神经前体细胞移植是一种有前景的策略，可用于保护和/或替代脊髓损伤（SCI）及运动神经元病——肌萎缩侧索硬化症（ALS）中丧失或功能异常的颈段膈运动神经元。本文提供了在ALS和SCI啮齿类动物模型中，将细胞递送至颈段脊髓前角的实验方案。
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摘要
摘要
由于膈肌运动神经元丧失导致的呼吸功能受损是大多数人类创伤性脊髓损伤（SCI）病例中的一种致残性后果1，也是运动神经元疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者死亡的最终原因2。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经系统疾病，其特征是上、下运动神经元相对较快地退化。由于膈肌的膈神经运动神经元支配丧失导致呼吸麻痹，患者通常在确诊后平均2-5年内死于该病3。绝大多数病例为散发性，仅有10%为家族性类型。约20%的家族性病例与21号染色体上的铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的多种点突变相关4。目前已培育出携带突变人源SOD1基因（G93A、G37R、G86R、G85R）的转基因小鼠4,5和大鼠6，尽管还存在其他运动神经元丢失的动物模型，但这些转基因动物模型仍是目前应用最广泛的疾病模型。
脊髓损伤（SCI）是一组由脊髓物理性创伤引起的异质性病症，其功能预后因损伤的类型、部位和严重程度而异7。然而，大约一半的人类SCI病例影响颈段脊髓，导致膈肌运动神经元丧失以及下行球脊呼吸轴突受损，从而引发严重的呼吸功能障碍1。目前已开发出多种脊髓损伤的动物模型，其中最常用且具有临床相关性的是挫伤模型8。
由于神经前体细胞（NPCs）具有替代丢失或功能异常的中枢神经系统细胞类型、提供神经保护以及递送目的基因因子的能力，因此移植多种类别的神经前体细胞被认为是治疗创伤性中枢神经系统损伤和神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症和脊髓损伤）的一种有前景的治疗策略9。
肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓损伤（SCI）的动物模型能够模拟这些疾病的多种临床相关特征，包括膈肌运动神经元的丧失及其导致的呼吸功能受损10,11。为了评估基于神经前体细胞（NPC）的治疗策略在这些ALS和SCI动物模型中对呼吸功能的疗效，必须将细胞干预精准地靶向至包含治疗相关靶点（如膈肌运动神经元）的特定区域。本文提供了一种详细的实验方案，用于在神经退行性疾病模型（如SOD1G93A小鼠和大鼠）以及脊髓损伤的大鼠和小鼠中，将NPC多节段地移植至颈段脊髓腹侧灰质11。
方案
方法
1. 细胞制备
以制备用于移植的胶质前体细胞12为例，我们将描述其操作步骤，因为我们在该细胞类型方面具有相关经验。然而，具体实验方案的细节（例如培养基的种类和胰蛋白酶的使用）将取决于实际用于移植的特定细胞类型。
- 将所有溶液在水浴中预热至 37.0°C。
- 用 HBSS 清洗烧瓶 2 次。每 T-75 烧瓶加入 5.0 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA。将烧瓶置于 37.0°C 培养箱中孵育 3 分钟。用 5 或 10 mL 移液管在烧瓶中轻轻吹打 3 次。
可选：每 T-75 培养瓶加入 5.0 mL 含 1.0 mg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂的 DMEM/F12 培养基。
- 用 5.0 mL 培养基将每个锥形瓶清洗 2 次。收集细胞及清洗液。所有后续步骤中均需将细胞置于冰上。
