本文介绍了一种用于自动筛选适用于蛋白质纯化过程中疏水相互作用色谱（HIC）介质的自动化方法。该方法采用中压液相色谱系统，包含自动缓冲液配制、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能。
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摘要
摘要
与其他蛋白质纯化色谱方法（如凝胶过滤、亲和层析和离子交换层析）不同，疏水相互作用色谱（HIC）通常需要通过实验确定（称为筛选或“ scouting”）以选择最适合纯化特定蛋白质的色谱介质1。本文所述方法介绍了一种自动化的策略，用于筛选最适合蛋白质纯化的HIC介质。
疏水相互作用层析（HIC）根据蛋白质和其他生物分子疏水性的差异，从粗裂解液中将其分离。与亲和层析（AC）和离子交换层析（IEX）类似，HIC 在层析过程中能够对目标蛋白进行浓缩。最适合采用 HIC 进行纯化的蛋白质通常具有疏水性表面区域，并能够耐受高于 2 M 的硫酸铵（(NH4)2SO4）盐浓度。当目标蛋白缺乏亲和标签而无法使用 AC，或 IEX 无法实现充分纯化时，HIC 常被选为纯化方法。蛋白质表面的疏水基团会暂时结合到连接于惰性、不溶性基质上的非极性配体。蛋白质与配体之间的相互作用高度依赖于流经层析柱的缓冲液中的盐浓度：高离子强度可增强蛋白质与配体的结合，使蛋白质保持不移动状态（即结合在柱内）2。随着盐浓度降低，蛋白质与配体之间的相互作用减弱，蛋白质重新变为可移动状态并从柱中洗脱出来。目前市面上有多种预装柱形式的 HIC 介质，每种介质均含有不同的疏水性配体（例如 S-丁基、丁基、辛基和苯基），以不同密度交联于特定直径的琼脂糖微球上3。通过自动化的柱筛选系统，可高效地确定在后续更深入的优化实验及蛋白质纯化过程中应选用的 HIC 介质4。
此处纯化的特定蛋白为重组绿色荧光蛋白（GFP）；然而，该方法也可适用于纯化具有一个或多个疏水表面区域的其他蛋白。由于GFP具有稳定性、在397 nm处独特的光吸收峰以及在紫外光照射下产生荧光的特性，因此是一种有用的模型蛋白5。含有野生型GFP的细菌裂解液在高盐缓冲液中制备后，加载至Bio-Rad DuoFlow中压液相色谱系统，并吸附到含有不同疏水相互作用层析（HIC）介质的HiTrap HIC柱上。蛋白从层析柱中洗脱，并通过在线及运行后检测方法进行分析。缓冲液梯度混合、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能增强了系统的操作灵活性及实验方法的可重复性。
方案
1. 缓冲液与样品制备
- 技术说明：所有缓冲液均应冷藏，除非另有说明，本方案的每一步操作均需在冰上或 4 °C 下进行。低温对于防止待纯化蛋白的降解以及确保最佳操作条件至关重要。若疏水相互作用层析（HIC）介质在室温下操作，可能导致不同的分离效果，因此层析系统应在 4 °C 的冷藏室或冷箱中运行。
- 配制以下缓冲液各 500 ml：200 mM NaH2PO4（缓冲液 A1）、200 mM Na2HPO4（缓冲液 A2）和 4.8 M (NH4)2SO4（缓冲液 B2）。同时使用去离子水（缓冲液 B1）。对缓冲液进行脱气处理，以确保最佳的层析操作条件。系统优化器将混合缓冲液 A1 和 A2，生成低盐磷酸盐洗脱缓冲液；同时混合缓冲液 B1 和 B2，生成高盐硫酸铵起始缓冲液（2.4 M (NH4)2SO4）。
- 通过将含有待纯化蛋白的 10 ml 细胞裂解液与 10 ml 缓冲液 B2 混合，制备 20 ml 上样样品。细胞裂解液样品溶液中硫酸铵的终浓度应约为 2.4 M (NH4)2SO4，使其大致与起始缓冲液相当。可通过将细菌细胞沉淀重悬于 TE 缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）中，随后进行超声处理，或加入 1 mg/ml 溶菌酶并在 3,700 × g 离心 10 分钟，来制备细胞裂解液。
