自动疏水相互作用色谱柱筛选在蛋白质纯化中的应用

摘要

本文介绍了一种用于自动筛选适用于蛋白质纯化过程中疏水相互作用色谱（HIC）介质的自动化方法。该方法采用中压液相色谱系统，包含自动缓冲液配制、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能。

摘要

与其他蛋白质纯化色谱方法（如凝胶过滤、亲和层析和离子交换层析）不同，疏水相互作用色谱（HIC）通常需要通过实验确定（称为筛选或“ scouting”）以选择最适合纯化特定蛋白质的色谱介质¹。本文所述方法介绍了一种自动化的策略，用于筛选最适合蛋白质纯化的HIC介质。

疏水相互作用层析（HIC）根据蛋白质和其他生物分子疏水性的差异，从粗裂解液中将其分离。与亲和层析（AC）和离子交换层析（IEX）类似，HIC 在层析过程中能够对目标蛋白进行浓缩。最适合采用 HIC 进行纯化的蛋白质通常具有疏水性表面区域，并能够耐受高于 2 M 的硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）盐浓度。当目标蛋白缺乏亲和标签而无法使用 AC，或 IEX 无法实现充分纯化时，HIC 常被选为纯化方法。蛋白质表面的疏水基团会暂时结合到连接于惰性、不溶性基质上的非极性配体。蛋白质与配体之间的相互作用高度依赖于流经层析柱的缓冲液中的盐浓度：高离子强度可增强蛋白质与配体的结合，使蛋白质保持不移动状态（即结合在柱内）²。随着盐浓度降低，蛋白质与配体之间的相互作用减弱，蛋白质重新变为可移动状态并从柱中洗脱出来。目前市面上有多种预装柱形式的 HIC 介质，每种介质均含有不同的疏水性配体（例如 S-丁基、丁基、辛基和苯基），以不同密度交联于特定直径的琼脂糖微球上³。通过自动化的柱筛选系统，可高效地确定在后续更深入的优化实验及蛋白质纯化过程中应选用的 HIC 介质⁴。

此处纯化的特定蛋白为重组绿色荧光蛋白（GFP）；然而，该方法也可适用于纯化具有一个或多个疏水表面区域的其他蛋白。由于GFP具有稳定性、在397 nm处独特的光吸收峰以及在紫外光照射下产生荧光的特性，因此是一种有用的模型蛋白⁵。含有野生型GFP的细菌裂解液在高盐缓冲液中制备后，加载至Bio-Rad DuoFlow中压液相色谱系统，并吸附到含有不同疏水相互作用层析（HIC）介质的HiTrap HIC柱上。蛋白从层析柱中洗脱，并通过在线及运行后检测方法进行分析。缓冲液梯度混合、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能增强了系统的操作灵活性及实验方法的可重复性。

方案

1. 缓冲液与样品制备

1. 技术说明：所有缓冲液均应冷藏，且本方案的每一步操作均需在冰上或 4 °C 下进行，除非另有说明。低温对于防止待纯化蛋白的降解以及确保最佳操作条件至关重要。疏水相互作用色谱（HIC）介质若在室温下操作，可能会产生不同的分离效果，因此色谱系统应在 4 °C 的冷藏室或冷箱中运行。
2. 配制以下缓冲液各 500 ml：200 mM NaH₂PO₄（缓冲液 A1）、200 mM Na₂HPO₄（缓冲液 A2）和 4.8 M (NH₄)₂SO₄（缓冲液 B2）。同时将使用去离子水（缓冲液 B1）。对缓冲液进行脱气处理，以确保最佳色谱操作条件。系统增效器将混合缓冲液 A1 和 A2，生成低盐磷酸盐洗脱缓冲液；并混合缓冲液 B1 和 B2，生成高盐硫酸铵起始缓冲液（2.4 M (NH₄)₂SO₄）。
3. 通过将含有待纯化蛋白的 10 ml 细胞裂解液与 10 ml 缓冲液 B2 混合，制备 20 ml 上样样品。细胞裂解液样品溶液中最终硫酸铵浓度应约为 2.4 M (NH₄)₂SO₄，使其大致与起始缓冲液相当。可通过将细菌细胞沉淀重悬于 TE 缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）中，随后进行超声处理，或加入 1 mg/ml 溶菌酶并以 3,700 × g 离心 10 分钟，来制备细胞裂解液。
4. 将裂解液与缓冲液的混合物通过低蛋白结合力的 0.45 μm 针筒滤器过滤，以去除溶液中的颗粒物。样品在上样前应始终保持在冰上。