- 在锥形管中以 200–300 g 离心 5 分钟：建议使用预冷至 4°C 的离心机。弃去（并保存）上清液。用 1.0 mL 培养基重悬细胞，转移至 1.5 mL Eppendorf 管中。
- 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞活力。
- 在 1.5 mL 管中再次离心（800 RPM，10 分钟）：建议使用预冷至 4°C 的离心机。弃去（并保存）上清液。
- 用适量终体积的培养基重悬细胞，以达到所需的细胞密度。
- 将细胞悬液分装至多个 1.5 mL Eppendorf 管中。移植前将细胞置于湿冰上保存。
请勿使用0.75 mL离心管，因为Hamilton注射器/针头无法深入插入此类管中。手术过程中可能需要进行多次注射，应避免反复扰动同一管细胞。建议制备的细胞悬液量至少比实际所需多出50%。整个手术过程中应将细胞置于冰上保存。为确保移植后细胞具有最佳的存活率，应在制备细胞悬液后的4-5小时内完成细胞移植。
2. 手术前准备
- 在手术前进行相关的基线行为评估。
- 免疫抑制：应在移植前至少3天开始使用皮下注射环孢素A（CSA：10.0 mg/kg体重）或腹腔注射（I.P.）FK-506/雷帕霉素（1.0 mg/kg体重），并持续每日给药直至处死动物。不建议通过饮水给药（替代每日注射）。当移植啮齿类来源细胞时，我们首选CSA作为免疫抑制剂；当移植人类来源细胞时，则首选FK-506/雷帕霉素。
- 手术前对所有手术器械进行高压灭菌。准备一个整洁有序的手术操作区域，以及一个不杂乱的器械放置区域。玻璃珠灭菌器也非常有用。术中应始终保持所有器械清洁（尤其是咬骨钳），这将使手术操作更加顺利。手术过程中使用的所有材料均须无菌。
- 对于无法灭菌的器械（如手术显微镜），应使用适当的消毒剂擦拭，并用无菌材料（例如纱布）覆盖手柄部分，以确保外科医生在佩戴无菌手套后不会污染手套。
- 外科医生在开始手术前应使用消毒剂（氯己定清洗液）洗手。手术过程中需佩戴无菌手套、口罩和清洁手术服。
3. 手术：动物准备与手术操作
动物准备：
- 称量动物体重，并给予适当剂量的麻醉剂：异氟烷吸入麻醉，或腹腔注射麻醉混合液（包含马来酸乙酰丙嗪（0.7 mg/kg）、氯胺酮（95 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg））。
- 轻捏脚趾和/或使用眼睑反射（用棉签轻触上眼睑以观察是否眨眼）来判断动物是否已充分麻醉。手术前应涂抹人工泪膏以保护角膜。
- 使用电动剃刀（无需安装附件）剃除背部毛发，剃毛范围从耳部稍前方至动物背部中段。应彻底剃净，并清除皮肤表面的碎毛，防止毛发进入切口。手术备皮应在远离实际手术区域的位置进行，以避免散落的毛发污染手术部位。
- 用聚维酮碘消毒液浸湿纱布，涂抹于已剃毛的皮肤区域。应用聚维酮碘溶液对手术部位至少擦拭两次，注意从中心向外周方向擦拭。随后可用70%酒精或稀释的杀菌洗液冲洗。手术区域应覆盖无菌手术巾。
- 在整个手术过程中，强烈建议使用加热垫以维持动物正常体温，同时应持续监测体温。将动物置于卷起的纱布垫上；对于成年大鼠，纱布垫厚度约为1.0英寸，长度约为6.0英寸。将纱布垫用胶带固定于手术板上，防止移动。将动物置于纱布垫上，使其胸部/肩部处于水平位置。将双臂在垫上伸展，并用胶带固定于手术板上。此操作的目的是抬高颈椎脊髓，使其更易于手术操作，因为颈椎脊髓位于皮肤表面较深的位置。
手术：
- 在最低显微镜放大倍数下（我们使用 8 倍放大），用手术刀片做正中切口。另一只手将皮肤向两侧拉伸，使皮肤绷紧（这样更容易切开），从颅底向肩胛骨方向做切口。（见 图 1）
- 使用手术刀片切开脊柱上方的三层肌肉。另一只手从外侧向内侧轻轻挤压两侧肌肉。确保用手术刀施加足够的压力，以最少的切割次数切断所有肌肉层，避免切口参差不齐，这有助于术后缝合。但不要用力过猛，以免损伤深层组织（脊柱）。