- 将裂解液与缓冲液的混合物通过低蛋白结合的 0.45 μm 注射器滤器过滤，以去除溶液中的颗粒物。样品在上样前应始终保持在冰上。
2. DuoFlow 层析系统的物理安装与管路连接
- 确保所有设备的电源和通信连接均已正确连接。设备应在 Biologic DuoFlow 层析软件的手动控制窗口中可见。设备汇总见表1。系统示意图和管路连接图见图2。
- 将阀门的电气连接分别连接至泵工作站和系统扩展器（system maximizer）端口，使端口号按逻辑顺序排列。为每个阀门标记其对应的端口号，以便后续参考。泵工作站和系统扩展器作为计算机/控制器与层析系统之间的主要通信接口。当阀门连接至任一设备时，软件将自动识别并显示这些阀门。
- 技术说明：在手动模式下操作层析系统时，各阀门独立控制。在启动缓冲液流动前，特别是在切换阀门时，务必确认已配置所需的流路。
- 将聚四氟乙烯（Teflon）管浸入缓冲液 A1、A2、B1 和 B2 中。确保缓冲液体积充足，能够满足整个实验流程的需要，并保证管路始终处于液面以下。准备 500 ml 的缓冲液 A1、A2 和 B2，以及 1 L 的缓冲液 B1 即可满足需求。
- 按照图2所示及制造商说明，连接样品加载阀和动态样品环。使用尽可能短的管路将样品环连接至样品阀进样口（位置3），以最大限度减少样品加载过程中的稀释。
- 尽量缩短样品、样品加载泵与样品加载阀进样口（位置2）之间的管路长度，以减少填充样品环所需的样品量。
- 准备8对尺寸完全相同的1/16英寸外径PEEK管，每对通过一个1/4-28母对1/4-28母接头连接。将这些管对分别连接至两个柱切换阀的位置1-8。连接在柱切换阀位置2-8的7个接头后续将被待测试的层析柱替换；连接在位置1的接头将保留作为层析柱旁路。
- 技术说明：确保每对管路连接在两个柱切换阀的相同位置上。
- 打开四波长紫外/可见光检测器（QuadTec）灯和固定波长280 nm紫外检测器灯。本实验方案中，QuadTec检测的波长包括214 nm、280 nm和397 nm。同时使用固定波长紫外检测器和QuadTec检测280 nm信号，可提供系统冗余，确保数据有效性。
- 根据制造商说明确认所有检测器已完成校准。背压调节器有助于减少检测器中气泡的积聚，应安装在检测器下游、pH监测器上游的位置。
- 本系统配备两个组分收集器，便于运行结束后对洗脱液进行分析。按照图2所示连接组分收集器、分流阀和分流控制器。连接至分流阀位置1的组分收集器将在12 ml培养管中收集900 μl的洗脱组分，而连接至位置2的组分收集器将在96孔微孔板中收集100 μl的洗脱组分。
- 位置2的组分收集器、分流阀和分流控制器独立于层析工作站运行。分流控制器集成在Bio-Rad Econo Gradient Pump设备内，但该设备的泵组件不被使用。当分流阀连接至Econo Gradient Pump时，设备上将显示“% Split”设置选项。
- 将% Split设置为10。位置1的组分收集器将收集90%的洗脱液（900 μl/组分），位置2的组分收集器将收集10%（100 μl/组分）。两个组分收集器将同步推进，使两者的组分编号相互对应。
- 将位置2组分收集器上的标准滴头更换为微孔板专用滴头。微孔板滴头具有更小的出口孔径，可实现比标准50 μl更小50%的液滴体积（即25 μl），在收集≤500 μl的组分时尤为有利。
- 通过屏幕控制面板，设置位置2的组分收集器在96孔板中收集组分，并以1个样品/分钟的速度推进。分流控制器和位置2的组分收集器将在首次层析运行开始后立即手动启动。
- 使用缓冲液B1冲洗位置2的组分收集器和微孔板滴头。
