加补充成分来增强重建反应 50 μl HKD缓冲液（10 mM HEPES、100 mM KCl、5 mM二硫苏糖醇（DTT），pH 7.4）以及额外的 5 μl ATP生成系统。如果观察到充分的重组和类固醇结合，则可省略此步骤。KCl可增强hsp70的ATP酶活性，DTT可保护含半胱氨酸的蛋白质免受氧化 9.
- 推荐的分子伴侣来源是市售的兔网织红细胞裂解液。从网织红细胞裂解液中纯化得到的单个分子伴侣或重组表达的分子伴侣（例如 15 μg hsp90 15 μg hsp70, 0.6 μg 跳跃， 6 μg p23，以及 0.125 μg hsp40 在 HKD 缓冲液中）也可使用。
- 将样品置于培养箱中孵育 30 °C 水浴准确20分钟。每隔1-2分钟轻弹离心管，以轻轻搅动沉淀并混匀重悬液。
- 加入1 ml TEGM缓冲液，涡旋混匀，然后在10,000 × g离心1分钟。小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。重复上述步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤结束后，使用压扁的P-200移液枪头彻底去除所有上清液。
5. 重建蛋白质复合物及配体结合活性的分析
- 通过传统的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、微流控电泳（例如 Bio-Rad Experion）以及蛋白质印迹法（western blotting）可鉴定重建后的免疫沉淀物中的蛋白质（图3）。技术说明：目前已有其他研究者提供的关于SDS-PAGE15和蛋白质印迹法16的优秀实验方案可供参考。
- 加入50 μl含有β-巯基乙醇的SDS-PAGE上样缓冲液，并涡旋混匀。不同实验所用的上样缓冲液配方可能有所不同，请根据所使用的电泳系统的制造商推荐选择合适的配方。
- 在沸水浴或100 °C电子加热块中孵育5分钟。
- 以10,000 × g离心1分钟。此时，免疫吸附抗体、糖皮质激素受体（GR）以及与GR结合的蛋白质将彼此解离，并释放到上清的样品缓冲液中。
- 使用压口P-200移液枪头将上清转移至新的微量离心管中，弃去沉淀。样品现已准备好，可用于市售的SDS-PAGE或微流控电泳系统分析。请依照制造商的操作说明完成任一技术步骤。
- 在SDS-PAGE后进行蛋白质印迹分析，可明确鉴定在重建孵育后被免疫吸附的GR以及与GR结合的分子伴侣蛋白。建议使用针对GR（BuGR2）、hsp90（AC88）、hsp70（N27F3-4）以及共伴侣蛋白的单克隆一抗，以检测GR•hsp90蛋白复合物的主要组分。
- 通过检测[3H]类固醇结合活性，可确认经盐处理去除配体后的GR在重建GR•hsp90蛋白复合物后的功能活化情况（图4）。在本实验后续步骤中，请遵循处理氚标记样品及废弃物的安全操作规范。
- 向重建后的免疫沉淀物中加入47.5 μl HEM缓冲液和2.5 μl 2 μM [3H]地塞米松（最终类固醇浓度 = 100 nM）。
- 轻轻混匀沉淀，注意尽量减少样品溅至微量离心管管壁。
- 在冰上过夜孵育。此孵育过程中无需旋转或混合样品管。
- 加入1 ml TEGM缓冲液，轻轻混匀后以10,000 × g离心1分钟。弃去上清，注意上清中含有未结合的[3H]类固醇。用TEGM缓冲液重复洗涤共3次。
- 最后一次洗涤结束后，使用压口P-200移液枪头彻底去除所有上清。沉淀中含有GR、hsp90及其他与GR结合的分子伴侣蛋白，以及特异性结合于受体的[3H]类固醇。非特异性结合可通过在过夜孵育体系中加入1000倍过量的非氚标记地塞米松进行测定。作为另一种阴性对照，可在第2.2步中将抗GR免疫吸附抗体替换为非抗GR免疫吸附抗体（NI）。
- 将洗涤后的免疫沉淀物用200 μl TEGM缓冲液重悬，并使用剪口P-200移液枪头转移至10 ml闪烁瓶中。
- 向闪烁瓶中加入4.8 ml闪烁液，涡旋混匀。
- 使用液体闪烁光谱仪测定重建的GR•hsp90蛋白复合物中[3H]类固醇的结合量。
6. 代表性结果：
图3展示了具有代表性的SDS-PAGE和蛋白质印迹结果。利用抗GR抗体从细胞胞质中免疫吸附内源性的GR•hsp90异源复合物，并通过考马斯亮蓝染色显示与GR共同免疫吸附的各个蛋白（图3A）。在重组实验的任一步骤中，均可通过SDS-PAGE测定分子量，并使用针对目标蛋白的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析，从而确认免疫沉淀物中任意组分的蛋白身份。