- 使用两个棉签，以扭转动作将覆盖的肌肉与椎旁肌分离。此步骤可稍用力。切勿切割或撕裂，以免引起出血。使用棉签进行扭转动作可有效分离组织而不造成损伤或出血。如果手术过程中任何阶段发生出血，应保持耐心。切勿在大量出血时强行继续，因为血液会遮挡手术视野。可在出血部位进行电凝或轻压止血，但我们发现最有效的方法是耐心等待。通过练习，整个手术过程中应几乎无出血。
- 使用四个自制牵开器牵开肌肉（见图 2）。这些牵开器可用坚固的回形针弯折制成（见 图 2-插图）。手术前需对牵开器进行高压灭菌。应注意将牵开器末端磨钝，以避免组织损伤。将细线系在牵开器上。暴露区域应呈方形或矩形，可通过四个牵开器向四个角牵拉实现该形状。将细线固定在手术板上以固定牵开器（见 图 2）。也可使用市售牵开器，但我们更倾向于不使用。为确保整个手术过程中视野清晰，建立良好的手术野至关重要。切勿“盲目”操作。
- 清除脊柱背侧表面的椎旁肌。处理脊柱背侧表面的椎旁肌时，有两种可能的策略。第一种策略：使用鼠齿钳和中型弹簧剪将椎旁肌从椎体背侧表面去除。尽量靠近骨面进行切割，以更好地暴露骨面。切割方向应与椎体表面平行，但不要切至脊髓。第二种方法：在椎旁肌上做正中切口，并用较小的牵开器向两侧牵开。采用第二种方法时，术后可将肌肉缝合复位。
- 彻底清洁椎骨表面。使用咬骨钳（最重要的手术器械）将 C4、C5 和 C6 节段的肌肉剥离（见 图 3）。当然，这取决于目标脊柱节段。一手使用咬骨钳时，另一只手用鼠齿钳夹住 C2 突起处的肌肉以固定整个脊柱。C2 是手术视野中较大的头端突起，C3 也略位于肌肉下方。C4、C5 和 C6 易于操作，因为其上方肌肉覆盖较少。
- 从 C5 椎板切除术开始。再次用鼠齿钳夹住 C2 以固定。用咬骨钳夹住整个椎板（见示意图：靠近中线处夹取）。将咬骨钳调整至完全垂直于脊柱轴线。缓慢压碎椎板。切勿向下压入脊髓，以免损伤脊髓组织。压碎后轻轻向上提起碎骨片。咬骨钳应能将骨片压碎至易于拔除的程度。若骨片仍与其余椎板相连，切勿强行拉扯，以免引起出血或损伤脊髓。咬骨钳应保持清洁锋利。此类器械（如咬骨钳）应使用无菌生理盐水清洗或擦拭，生理盐水可置于无菌容器中（见 图 4）。
进行椎板切除初始开窗时，将咬骨钳垂直于脊柱放置较为理想。随后可将咬骨钳以约 30–60 度角轻轻插入骨下，进行小范围“咬除”，以扩大椎板切除范围。 - 将椎板切除范围扩展至 C4–C6 所有椎板。在三个脊柱节段的骨面上形成一个连续的开口。椎板切除范围可根据预期的脊髓内注射位置进行调整。
- 椎板切除术切勿过度向侧方扩展，以免引起出血。为靶向腹角，注射部位相对居中，因此无需将椎板切除范围过度向侧方延伸。（见 图 5）
- 将放大倍数提高至约 15 倍。
- 使用尖头直齿 #5 钳清除硬脊膜表面的结缔组织（及可能的干涸血液）。区分结缔组织与硬脊膜需通过经验积累。
- 使用微型弹簧剪或显微刀切开坚韧的硬脊膜层。切口应平行于脊柱轴线，位于背根丝进入区稍内侧。这有助于靶向腹角。（见 图 6）
- 使用尖头直齿 #5 钳夹住并轻微抬起硬脊膜，使其脱离脊髓。切勿夹伤脊髓。此操作需要一定练习。使用显微刀或极小弹簧剪进行切开。切勿损伤脊髓。
- 沿头尾方向轻微延长切口。硬脊膜的张力将使其轻微分离，从而充分暴露脊髓。
- 在每个预期注射部位进行相应切口。硬脊膜呈雾状半透明外观，而脊髓表面呈较亮的白色。需学会区分两者。建议不要尝试用注射针穿过硬脊膜进行注射。硬脊膜坚韧，难以穿透，且穿刺可能影响针头插入轨迹，从而影响细胞的解剖学靶向递送。
- 在三个节段双侧注射（共六个位点），以靶向颈膨大区域的较大范围。注射次数和位置当然取决于具体实验设计。
- 刺破硬脊膜后，脑脊液将流出。用纱布或棉签彻底吸干脊髓表面及整个暴露区域。
- 细胞注射使用 10.0μL Hamilton 气密 RN 注射器。
- 连接 33 号/45 度斜面金属 RN Hamilton 针头。针头应保持锋利。同一针头仅用于约 20 次注射（注射次数越少，针头越锋利）。也可使用拉制的玻璃毛细管作为针头。用环氧树脂将拉制的玻璃尖端连接至 26 号钝头 Hamilton 金属针头。在手术显微镜和千分尺载玻片下修剪外尖直径至约 75.0–100.0 μm（根据细胞直径调整：避免注射过程中损伤细胞）。我们更倾向于使用 33 号金属针头。