3. 引导系统管路、设置运行方法及平衡疏水相互作用色谱柱
- 将系统最大化进样管路浸入已脱气的缓冲液 A1、A2、B1 和 B2 中，根据制造商说明启动工作站泵，冲洗样品环并冲洗色谱系统。完成引液步骤时，需确保全部 4 个最大化系统进样口（A1、A2、B1 和 B2）均处于脱气缓冲液中，以彻底排除残留气泡。
- 系统准备需通过 BioLogic 软件手动操作系统的控制器。在启动缓冲液流动前，确认样品上样阀和柱切换阀的位置正确。
- 按照步骤 3.4–3.5 所述，准备以 1 ml/分钟的手动流速将洗脱缓冲液（0 %B）流经系统。
- 在 BioLogic 程序软件的设置窗口中，选择“使用缓冲液混合”和“含硫酸铵的磷酸盐缓冲液”。确认设置窗口中列出的缓冲液 A1、A2、B1 和 B2 与实际配制的缓冲液一致。
- 手动设定流速为 1 ml/分钟的洗脱缓冲液（0 %B）。观察背压、电导率、紫外吸收曲线和 pH 值保持稳定并在正常操作范围内。若出现异常，表明存在气泡或柱堵塞，需在继续操作前排除。
- 用 5 ml 洗脱缓冲液（0 %B）冲洗全部 8 条柱切换管路。操作方法为：先停止流动，将两个柱切换阀均设为位置 2，再恢复 1 ml/分钟的流速（0 %B）。对位置 3–8 的柱切换管路重复此操作。
- 将 1 ml HiTrap HIC 柱连接至柱切换阀的位置 2–8。每次仅对一个柱执行步骤 3.8–3.13。记录每个 HIC 柱所安装的切换阀位置。表 2 列出了 HIC 柱填料特性的汇总信息。
- 将 GE Healthcare 的 HiTrap 柱连接至 Bio-Rad DuoFlow 系统，需使用一系列包含 1/4-28、M6 和鲁尔接头的连接件。拆下连接位置 2 柱切换阀的接头。按照 图 3 所示对齐 Bio-Rad 与 GE Healthcare 的接头。
- 将柱上游接头连接至 DuoFlow 系统。为避免在柱或管路中截留气泡，应将上游柱接头牢固连接至上游切换阀接头。让洗脱缓冲液流经接头，直至所有气泡排出，并在末端形成一大滴缓冲液。暂时停止缓冲液流动。
- 取下连接在柱入口的堵头，并在柱顶部加一大滴低盐缓冲液（0 %B）。将柱连接至上游接头。确保柱入口和上游接头均被缓冲液滴覆盖，以保证连接无气泡。
- 若柱为首次使用，需折断柱出口端的封帽。将出口连接至下游柱接头和切换阀管路。确认所有接头均已牢固拧紧。
- 将背压限值设为 40 psi。以 1 ml/分钟的流速，用 5 柱体积（5 柱体积 = 5 ml）的洗脱缓冲液（0 %B）清洗柱。必要时继续清洗，直至 pH、紫外吸收曲线和背压稳定。
- 以 1 ml/分钟的流速，用 10 柱体积（10 ml）的起始缓冲液（100 %B）清洗柱。必要时继续清洗，直至前一步骤中列出的系统参数以及电导率均稳定。
- 上述准备好的 HIC 柱现已可以上样。当所有待测试的柱均准备完毕后，手动将柱切换阀切换至位置 1（接头），并停止缓冲液流动。
4. 样品上样
- 将样品进样管浸入 20 ml 样品中，开始将样品加载至动态样品环。在 BioLogic 软件的手动设置窗口中，将样品环加载/清洗阀切换至位置 1（样品），并将样品加载阀切换至“冲洗”（Purge）。
- 启动样品环加载泵，以 1 ml/分钟的流速将样品吸入泵管中，直至样品刚刚到达样品加载阀为止。此步骤可去除样品加载管路中的缓冲液和/或空气。
- 停止加载泵的流动，将样品加载阀从“冲洗”（Purge）切换至“加载”（Load）。以 1 ml/分钟的流速重新启动样品环加载泵，直至有 10 ml 样品被吸入动态样品环中。
- 此时已向动态样品环中加载了足够用于最多 10 次连续疏水相互作用色谱柱筛选运行的样品量。
5. 编程软件方法并运行柱筛选方案
- 在 BioLogic 软件的设置窗口中，选择 表 1 中用星号标记的系统设备。