2. DuoFlow 层析系统的物理组装与管路连接

1. 确保所有设备的电源和通信连接均已正确连接。设备应在 Biologic DuoFlow 层析软件的手动控制窗口中可见。设备汇总见表 1。系统示意图和管路连接图见图 2。
2. 将阀门的电气连接线连接至泵工作站和系统扩展器（system maximizer）端口，使端口号按逻辑顺序排列。用相应的端口号标记每个阀门，以便日后参考。泵工作站和系统扩展器作为计算机/控制器与层析系统之间的主要通信接口。当阀门连接至任一设备时，软件将自动识别并显示这些阀门。
3. 技术说明：在手动模式下操作层析系统时，阀门为独立控制。在启动缓冲液流动前，特别是在切换阀门时，务必确认已配置所需的流路。
4. 将聚四氟乙烯（Teflon）管浸入缓冲液 A1、A2、B1 和 B2 中。确保缓冲液体积充足，能够满足整个实验流程所需，并保证管路持续浸没于液体中。准备 500 ml 的缓冲液 A1、A2 和 B2，以及 1 L 的缓冲液 B1 即可满足需求。
5. 按照图 2 所示及制造商说明，连接样品加载阀和动态样品环。使用尽可能短的管路将样品环连接至样品阀进样口（位置 3），以最大限度减少样品加载过程中的稀释。
6. 尽量缩短样品、样品加载泵与样品加载阀进样口（位置 2）之间的管路长度，以减少填充样品环所需的样品量。
7. 准备 8 对尺寸完全相同的 1/16 英寸外径 PEEK 管，每对通过一个 1/4-28 母对 1/4-28 母接头连接。将这些管对分别连接至两个柱切换阀的位置 1–8。之后，连接在柱切换阀位置 2–8 的 7 个接头将被待测试的层析柱替代。连接在位置 1 的接头将保留作为层析柱旁路。
8. 技术说明：确保每对管路连接在两个柱切换阀的相同位置上。
9. 打开四波长紫外/可见光检测器（QuadTec）灯和固定波长 280 nm 紫外检测器灯。本实验方案中，QuadTec 检测的波长包括 214 nm、280 nm 和 397 nm。同时使用固定波长紫外检测器和 QuadTec 检测 280 nm 可提供系统冗余，确保数据有效性。
10. 根据制造商说明，确认所有检测器均已校准。背压调节器（backpressure regulator）用于减少检测器中气泡的积聚，应安装在检测器下游、pH 监测仪上游。
11. 本系统包含两个组分收集器，为运行后的洗脱液分析提供了极大便利。按照图 2 所示连接组分收集器、分流阀和分流控制器。连接至分流阀位置 1 的组分收集器将在 12 ml 培养管中收集 900 μl 的洗脱组分，而连接至位置 2 的组分收集器将在 96 孔微孔板中收集 100 μl 的洗脱组分。
12. 位置 2 的组分收集器、分流阀和分流控制器在层析工作站之外独立运行。分流控制器位于 Bio-Rad Econo 梯度泵内部，但该设备的泵组件不使用。当分流阀连接至 Econo 梯度泵时，其界面上将显示“% Split”设置选项。
13. 将 % Split 设置为 10。位置 1 的组分收集器将收集 90% 的洗脱液（900 μl/组分），位置 2 的组分收集器将收集 10%（100 μl/组分）。两个组分收集器将同步推进，使两者的组分编号相互对应。
14. 将位置 2 组分收集器上的标准滴头更换为微孔板专用滴头。微孔板滴头具有更小的孔径，可实现比标准滴头（50 μl）小 50% 的液滴体积（即 25 μl），在收集 ≤ 500 μl 的组分时尤为有利。
15. 通过屏幕控制面板，设置位置 2 的组分收集器在 96 孔板中收集组分，并以 1 样本/分钟的速度推进。分流控制器和位置 2 的组分收集器将在首次层析运行开始后立即手动启动。
16. 使用缓冲液 B1 冲洗位置 2 的组分收集器和微孔板滴头。