- 细胞在冰上的 Eppendorf 管中易沉降。在装填注射器前立即轻轻敲击管壁，使细胞重新悬浮。切勿剧烈敲击，以免损伤细胞或产生气泡。也可使用 20.0μL 移液器轻柔混匀细胞：仅上下吹打一至两次即可。
- 仅装填单个注射位点所需的细胞悬液量。若计划进行多次注射，细胞会在注射器内沉降。缓慢吸入细胞以避免产生气泡或损伤细胞。以我们实验室操作的胶质前体细胞为例，我们以每 1.0 μL 含 50,000–75,000 个细胞的浓度，在 2–5 分钟内注射 2.0 μL 细胞悬液。我们发现，每个位点注射 2 μL 在颈髓中不会造成组织损伤。相反，经验表明，若在该体积中显著增加细胞数量（尤其是细胞直径大于我们的胶质前体细胞：10.0–20.0 μm）可能损伤脊髓实质。我们曾进行广泛的细胞剂量实验，以确定每个注射位点的最佳细胞数量（至少在完整的颈髓中如此）。具体参数需根据细胞类型和疾病状态确定。
- 将注射器/针头与脊柱轴线平行对齐，以准确靶向目标解剖区域。针头倾斜角度应足够小（相对于手术台约 80 度），以避免碰撞手术显微镜镜头，但应尽可能接近 90 度。在显微镜下将针尖缓慢下移至脊髓背侧表面（见图 7）。
- 将针头对准背根丝进入区稍内侧（见 图 8）。用针尖轻轻接触脊髓表面，轻微下压脊髓。回撤针头直至脊髓恢复原状。使用显微操作仪上的标尺记录此位置为 z = 0.0。
注：我们常规在颈髓注射过程中不固定椎体。使用我们的麻醉方案，因呼吸深重导致的颈髓上下移动从未成为问题。然而，若呼吸深重确实影响操作，可使用定制框架通过改良钳夹在 C2 和 C7 节段轻柔夹住骨骼及周围椎旁肌以稳定脊柱，注意避免压碎椎骨或损伤下方脊髓组织。若动物在操作过程中呼吸变浅，应追加麻醉药物。手术应暂停，直至重新达到外科麻醉平面后再继续。 - 将针头轻微下移进入脊髓。操作时务必通过显微镜观察。在成年大鼠中，下移至 1.5 mm 深度以靶向腹角；在成年小鼠中，下移至 0.75 mm 深度以靶向腹角。（见 图 9）。这些深度数值代表成年（至少 3 月龄）雌雄 Sprague-Dawley 大鼠（250–450 克）和 C57BL/6 小鼠（20–35 克）。当然，深度和侧向位置取决于具体目标区域。针头插入脊髓期间，切勿扰动注射系统/手术板或手术台，以免损伤脊髓组织。
- 将针头降至目标深度后，等待两分钟（更长时间更佳）再开始注射。
- 使用泵控制器以恒定速率在 2–5 分钟内注射 2.0 μL。
- 注射完成后，等待两分钟（更长时间更佳）再缓慢将针头从脊髓中拔出。
- 每次注射后用 dH2O 清洗注射器，防止堵塞。缓慢吸入并排出 3–5 次。切勿吸入空气。
- 恢复至最低放大倍数（与手术开始时相同：约 8 倍）。使用 9-0 缝线缝合硬脊膜，但此步骤并非必需，且操作较困难。我们过去曾缝合硬脊膜，但发现缝合与否在动物行为、移植物存活率或脊髓组织学方面无显著差异。硬脊膜可用一块无菌明胶海绵覆盖。明胶海绵应直接放置在硬脊膜切口处。但需注意，在灌注后解剖过程中切勿突然撕下明胶海绵，因其有时会紧密粘附于脊髓表面。
- 可选：使用 4-0 缝线缝合椎旁肌。
- 使用 4-0 缝线一次性缝合三层覆盖的肌肉。在头尾方向的三个位置缝合肌肉（见 图 10）。
- 使用 9.0 mm 伤口夹将皮肤闭合（见 图 11）。用持针器夹紧伤口夹，防止动物在伤口完全愈合前自行扯下。伤口夹间距约 0.5 cm。切勿过度夹紧，以免影响愈合或导致坏死。
- 用浸有聚维酮碘消毒液的纱布涂抹伤口区域。
- 将动物置于循环温水垫上恢复。术后立即皮下注射无菌乳酸林格液（大鼠 5.0 mL；小鼠 0.5 mL）。若动物出现脱水和/或精神萎靡，可追加注射。可预防性使用头孢唑林（6.0 mg/kg）进行抗生素治疗；但我们的经验表明，若遵循无菌技术且所有器械/手术用品均经灭菌，该移植手术不会导致术后感染。若遵循上述预防措施，则不建议使用抗生素。