- 选择 6 根疏水相互作用色谱（HIC）柱进行分析。按照表 3 所示，程序化设置一个线性递减盐梯度和 6 柱筛选方法。该方法程序基于 BioLogic 软件 HIC 柱设置修改而来，并已针对当前应用进行了优化。
- 由于馏分收集器的限制，建议采用 6 柱筛选方法。如果将程序方法调整为收集更大体积的馏分，则可对全部 7 根色谱柱进行筛选。在程序尚未完全设定完成前，不要添加筛选步骤，因为一旦启用筛选功能，将无法进行后续编辑。
- 开始筛选运行。手动启动起始缓冲液（100 %B）流动，流速为 1 ml/分钟。按下分流控制器上的启动按钮，使洗脱液流按 90%-10% 的比例分别进入 12 ml 培养管馏分收集器（位置 1）和 96 孔板馏分收集器（位置 2）。技术说明：请注意，96 孔板馏分收集器是脱离 BioLogic 软件离线操作的。
- 运行程序方法。在启动程序方法运行后，立即点击离线 96 孔板馏分收集器屏幕控制面板上的启动按钮。如果两个馏分收集器未完全同步，则当另一个馏分收集器进入第二个收集管时，需手动推进离线 96 孔板馏分收集器至对应位置。
- 观察实时显示以确认预期的运行参数。反压、电导率和 %B（图 4）是可用于监测的运行参数，以确保各色谱柱之间运行条件的可重复性。还应监测阀位、pH 值和样品上样情况。可通过比较紫外（UV）图谱来验证流出峰的相似性。
- 利用在线和运行后洗脱液分析技术，确定目标蛋白（即“目标蛋白”）的洗脱曲线和纯化效果。
- 对于含有绿色荧光蛋白（GFP）的样品，可利用其在 397 nm 处独特的紫外吸收在线观察洗脱过程。将 GFP 特异性的 397 nm 吸光度图谱与总蛋白在 280 nm 处的吸光度图谱进行比较，以评估不同 HIC 介质筛选条件下的相对分离和纯化效果（图 5）。
- 运行后对 GFP 及其他目标蛋白的分析可通过多种方法完成。可将 96 孔板中各馏分的 5–50 μl 等分试样转移至新板，通过 ELISA 或 Western 印迹法检测特异性蛋白含量；各馏分的总蛋白含量可通过常规 SDS-PAGE 或 Experion 微流控电泳系统进行分析。GFP 荧光可在 12 ml 培养管中通过紫外光检测（图 6）。
- 通过比较 GFP 洗脱峰相对于样品中其他蛋白的洗脱行为，可确定最具潜力的 HIC 介质。随后可根据其他参数（包括起始缓冲液类型、浓度和 pH 值）进一步优化该介质的纯化条件。
- 技术说明：实验结束后，将所有进液管插入缓冲液 B1（脱气 H2O）中，用水彻底冲洗泵、阀门和所有管路。请遵循制造商关于色谱系统和 HIC 柱清洁及长期储存的说明。
6. 代表性结果：
代表性HIC盐梯度、电导率及柱压的预实验结果如图所示 图4盐浓度的变化（蓝线）是疏水相互作用层析（HIC）方法的典型特征，通过从高盐缓冲液通道中引出缓冲液的百分比来测定。随着盐浓度降低，结合在层析柱上的蛋白质逐步洗脱。电导率（红线）反映了实际盐浓度，在QuadTec和紫外检测器之后立即进行在线检测。盐梯度与电导率曲线之间的偏移表明缓冲液从进样口流经系统到达电导监测器所需的时间。在整个样品运行过程中，系统压力（灰线）和pH值保持相对稳定。
图5展示了连续进行的疏水相互作用色谱（HIC）柱筛选实验的色谱图。通过分别测量280 nm和397 nm波长下的光吸收，可实现对总蛋白（A280，蓝线）和绿色荧光蛋白（GFP，A397，绿线）的在线检测。通过比较这两条曲线，可以估算每次筛选实验中GFP的相对丰度及其分离效果。GFP与所测试的HIC柱结合的亲和力程度不同，其洗脱谱图也有所差异。选择后续纯化所用的最佳HIC柱的依据是：确定能够产生最尖锐的GFP洗脱峰以及与其他蛋白分离度最高的色谱柱。