3. 预处理系统管路、设置运行方法及平衡HIC色谱柱

1. 将系统最大化进样管路浸入已脱气的缓冲液A1、A2、B1和B2中，按照制造商说明启动工作站泵，冲洗样品环并冲洗色谱系统。为去除残留气泡，需完成全部4个最大化系统进样口（A1、A2、B1和B2）的引液步骤。
2. 系统准备需通过BioLogic软件手动操作系统控制器。在启动缓冲液流动前，确认样品加载阀和柱选择阀的位置正确。
3. 按照步骤3.4–3.5所述，准备以1 ml/分钟的手动流速将洗脱缓冲液（0 %B）流经系统。
4. 在BioLogic程序软件的“设置”窗口中，选择“使用缓冲液混合”和“含硫酸铵的磷酸盐缓冲液”。确认“设置”窗口中列出的缓冲液A1、A2、B1和B2与所配制的缓冲液一致。
5. 手动将流速设为1 ml/分钟的洗脱缓冲液（0 %B）。观察背压、电导率、UV信号和pH值保持稳定且在正常操作范围内。异常情况提示存在气泡或柱堵塞，应在继续操作前予以解决。
6. 用5 ml洗脱缓冲液冲洗全部8条柱选择管路。首先停止流动，将两个柱选择阀均设为位置2，然后恢复1 ml/分钟流速、0 %B条件下的流动。对位置3–8的柱选择管路重复此操作。
7. 将1 ml HiTrap HIC柱连接至柱选择阀的位置2–8。每次仅对一个柱完成步骤3.8–3.13。注意记录每个HIC柱所安装的阀位。HIC柱介质特性的汇总见表2。
8. 将GE Healthcare的HiTrap柱连接至Bio-Rad DuoFlow系统时，需使用一系列包含1/4-28、M6和鲁尔接头的连接件。拆下连接位置2柱选择阀的接头。按照图3所示对齐Bio-Rad与GE Healthcare的接头。
9. 将柱上游接头连接至DuoFlow系统。为避免在柱或管路中截留气泡，应牢固地将上游柱接头连接至上游选择阀接头。让洗脱缓冲液流经接头，直至所有气泡排出，并在末端形成一大滴缓冲液。暂时停止缓冲液流动。
10. 取下连接于柱入口的堵头，并在柱顶部放置一大滴低盐缓冲液（0 %B）。将柱连接至上游接头。确保柱入口和入口接头均被缓冲液滴充满，以保证连接处无气泡。
11. 若柱为首次使用，请折断柱出口端。将出口连接至下游柱接头和选择阀管路。确认所有接头均已牢固拧紧。
12. 将背压限值设为40 psi。以1 ml/分钟的流速，用5个柱体积（5柱体积 = 5 ml）的洗脱缓冲液（0 %B）清洗柱。如有必要，继续清洗直至pH、UV信号和背压稳定。
13. 以1 ml/分钟的流速，用10个柱体积（10 ml）的起始缓冲液（100 %B）清洗柱。如有必要，继续清洗直至前一步骤中列出的系统参数以及电导率均稳定。
14. 上述准备好的HIC柱现已可进行样品上样。当所有待测试柱均准备完毕后，手动将柱选择阀切换至位置1（接头）并停止缓冲液流动。