使用 Experion 微流控电泳数据（图 3C 和 3D）和 Western 印迹分析（图 3B）展示重建的 GR•hsp90 异源复合物。通过将免疫吸附用抗 GR 抗体替换为非免疫性抗体，可验证 GR 免疫吸附的特异性（图 3C，NI IgG 泳道）。即使使用过量的非免疫性抗体，也不会发生 GR 或分子伴侣的免疫沉淀（比较图 3C 中抗 GR 抗体免疫吸附泳道中可见的 GR、hsp90 和 hsp70 蛋白条带，与 NI IgG 泳道中条带的缺失）。同样，可通过 Western 印迹分析（图 3B）检测经盐洗脱和重建后的免疫沉淀物，以确认 hsp90 及其他伴侣蛋白已从盐洗脱的 GR 上解离。免疫吸附抗体的重链（HC）可通过考马斯亮蓝染色和 Western 印迹检测，用于确认各泳道中所观察的免疫沉淀物量相等。
通过检测所有测试条件下的类固醇结合活性，可对免疫吸附得到的GR进行活性分析，代表性类固醇结合数据如图4所示。内源性的GR•hsp90异源复合物被免疫吸附后，经高盐洗脱并重新重建。无论是使用网织红细胞裂解液还是纯化的蛋白质，重建后的GR•hsp90异源复合物的类固醇结合活性通常可恢复至内源性GR•hsp90结合活性水平的75–100%。与电泳实验数据类似，可用非免疫抗体（NI）替代抗GR抗体（I），作为阴性对照以评估非特异性[3H]类固醇结合水平。
图1. GR•hsp90异源复合物组装及GR类固醇结合裂隙开放的模型。基于hsp90/hsp70的分子伴侣机器可将GR配体结合结构域从一种折叠构象转变为另一种开放裂隙构象，在前一种构象中类固醇结合裂隙处于关闭状态，无法与激素结合，而在后一种构象中该裂隙可被激素接近（以杂环类固醇图标表示）。该分子伴侣机器在细胞内预先组装，当纯化的hsp90、hsp70和Hop在溶液中混合时可自发形成（反应1）。Hop含有一个由34个氨基酸组成的四肽重复（TPR）结构域（以深色新月形表示），在异源复合物成熟过程中随后被含有TPR结构域的亲免素蛋白取代。该机器以ATP依赖性和K+依赖性方式打开类固醇结合裂隙，之后Hop以及大部分hsp70和hsp40最终离开复合物（以虚线图标表示）。从机制上讲，hsp70在hsp90之前与GR相互作用，并使受体为hsp90结合及后续裂隙开放做好准备。实验表明，若hsp90与hsp70同时存在，则类固醇结合能力和GR裂隙开放程度增加。hsp90共伴侣蛋白p23进入复合物后可稳定该异源复合物，使hsp90维持在ATP结合状态。在Hop离开后，一种高分子量的亲免素（IMM）可结合hsp90，形成最终的异源复合物，该复合物亦可从细胞中回收得到。改编自Pratt和Toft1。
图2. 本实验方案第2-5步的示意图。使用针对糖皮质激素受体（GR）的单克隆抗体（FiGR）与蛋白A-Sepharose微珠结合，从细胞胞质中免疫吸附GR。内源性GR•Hsp90异源复合物中存在的Hsp90及其他分子伴侣蛋白会随GR一同被共免疫吸附，且GR仍具有结合类固醇激素的能力。通过温和的高盐处理（称为盐剥离，Str）使Hsp90从GR上解离。盐剥离后的GR类固醇结合裂隙闭合，从而失去结合类固醇的能力。通过将盐剥离后的GR与纯化的蛋白质或网织红细胞裂解液（Retic lysate）及辅助因子共同孵育，可重建包含Hsp70、Hsp40和Hop的中间态GR•Hsp90异源复合物（Recon），该复合物恢复类固醇结合能力。各步骤的类固醇结合活性及免疫沉淀物中的蛋白质组成，可分别通过过夜 [3H]类固醇孵育和Western印迹检测进行鉴定。
图3. 免疫吸附复合物的电泳蛋白质分析。A，使用常规电泳系统成像的重组GR•hsp90异源复合物的SDS-PAGE，随后进行电转移和考马斯亮蓝染色。除GR、hsp90和hsp70外，还可观察到抗体的重链（HC）和轻链（LC）。左侧标明了分子量标记物（以kDa表示）的迁移位置。B，含有盐洗脱GR（Str）和重组GR•hsp90异源复合物（Recon）的免疫沉淀物的Western印迹。C，利用Experion微流控电泳系统生成的重组GR•hsp90异源复合物的虚拟凝胶图。图中包含了两种不同浓度的非免疫性（NI IgG）和免疫性（抗GR）免疫吸附抗体。NI IgG作为阴性对照。D，来自B图第三泳道所示Experion微流控电泳样品的重组GR•hsp90异源复合物的电泳图谱。微流控电泳的优势包括所需样品体积更小、液体操作和运行后清理工作减少、定量更精确，以及显著缩短的样品运行时间。
图 4. 内源性糖皮质激素受体（Enodg）、盐剥离糖皮质激素受体（Str）以及重建的GR•hsp90异源复合物（Recon）经免疫吸附后，免疫沉淀物的类固醇结合活性。除使用单克隆抗GR免疫吸附抗体（I）吸附GR外，每种条件下均设置使用非免疫性免疫球蛋白（NI）处理的阴性对照样本。