在图6中，苯基疏水相互作用层析（Phenyl FF，高取代）预实验中第10、12、14、16和18组分的培养管分别在常光（荧光灯）和紫外光（UV）下进行观察。培养管以正面（左图）和俯视（右图）两种视角观察，以检测绿色荧光蛋白（GFP）的特征性发射光谱。在两张紫外光图像中，第14组分均清晰可见GFP（绿色）荧光信号。这些洗脱后观察结果与在线检测结果一致：通过测定洗脱液在397 nm处的吸光度（A397，绿色曲线），同样显示第14组分为洗脱GFP的主要峰。左图紫外光图像中的弥散蓝色光为紫外灯发出的光源。
图 1。本实验方案的示意图。制备含有目标蛋白（GFP，目标蛋白）的细菌裂解液，用高盐缓冲液稀释至与色谱起始缓冲液盐浓度相当，并进行过滤。色谱系统准备就绪后，将样品上样，并利用预装填的疏水相互作用色谱（HIC）柱中所含的疏水色谱介质，将目标蛋白从裂解液中的其他蛋白中分离出来。通过使用不同色谱介质重复多次分离（称为柱筛选），以确定哪种介质可实现最佳的GFP分离效果。洗脱出的蛋白（洗脱液）通过色谱系统内置检测器进行在线分析，并被收集为更小的组分，用于后续（运行后）分析。根据GFP活性及分离效果的在线和运行后分析结果，确定最优的HIC色谱柱及色谱介质。
表1. 本方案中使用的色谱系统关键组件。
图 2. 所采用的 Bio-Rad DuoFlow 中压液相色谱系统的示意图。该系统的主要特征包括自动缓冲液混合、连续色谱柱运行时的样品加载、不同色谱柱的自动选择、洗脱液的在线分析，以及分级洗脱组分的串联收集。详见正文及表 1。
表2. 所测试疏水相互作用色谱介质的生物物理特性。HiTrap HIC 柱的名称反映了其配体、配体密度和珠粒大小。
*FF = 快流速；HP = 高性能。较大的珠粒尺寸可提高配体结合能力和流速，较小的珠粒尺寸可提高色谱分辨率。信息来源于制造商提供的文献。
图 3. 将 GE Healthcare HiTrap HIC 柱连接至 Bio-Rad DuoFlow 系统。在上游 1/4-28 Delrin 螺母和卡环（A1）上，连接一个公Luer转母1/4-28接头（B1）和一个公1/16"转母Luer接头（C）。在用缓冲液冲洗并排除所有气泡后，将这些接头连接至 HiTrap 柱。柱出口连接一个母1/16"转公M6接头（D）、公Luer转母M6接头（E）和母Luer转母1/4-28接头（B2）。整个组件连接至下游的1/4-28 Delrin螺母和卡环（A2）。上图显示接头分离状态，下图显示接头组装后的状态。
| 步骤 # | 体积（mL） | 描述 | 参数 | |
| 1 | 0.00 | 在整个运行过程中收集1.0 mL的馏分 | ||
| 2 | 0.00 | 切换列 | HIC 柱 1 （位置 2） | |
| 3 | 0.00 | 等度洗脱 | pH：6.80 100% B | 体积：2.00 mL 流速：1.00 mL/min |
| 4 | 2.00 | 零基线 | QuadTec | |
| 5 | 2.00 | 零基线 | 紫外检测器 | |
| 6 | 2.00 | 注入样品 | 样品加载 动态环 | 自动进样阀 体积：0.50 mL 流速：1.00 mL/min |
| 7 | 3.00 | 等度洗脱 | pH：6.80 100% B | 体积：5.00 mL 流速：1.00 mL/min |
| 8 | 8.00 | 线性梯度 | pH：6.80 100% B> 0% B | 体积：10.00 mL 流速：1.00 mL/min |
| 9 | 18.00 | 等度洗脱 | pH：6.80 0% B | 体积：3.00 mL 流速：1.00 mL/min |
| 10 | 21.00 | 等度洗脱 | pH：6.80 100%B | 体积：5.00 mL 流速：1.00 mL/min |
| 11 | 26.00 | 切换列 | 联合 （位置1） | |
| 结束 | 26.00 | 实验方案结束 | 自动重复，另含5个HIC柱 （第3-7位） | |