- 持续每日给予环孢素 A（CSA）或 FK-506/雷帕霉素，直至动物处死。
- 整个手术应控制在约 45 分钟内完成（含 6 个注射位点）。否则，动物将开始苏醒并呼吸加深，这将对脊髓注射产生不利影响。
与实验方案各个步骤相关问题的故障排除提示
细胞存活率低或无存活： 这可能并非与注射操作相关的技术问题，而更可能是由于所注射细胞类型的自身特性 和/或 免疫抑制方案所致。这些问题需要针对特定的细胞类型和动物模型进行实证评估。目前已有多种免疫缺陷型大鼠和小鼠模型可供使用，以避免免疫抑制相关的问题；然而，这些动物模型也存在一些困难，例如成本较高、需要维持种群繁殖，以及在手术和饲养过程中需采取额外的预防措施。
手术后观察到的功能缺陷： 根据我们的经验，即使在颈髓进行6个注射位点（每个位点2μL）的情况下，通过前肢和后肢抓握力以及膈神经/膈肌复合肌肉动作电位等指标评估，本操作后未观察到任何功能缺陷的发生。也未观察到组织破坏现象。可能导致此类问题出现的原因包括：未使用建议规格的针头、注射体积过大和/或细胞数量过多、因不当椎板切除造成的意外损伤、在剪开硬脊膜过程中操作不够精细（例如使用#5镊子时夹伤脊髓），或在将Hamilton针插入脊髓过程中造成损伤（建议及时更换钝化的针头）。
在腹侧灰质中未发现细胞： 这可能由多种因素导致。如果注射在内侧或外侧偏离靶点，请确保将注射系统与脊髓轴线平行对齐，并将针头插入至背根丝进入处稍偏内侧的位置。如果注射在背侧或腹侧偏离靶点，请在针尖刚刚接触脊髓背表面时将Z轴读数归零，使用推荐的Hamilton注射针及其合适的斜面（较长的斜面可能影响定位），确保插入针头时脊髓未受压迫，使用显微操作器精确测量插入深度，并选用符合推荐体重范围的动物。若发现细胞 consistently 被注射至某一非目标位置（需通过组织学评估确认），应相应调整操作技术。若在所有注射位点处细胞分布均呈现随机散在现象，则需加强练习以提高操作的一致性。若细胞主要沿针道分布于脊髓背侧区域，建议在细胞注射前和注射后延长等待时间，并将实际注射过程延展至更长时间内完成。
4. 代表性结果：
将小鼠来源的胶质前体细胞（50,000 个细胞/位点）移植到成年 SOD1G93A 大鼠脊髓 C4 节段的前角。可通过小鼠特异性抗体 M2 检测，将移植的小鼠来源细胞与宿主大鼠组织区分开。该图像显示了移植后 1 个月时 M2+ 移植来源细胞的存活情况（见 图 12）。这些细胞定位于前角灰质，但注射位点偏内侧，未能准确靶向外侧前角（即大部分膈神经运动神经元所在区域，以虚线标示）。当每注射位点注入 50,000 个细胞时，未观察到囊肿形成，注射操作也未引起行为功能障碍。然而，若注射细胞数量显著增加（具体数量因细胞类型而异，需系统评估），则会导致注射位点及针道周围组织损伤（见 图 13：使用星形胶质细胞标志物 GFAP 进行的免疫组织化学染色结果）。
图1. 皮肤的初始切口。在显微镜最低放大倍数下（我们使用8倍放大），用手术刀片沿中线做切口。用另一只手向侧方牵拉皮肤使其绷紧（便于切割），然后从颅底（耳后水平）开始，沿肩胛骨（以细虚线标示）方向做切口（以粗虚线标示）。
图 2. 手术视野的暴露。手术暴露区域应呈方形或矩形。通过使用四个牵开器将周围肌肉向四个角方向牵拉，即可获得该形状。将连接在牵开器上的胶带线固定于手术板上，以稳定牵开器并充分保持术野开放。
图2-插图。用于暴露手术区域的牵开器。牵开器用于牵拉肌肉，以创建一个既能清晰观察脊髓又具备足够操作空间的手术区域。可通过将坚固的回形针弯成所需形状和大小来制作牵开器。手术前需对牵开器进行高压灭菌。将细线系于牵开器上。
图3. 椎体。 去除椎旁肌后，使用咬骨钳彻底清理椎体的背侧表面。可观察到各个椎板以及从脊柱侧方进入的背根丝。