4. 样品上样

1. 将样品进样管浸入20 ml样品中，开始将样品加载至动态样品环。在BioLogic软件的手动设置窗口中，将样品环加载/清洗阀切换至位置1（样品），并将样品加载阀切换至冲洗位。
2. 启动样品环加载泵，以1 ml/分钟的流速将样品吸入泵管，直至样品刚刚到达样品加载阀。此步骤可去除样品加载管路中的缓冲液和/或空气。
3. 停止加载泵的流动，将样品加载阀从冲洗位切换至加载位。以1 ml/分钟的流速重新启动样品环加载泵，直至有10 ml样品被吸入动态样品环中。
4. 此时已向动态样品环中加载了足量样品，可供最多10次连续的HIC柱筛选运行使用。

5. 编程软件方法并运行柱筛选方案

1. 在 BioLogic 软件的设置窗口中，选择 表 1 中用星号标记的系统设备。
2. 选择 6 根疏水相互作用色谱（HIC）柱进行分析。按照表 3 所示，程序化设置线性递减盐梯度和 6 柱筛选方法。该方法程序基于 BioLogic 软件 HIC 柱设置修改而成，并已针对当前应用进行了优化。
3. 由于馏分收集器存在限制，建议采用 6 柱筛选方法。若将程序方法调整为收集更大体积的馏分，则可对全部 7 根色谱柱进行筛选。在程序尚未完全设定完成前，不要添加筛选步骤，因为一旦启用筛选功能，将无法进行后续编辑。
4. 开始筛选运行。手动启动起始缓冲液（100 %B）流动，流速为 1 ml/分钟。按下分流控制器上的“开始”按钮，使洗脱液流按 90%-10% 的比例分别进入 12 ml 培养管馏分收集器（位置 1）和 96 孔板馏分收集器（位置 2）。技术说明：请注意，96 孔板馏分收集器是脱离 BioLogic 软件离线操作的。
5. 运行程序方法。在启动程序方法运行后，立即点击离线 96 孔板馏分收集器屏幕控制面板上的“开始”按钮。如果两个馏分收集器未完全同步，则当另一个馏分收集器进入第二个收集管时，需手动推进离线 96 孔板馏分收集器至对应位置。
6. 观察实时显示以确认预期的运行参数。反压、电导率和 %B（图 4）是可用于监测的运行参数，以确保各色谱柱之间运行条件的可重复性。还应监测阀位、pH 值和样品上样情况。可通过比较紫外吸收图谱来验证流出液洗脱峰的相似性。
7. 利用在线和运行后洗脱液分析技术，确定目标蛋白（即“目标蛋白”）的洗脱曲线及纯化效果。
8. 对于含有绿色荧光蛋白（GFP）的样品，可通过其在 397 nm 处特有的紫外吸收在线观察洗脱过程。将 GFP 特异性的 397 nm 吸收图谱与普通蛋白在 280 nm 处的吸收图谱进行比较，以评估使用不同 HIC 介质进行筛选时的相对分离和纯化效果（图 5）。
9. 运行后对 GFP 及其他目标蛋白的分析可通过多种方法完成。可将 96 孔板中各馏分的 5–50 μl 等分试样转移至新板，通过 ELISA 或 Western 印迹法检测特异性蛋白含量；各馏分的总蛋白含量可通过常规 SDS-PAGE 或 Experion 微流控电泳系统进行分析。使用紫外光可在 12 ml 培养管中检测 GFP 荧光（图 6）。
10. 通过比较 GFP 洗脱峰相对于样品中其他蛋白的洗脱行为，可确定最具前景的 HIC 介质。随后可根据其他参数（包括起始缓冲液类型、浓度和 pH 值）进一步优化该介质的纯化条件。
11. 技术说明：实验结束后，将所有进液管线插入缓冲液 B1（脱气 H₂O）中，并用水彻底冲洗泵、阀门及所有管路。请遵循制造商关于色谱系统和 HIC 柱清洁及长期储存的说明。