| 侦察型 | 运行次数：6 | 已探索步骤数：1 | ||
表3. 采用的HIC初步筛选方法的BioLogic软件操作程序。
图 4. 典型的疏水相互作用色谱（HIC）盐梯度、电导率和柱压变化。随着盐浓度（蓝线）降低，电导率（红线）也随之下降。盐梯度与电导率曲线之间的偏移反映了缓冲液从缓冲液入口流至电导率监测器所需的时间。在初步筛选运行期间，系统压力（灰线）保持相对恒定。
图 5. 连续进行的HiTrap疏水相互作用色谱（HIC）柱筛选实验合并色谱图。通过分别测量280 nm和397 nm波长下的光吸收值，实现对总蛋白（A280，蓝色线）和GFP（A397，绿色线）的在线检测。在本系列实验中，使用Phenyl FF（高取代）柱时观察到最尖锐的GFP洗脱峰，且该柱对GFP与其他蛋白的分离效果也最佳。此外测试的其他1 ml HiTrap HIC柱包括Phenyl fast flow低取代柱（Phenyl FF（低取代））、丁基fast flow柱（butyl FF）、丁基-S fast flow柱（butyl-S FF）和辛基fast flow柱（octyl FF）。
图6. 样品洗脱液中GFP的典型运行后可视化结果。洗脱馏分以每分钟1管的速率收集，并对每管进行GFP含量分析。在此代表性图示中，苯基FF（高取代）预筛运行的第10、12、14、16和18馏分在环境室内（荧光）光和紫外（UV）光下观察。各管均以正面（左图）和俯视（右图）两种方式观察。左图UV图像中的弥散蓝色为UV灯发出的光线。在两幅UV图像中，第14馏分均清晰可见GFP（绿色）信号。上方图示显示了被观察的5个馏分的总蛋白（A280，蓝色线）和GFP（A397，绿色线）色谱图谱。
讨论
液相色谱技术已被证明在制备高纯度蛋白质方面具有重要价值，这些蛋白质是开展免疫学6、生物化学7和结构学8研究所必需的。疏水相互作用色谱（HIC）纯化方法通常需要通过实验确定最佳介质，且配体结构、配体密度以及基质微球的性质均已被证明会影响色谱结果2, 3。自动柱筛选是一种高效的方法，可用于选择适合后续优化及蛋白质纯化的HIC介质4。所介绍的自动柱筛选方法可轻松适用于多种HIC蛋白质纯化策略。改变盐浓度、盐种类、盐梯度和pH值可能进一步优化纯化条件，这些关键参数的影响此前已有综述13,14。含有部分纯化目标蛋白的HIC洗脱液可进一步采用互补的色谱技术进行纯化，例如离子交换色谱（IEX）或凝胶过滤/尺寸排阻色谱9,10。
由于绿色荧光蛋白（GFP）具有独特的光吸收和发射特性，因此可通过在线检测和运行后分析方法来识别其洗脱曲线。基于此，本方案还可进一步适用于重组GFP融合蛋白的纯化，其中将目标蛋白与GFP进行“标记”。GFP标记的目标蛋白可通过紫外光检测11，并利用多种色谱方法进行纯化，包括上述的疏水相互作用色谱（HIC）纯化策略。此外，GFP的纯化已成为生物化学实验教学中的经典内容，广泛用于讲授现代蛋白质科学技术12。
尽管使用性能较弱的色谱系统也可进行基本的疏水相互作用层析（HIC）蛋白纯化，但本文所介绍的仪器系统在获得理想实验结果方面具有多项显著优势。使用高度自动化系统的显著优点包括：提高了运行间条件的重现性、节省时间，并减少了空气进入系统的可能性10。由系统增强模块（system maximizer）支持的系统控制缓冲液混合功能，有助于提高缓冲液配制的一致性和实验的可重复性。在所有预实验运行中，将足量样品加载至动态样品环中，可进一步确保加入每根层析柱的样品均一，并支持连续运行而无需中断或手动重新加样。通过样品环将样品可控地注入层析柱，可降低手动加样可能带来的变异性。成对的层析柱选择阀允许连续进行样品运行，每次使用不同的HIC层析柱，而无需重新连接管路。多波长分析在检测具有独特分光光度特征的蛋白质时尤为有利。除绿色荧光蛋白（GFP）外，细胞色素、黄素蛋白以及其他含血红素的蛋白质也可能从该技术中受益。电导率和pH监测装置可用于实时验证实验条件。分流式组分收集功能可改善组分处理，并便于将少量样品转移至后续分析方法（如ELISA、SDS-PAGE、Western印迹和Experion微流控电泳）。尽管第二台组分收集器离线操作需要手动同步，但这提供了在选择组分收集器时的最大灵活性。使用如此高性能的色谱系统进行HIC层析柱筛选和蛋白纯化最主要的缺点是仪器购置和操作人员培训所需的初始时间和经费投入。