图4. 椎板切除术。从脊髓C5节段水平开始椎板切除。用鼠齿钳夹住覆盖在C2节段上的肌肉，以固定脊柱。用咬骨钳夹住整个椎板（见图示：靠近中线处夹取）。放置咬骨钳时，确保工具完全垂直于脊柱长轴。缓慢压碎椎板，切勿向下压迫脊髓，以免损伤脊髓组织。压碎后，轻柔地向上牵拉碎骨片。咬骨钳应将骨片压碎至可轻松剥离取出的程度。若骨片仍与其余椎板相连，切勿强行牵拉，以免引起出血及可能的脊髓损伤。咬骨钳应保持清洁且锋利。
图 5. 椎板切除术后脊髓组织的暴露。延长椎板切除范围以暴露全部 C4-C6 节段的脊髓。在三个脊髓节段的骨头上形成一个连续的开口。椎板切除术不应过度向侧方延伸，以免引起出血。为了靶向腹角，注射部位相对偏内侧，因此无需将椎板切除范围延伸至椎体骨的完全侧缘。
图6. 脊髓背侧表面的高倍放大图。可见明显的背侧血管沿脊髓中线走行。这种血管分布模式在大多数情况下均可观察到；然而，部分动物的血管走行偏离中线。在脊髓背侧表面的外侧区域可见背根根丝。相对于覆盖脊髓的硬脊膜，这些神经呈现出模糊的外观。
图7. 注射装置。将注射器/针头与脊柱轴线平行对齐，以准确定位目标解剖区域。针头角度略微调整（相对于手术台约80度），以避免触碰手术显微镜镜头，但应尽可能接近90度（左图）。通过显微镜将注射针尖缓慢下移至脊髓背侧表面（右图）。用针尖轻轻接触脊髓表面，轻微下压脊髓组织，然后回撤针头直至脊髓恢复正常的平坦状态。使用显微操作仪上的刻度尺将此位置记录为 z = 0.0。
图8. 脊髓注射的高倍放大图 将针头对准背根丝进入区域的稍内侧（由虚线标示）。
图9. 脊髓示意图：如何靶向目标解剖区域。 在尝试靶向腹角时，沿脊柱轴线方向切开硬脊膜，切口位置位于背根进入区的内侧。此操作可使针头准确到达腹角区域。在成年大鼠中，将针头下降至1.5 mm深度以靶向腹角（动物的年龄和性别对所需深度影响不大）。在成年小鼠中，将针头下降至0.75 mm深度以靶向腹角。当然，具体的进针深度和横向位置取决于目标区域的实际解剖位置。
图10. 手术部位的闭合。使用4-0缝线一次性缝合三层重叠的肌肉层。沿头尾轴方向在三个位置缝合肌肉。
图11. 皮肤缝合钉合。使用9.0 mm伤口夹闭合皮肤。用持针器压紧缝合钉，以防止动物在伤口完全愈合前将缝合钉抓掉。缝合钉之间的间距约为0.5 mm。
图 12. 胶质前体细胞移植至颈段腹角。 将 50,000 个来源于小鼠的胶质前体细胞移植到 SOD1G93A 大鼠脊髓 C4 节段的腹角。移植后 1 个月，来源于 M2+ 小鼠的移植细胞存活。细胞定位于腹侧灰质，但注射位点内侧偏离了外侧腹角（以虚线表示）。
图13. 移植大量神经前体细胞后引起的组织损伤。 注射过多细胞（具体数量因细胞类型而异，应系统评估）会导致注射部位及针道周围组织损伤。
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讨论
在涉及 SOD1G93A 小鼠和大鼠的研究中，应确保组内动物的年龄和性别相匹配，并将同窝出生的动物分配至不同组别。在 ALS 和 SCI 模型中，优先使用同一性别的动物，因为疾病进程在雄性和雌性之间可能存在差异；然而，纳入足够数量的两种性别动物也可能有助于检测潜在的性别特异性效应，该现象已在 SOD1G93A 大鼠13 和 SOD1G93A 小鼠14,15 中有报道。在将细胞移植到动物体内时，需考虑动物的年龄/疾病阶段（针对 ALS 动物）或损伤后的时点（针对 SCI 模型）。该策略可能因所研究的具体细胞机制不同而有所差异。
本文所述方案可用于大鼠和小鼠的颈段脊髓11，也可用于将细胞移植至大鼠和小鼠脊髓的其他节段，如胸段和腰段脊髓14。为了准确靶向这些不同脊髓节段中的特定解剖结构（除前角以外），建议首先使用染料或其他方法检测注射的内外侧位置和深度，以评估坐标定位的准确性。
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致谢