6. 代表性结果：

代表性HIC盐梯度、电导率及柱压的初步实验结果如图所示 图4盐浓度的变化（蓝线）是疏水相互作用色谱（HIC）方法的典型特征，通过高盐缓冲液管道中引出的缓冲液百分比进行测定。随着盐浓度降低，结合在柱上的蛋白质逐步洗脱。电导率（红线）反映实际盐浓度，在QuadTec和紫外检测器之后立即进行在线检测。盐梯度与电导率曲线之间的偏移表明缓冲液从缓冲液入口经系统流动至电导监测器所需的时间。在整个样品运行过程中，系统压力（灰色线）和pH值保持相对稳定。

图5显示了连续进行的疏水相互作用色谱（HIC）柱筛选实验的色谱图。通过分别测量280 nm和397 nm波长下的光吸收值，可在线检测总蛋白（A₂₈₀，蓝线）和绿色荧光蛋白（GFP，A₃₉₇，绿线）。通过比较这两条曲线，可以估算每次筛选实验中GFP的相对丰度及其分离效果。GFP与所测试的HIC柱结合的亲和力程度不同，其洗脱谱图也有所差异。选择后续纯化实验中优先使用的HIC柱，应基于能够产生最尖锐的GFP洗脱峰以及与其他蛋白实现最佳分离的色谱柱。

在图6中，苯基疏水相互作用层析（Phenyl FF，高取代度）预实验中第10、12、14、16和18组分的培养管分别在环境室内（荧光）光源和紫外（UV）光源下进行观察。为观察绿色荧光蛋白（GFP）的特征性发射光谱，培养管均以正面（左图）和俯视（右图）两种视角进行成像。在两张UV图像中，第14组分均清晰可见GFP（绿色）荧光信号。这些运行后数据与在线检测结果高度一致：通过测定洗脱液在397 nm处的吸光度（A₃₉₇，绿色曲线），同样可确定第14组分为洗脱GFP的主要峰。左图UV图像中的弥散蓝色光为UV灯本身发出的光源。

图 1。本实验方案的示意图。制备含有目标蛋白（GFP，目标蛋白）的细菌裂解液，将其稀释至与色谱起始缓冲液盐浓度相当的高盐缓冲液中，并进行过滤。液相色谱系统准备就绪后，将样品上样，并利用预装填的疏水相互作用色谱（HIC）柱中的疏水色谱介质，将目标蛋白与裂解液中的其他蛋白分离。通过使用不同的色谱介质重复多次分离步骤（称为柱筛选），以确定哪种介质可实现最佳的GFP分离效果。洗脱出的蛋白（洗脱液）通过色谱系统内置的检测器进行在线分析，并被收集为较小的组分，用于后续（运行后）分析。根据GFP活性及分离效果的在线和运行后分析结果，确定最优的HIC柱及色谱介质。

表1. 本实验方案中使用的色谱系统关键组件。

图 2. 所使用的 Bio-Rad DuoFlow 中压液相色谱系统的示意图。该系统的主要特点包括自动缓冲液混合、连续上样进行多柱运行、自动选择不同的色谱柱、洗脱液的在线分析，以及分步收集洗脱组分。详见正文及表 1。

表 2. 所测试疏水相互作用色谱介质的生物物理特性。HiTrap HIC 柱的名称表示其配体、配体密度和珠粒大小。

*FF = 快流速；HP = 高性能。较大的微珠粒径可提高配体结合能力和流速，较小的微珠粒径可提高色谱分辨率。信息来源于制造商提供的文献。

图3. GE Healthcare HiTrap HIC 色谱柱与 Bio-Rad DuoFlow 系统的连接方式。在上游的 1/4-28 Delrin 螺母和卡套（A1）上，连接一个公Luer转母1/4-28接头（B1）和一个公1/16"转母Luer接头（C）。在用缓冲液冲洗并去除所有气泡后，将这些接头连接至 HiTrap 色谱柱。色谱柱出口连接一个母1/16"转公M6接头（D）、公Luer转母M6接头（E）以及母Luer转母1/4-28接头（B₂）。整个组件最终连接至下游的1/4-28 Delrin螺母和卡套（A₂）。上方面板显示各接头分离状态，下方面板显示接头组装后的状态。