本文所述方案采用 Bio-Rad DuoFlow 层析系统；然而，其他厂商生产的性能相当的仪器，例如 GE Healthcare 的 ÄKTA Avant，同样可以使用，并能够获得等效的结果。即使类似的层析系统也具有各自独特的特性（如方法编程、组件命名、操作者偏好以及可放大性限制），在启动纯化程序或采购仪器之前应予以充分考虑。
披露
层析试剂及补充仪器由 Bio-Rad 提供。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM086822 和美国国家科学基金会重大研究仪器项目 DBI-0960313 资助。作者谨此感谢 Bio-Rad 公司的 Jon Miyake 博士与 Donna Hardy 博士以及西雅图大学的 Jennifer Loertscher 在技术方面的专业支持。部分层析试剂和补充仪器由 Bio-Rad 公司慷慨提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 系统 | Bio-Rad | 7602257 | 包含系统增强模块、混合器、F10 工作站、AVR7-3 阀、带流通池的 QuadTec UV/Vis 检测器、BioFrac 组分收集器、BioLogic 软件和入门套件 |
| AVR9-8 流路选择阀 | Bio-Rad | 7600408 | |
| 分流阀 SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| 流路分流阀 | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 套件 | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac 组分收集器 | Bio-Rad | 7410002 | 使用两个组分收集器 |
| BioFrac 微孔板滴加头适配器 | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac 微量滴定板适配器 | Bio-Rad | 7410017 | |
| 紫外光学模块 | Bio-Rad | 7500202 | |
| 卤素灯 | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo 梯度泵 | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion 系统 | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 分析试剂盒 | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC 柱筛选试剂盒 | GE Healthcare | 28-4110-07 | 包含 7 支 1 ml 预装 HIC 介质的层析柱，用于条件筛选 |
| GE Healthcare 至 Bio-Rad 柱接头 | GE Healthcare | 18111251 和 18111257 |
参考文献
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