我要感谢：Lepore、Maragakis 和 Rothstein 实验室的所有成员，感谢他们有益的讨论；感谢美国瘫痪退伍军人协会和 Craig H. Neilsen 基金会提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HBSS | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 14170 | |
| 0.05% 胰蛋白酶 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 25300 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂（可选） | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| 马来酸乙酰丙嗪（0.7 mg/kg） | Fermenta Animal Health | ||
| 氯胺酮（95 mg/kg） | Fort Dodge Animal Health | ||
| 赛拉嗪（10 mg/kg） | Bayer AG | ||
| #11 羽毛手术刀片 | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| 棉签（6 英寸） | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 鼠齿镊 | Fine Science Tools | 大鼠：11023-15；小鼠：11042-08 | |
| 中型弹簧剪 | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| 小型弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| 咬骨钳 | Fine Science Tools | 大鼠：16121-14；小鼠：16221-14 | |
| 显微刀 | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 持针器 | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| 缝线：4-0 | Vicryl | S-183 | |
| 钉合钉：9 mm | Autoclip | 427631 | |
| 钉合器：9 mm（Reflex #203-1000） | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| 温水泵（T/Pump） | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| 环孢素 A：250.0 mg/5.0 mL 安瓿 | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| 雷帕霉素 | LC Laboratories | R-5000 | |
| 注射泵 | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Micro 4 微量注射泵控制器 | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| 显微操作器 | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| 10.0 μL Hamilton 注射器 | Hamilton Co | 80030 | |
| Hamilton 针头：33 号规格，45° 斜面，1 英寸 | Hamilton Co | 7803-05 | |
| 玻璃 20.0 μL 微量毛细移液管（可选） | Kimble Chase | 71900-20 |
参考文献
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