步骤 #	体积 (mL)	描述	参数
1	0.00	在整个运行过程中收集 1.0 mL 的组分
2	0.00	切换色谱柱	HIC 色谱柱 1 (位置 2)
3	0.00	等度洗脱	pH: 6.80 100% B	体积: 2.00 mL 流速: 1.00 mL/min
4	2.00	基线归零	QuadTec
5	2.00	基线归零	UV 检测器
6	3.00	进样	样品加载 动态环	自动进样阀 体积: 0.50 mL 流速: 1.00 mL/min
7	8.00	等度洗脱	pH: 6.80 100%B	体积: 5.00 mL 流速: 1.00 mL/min
8	18.00	线性梯度洗脱	pH: 6.80 100%B -> 0%B	体积: 10.00 mL 流速: 1.00 mL/min
9	21.00	等度洗脱	pH: 6.80 0%B	体积: 3.00 mL 流速: 1.00 mL/min
10	26.00	等度洗脱	pH: 6.80 100%B	体积: 5.00 mL 流速: 1.00 mL/min
11	26.00	切换色谱柱	连接头 (位置 1)
结束	26.00	程序结束	自动重复使用另外 5 根 HIC 色谱柱 (位置 3–7)
预筛查类型		运行次数: 6	预筛查步骤数: 1

表3. 所采用的HIC初步筛选方法的BioLogic软件方案。

图 4. 典型的疏水相互作用色谱（HIC）盐梯度、电导率和柱压变化。随着盐浓度（蓝线）降低，电导率（红线）也随之下降。盐梯度与电导率曲线之间的偏移反映了缓冲液从缓冲液入口到达电导监测器所需的时间。在初步摸索运行期间，系统压力（灰线）保持相对稳定。

图 5. 连续进行的HiTrap疏水相互作用色谱（HIC）柱筛选实验的合并色谱图。通过分别测量280 nm和397 nm波长下的光吸收值，实现对总蛋白（A₂₈₀，蓝色线）和绿色荧光蛋白（GFP，A₃₉₇，绿色线）的在线检测。在本系列实验中，使用苯基FF（高取代）柱时观察到最尖锐的GFP洗脱峰，且该柱对GFP与其他蛋白质的分离效果也最佳。其他测试的1 ml HiTrap HIC柱包括苯基快速流低取代（Phenyl FF (low sub)）、丁基快速流（butyl FF）、丁基-S快速流（butyl-S FF）和辛基快速流（octyl FF）。

图6. 样品洗脱液中GFP的典型运行后可视化结果。洗脱组分以每分钟1管的速率收集，并对每管进行GFP含量分析。在此代表性图示中，苯基FF（高取代）预实验的第10、12、14、16和18组分的培养管在环境室内（荧光）光和紫外（UV）光下进行观察。各管均以正面（左图）和俯视（右图）两种视角观察。左侧UV图中的弥散蓝色为UV灯发出的光。在两张UV图像中，第14组分均清晰可见GFP（绿色）信号。上方图示显示了被观察的5个组分的总蛋白（A280，蓝线）和GFP（A₃₉₇，绿线）色谱图谱。

讨论

液相色谱技术已被证明在制备高纯度蛋白质方面具有重要价值，这些蛋白质是开展免疫学⁶、生物化学⁷和结构学⁸研究所必需的。疏水相互作用色谱（HIC）纯化方法通常需要通过实验确定最佳介质，且配体结构、配体密度以及基质微球的性质均已被证明会影响色谱结果^{2, 3}。自动柱筛选是一种高效的方法，可用于选择适合后续优化及蛋白质纯化的HIC介质⁴。所介绍的自动柱筛选方法可轻松适用于多种HIC蛋白质纯化策略。改变盐浓度、盐种类、盐梯度和pH值可能进一步优化纯化条件，这些关键参数的影响此前已有综述^13,14。含有部分纯化目标蛋白的HIC洗脱液可进一步采用互补的色谱技术进行纯化，例如离子交换色谱（IEX）或凝胶过滤/尺寸排阻色谱^9,10。