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讨论
上述检测方法可进行调整，以测试多种影响基于hsp90/hsp70分子伴侣系统功能以及糖皮质激素受体（GR）类固醇结合能力的条件。该方法是对先前报道的技术4,8,9,17的改进，旨在利用电泳技术的最新进展，并使其更易于被更广泛的研究群体所采用。可在方案第4步所述的GR•hsp90异源复合物重建混合物中，加入其他感兴趣的辅助因子或蛋白质，以观察其对类固醇结合、异源复合物中蛋白质-蛋白质相互作用及辅助因子需求的影响。例如，通过逐步增加活性氧物种的浓度，可模拟缺血-再灌注对hsp90功能的影响。此外，可加入具有特定修饰的纯化蛋白质（如乙酰化的hsp90）或潜在的hsp90抑制剂（如新型格尔德霉素类似物），以评估其对类固醇结合和异源复合物形成的作用。
除电泳、蛋白质印迹和类固醇结合实验外，还可采用其他下游实验方法。例如，免疫沉淀的多蛋白复合物已成功通过流式细胞术进行分析18,19。免疫吸附的GR•hsp90复合物也可用于检测hsp90/hsp70的核苷酸状态，或通过原子力显微镜进行观察17。除GR外的其他hsp90客户蛋白也可...
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披露
电泳试剂和图像分析软件由 Bio-Rad 提供。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM086822、Hope 心脏研究所基础科学奖以及 M. J. Murdock 慈善信托大学科学研究计划资助。部分电泳试剂和图像分析软件由 Bio-Rad 公司慷慨提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sf9 昆虫细胞 | Invitrogen | 用于杆状病毒表达重组小鼠糖皮质激素受体（GR） | |
| L929 细胞 | ATCC | CRL-2173 | 用于内源性小鼠 GR 胞质液制备（可替代杆状病毒表达系统） |
| FiGR 杂交瘤细胞 | ATCC | CRL-2173 | 用于制备含抗 GR 单克隆抗体的腹水（可替代纯化的 BuGR2 抗体） |
| Complete-Mini 蛋白酶抑制剂，无 EDTA | Roche Group | 11836170001 | |
| 蛋白 A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| 兔网织红细胞裂解液 | Green Hectares (Oregon, WI) | 内源性 hsp90/hsp70 分子伴侣系统的丰富来源 | |
| 肌酸磷酸激酶 | Sigma-Aldrich | C3755 | 用于 ATP 再生系统 |
| 磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich | P7936 | 用于 ATP 再生系统 |
| 抗 GR 小鼠单克隆抗体（BuGR2） | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | 用于 GR 免疫吸附以及作为 Western 印迹中的一抗 |
| 抗 hsp90 小鼠单克隆抗体（AC88） | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | 作为 Western 印迹中的一抗使用 |
| 抗 hsp70 小鼠单克隆抗体（N27F3-4） | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | 作为 Western 印迹中的一抗使用 |
| 小鼠血清来源的 IgG | Sigma-Aldrich | 038K7690 | 作为免疫吸附阴性对照中的非免疫抗体使用 |
| 抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶偶联物 | Sigma-Aldrich | A4416 | 作为 Western 印迹中的二抗使用 |
| Experion 微流控电泳系统 | Bio-Rad | 7007001 | 可替代传统的 SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] 地塞米松 | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | 遵循安全操作规范 |
参考文献
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