由于绿色荧光蛋白（GFP）具有独特的光吸收和发射特性，因此可通过在线检测和运行后分析方法来识别其洗脱曲线。基于此，本方案还可进一步适用于重组GFP融合蛋白的纯化，其中将目标蛋白与GFP进行“标记”。GFP标记的目标蛋白可通过紫外光检测¹¹，并利用多种色谱方法进行纯化，包括上述的疏水相互作用色谱（HIC）纯化策略。此外，GFP的纯化已成为生物化学实验教学中的经典内容，广泛用于讲授现代蛋白质科学技术¹²。

尽管使用性能较弱的色谱系统也可进行基本的疏水相互作用层析（HIC）蛋白纯化，但本文所介绍的仪器系统在获得理想实验结果方面具有多项显著优势。使用高度自动化系统的显著优点包括：提高了运行间条件的重现性、节省时间，并减少了空气进入系统的可能性¹⁰。由系统增强模块（system maximizer）支持的系统控制缓冲液混合功能，有助于提高缓冲液配制的一致性和实验的可重复性。在所有预实验运行中，将足量样品加载至动态样品环中，可进一步确保加入每根层析柱的样品均一，并支持连续运行而无需中断或手动重新加样。通过样品环将样品可控地注入层析柱，可降低手动加样可能带来的变异性。成对的层析柱选择阀允许连续进行样品运行，每次使用不同的HIC层析柱，而无需重新连接管路。多波长分析在检测具有独特分光光度特征的蛋白质时尤为有利。除绿色荧光蛋白（GFP）外，细胞色素、黄素蛋白以及其他含血红素的蛋白质也可能从该技术中受益。电导率和pH监测装置可用于实时验证实验条件。分流式组分收集功能可改善组分处理，并便于将少量样品转移至后续分析方法（如ELISA、SDS-PAGE、Western印迹和Experion微流控电泳）。尽管第二台组分收集器离线操作需要手动同步，但这提供了在选择组分收集器时的最大灵活性。使用如此高性能的色谱系统进行HIC层析柱筛选和蛋白纯化最主要的缺点是仪器购置和操作人员培训所需的初始时间和经费投入。

本文所述方案采用 Bio-Rad DuoFlow 层析系统；然而，其他厂商生产的性能相当的仪器，例如 GE Healthcare 的 ÄKTA Avant，同样可以使用，并能够获得等效的结果。即使类似的层析系统也具有各自独特的特性（如方法编程、组件命名、操作者偏好以及可放大性限制），在启动纯化程序或采购仪器之前应予以充分考虑。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 系统	Bio-Rad	7602257	包含系统增强模块、混合器、F10 工作站、AVR7-3 阀、带流通池的 QuadTec UV/Vis 检测器、BioFrac 组分收集器、BioLogic 软件和入门套件
AVR9-8 流路选择阀	Bio-Rad	7600408
分流阀 SV3-2	Bio-Rad	7500410
流路分流阀	Bio-Rad	7410017
DynaLoop 25 套件	Bio-Rad	7500451
BioFrac 组分收集器	Bio-Rad	7410002	使用两个组分收集器
BioFrac 微孔板滴加头适配器	Bio-Rad	74010088
BioFrac 微量滴定板适配器	Bio-Rad	7410017
紫外光学模块	Bio-Rad	7500202
卤素灯	Bio-Rad	7601331
Econo 梯度泵	Bio-Rad	7319001
Experion 系统	Bio-Rad	7007001
Experion Pro260 分析试剂盒	Bio-Rad	7007102
HiTrap HIC 柱筛选试剂盒	GE Healthcare	28-4110-07	包含 7 支 1 ml 预装 HIC 介质的层析柱，用于条件筛选
GE Healthcare 至 Bio-Rad 柱接头	GE Healthcare	18111251 和 18111257