测量感染小鼠中的细菌载量和免疫反应 单核细胞增生李斯特菌

摘要

Listeria monocytogenes 是研究小鼠对胞内细菌免疫反应和遗传易感性的模式生物。该方法可用于测定细菌载量，并制备小鼠肝脏和脾脏的单细胞悬液，以进行流式细胞术分析，从而确定李斯特菌（Listeria）感染引起的免疫细胞变化。

摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria） 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原菌¹小鼠研究通常采用静脉注射 单核细胞增生李斯特菌，导致全身性感染²注射后，由于CD8α细胞的摄取，李斯特菌迅速扩散至脾脏和肝脏。⁺ 树突状细胞和库普弗细胞^3,4被吞噬后，多种细菌蛋白可促进 单核细胞增生李斯特菌 逃逸吞噬体，在胞质溶胶中存活，并感染邻近细胞⁵在感染的前三天，不同的天然免疫细胞（如单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞）介导杀菌机制，以最大限度地减少 单核细胞增生李斯特菌 增殖。CD8⁺ T细胞随后被招募，并负责最终清除 单核细胞增生李斯特菌 从宿主中，通常在感染后10天内⁶.

从感染的小鼠体内成功清除Listeria依赖于宿主免疫反应的适时启动⁶。不同近交系小鼠品系之间的敏感性存在广泛差异^7,8。通常，对Listeria感染更易感的小鼠控制细菌增殖的能力较弱，与抗性小鼠相比，表现出更高的细菌载量和/或清除延迟。包括连锁分析和基因敲除小鼠品系在内的遗传学研究已鉴定出多个基因，其序列变异会影响宿主对Listeria感染的反应^6,8-14。因此，测定并比较不同小鼠品系间的感染动力学是鉴定参与抗Listeria免疫反应的宿主遗传因素的重要方法。比较宿主对不同Listeria菌株的反应也是识别潜在细菌毒力因子的有效途径，这些因子可作为抗生素治疗或疫苗设计的潜在靶点。

本文介绍一种简便的方法，用于测定感染Listeria小鼠肝脏和脾脏组织中的细菌载量（每组织菌落形成单位 [CFU]），并制备肝脾单细胞悬液，以进行免疫应答的流式细胞术（FACS）分析。该方法特别适用于对新型小鼠品系中Listeria感染的初步表征，以及比较不同小鼠品系在感染Listeria后的免疫应答差异。我们使用的是Listeria monocytogenes EGD菌株¹⁵，该菌株在血琼脂平板上培养时，由于具有β-溶血活性¹，每个菌落周围均呈现特征性的透明溶血环（图1）。通过下述方案，可在感染后的任意时间点，将组织匀浆接种于血琼脂平板培养以测定细菌载量，并同时制备组织单细胞悬液用于FACS分析。需要特别指出的是，免疫功能低下者或孕妇不应操作Listeria，实验开始前应咨询相关机构的生物安全委员会及动物设施管理部门。

方案

1. 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称Listeria）的培养与长期保存

1. 制备或购买预制的马血琼脂（HBA）平板。使用前将平板干燥，可通过在37°C下预孵育过夜，或在未加盖的情况下置于层流柜中1小时来实现。
2. 从以下来源之一获取有活力的Listeria：感染小鼠组织匀浆液、冻干菌种、冷冻甘油菌种，或近期培养的Listeria单菌落（即不超过一周、传代不超过10代）。所有Listeria的获取均应使用无菌接种环，并在整个方案所述操作中采用无菌技术。
3. 如图1所示，使用无菌接种环在HBA平板上划线接种Listeria：将Listeria在平板表面约1/4区域进行初次划线接种作为初始接种物扩散。从初始区域开始进行一系列单向划线。每次划线前使用新的或重新灭菌的接种环，重复划线2–3次。将平板在37°C下孵育过夜。
4. 将Listeria HBA平板在4°C下保存，最长不超过1个月；或进入步骤1.5，为长期保存制备Listeria菌种。
5. 使用灭菌接种环从HBA平板上新鲜的Listeria培养物中挑取单个菌落，接种至含有10 mL脑心浸液（BHI）肉汤（按生产商说明书配制）的30 mL麦氏瓶中。
6. 将Listeria培养物置于37°C、180 rpm的振荡摇床中孵育过夜。
7. 向液体Listeria培养物中加入无菌80%甘油（v/v），按1:1比例混合，使终浓度为40%（v/v）。将0.5–1 mL分装至冻存管中，并将Listeria/甘油菌种在-70°C下保存。

提示与注意事项：

• 生长 单核细胞增生李斯特菌 可在不同的非选择性培养基上培养，例如添加了马、羊、豚鼠或人血的血琼脂、脑心浸出液（BHI）琼脂或肉汤，或含酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB-YE）。通过在培养基中添加抗生素，可减少污染菌的生长 单核细胞增生李斯特菌 具有明确抗生素抗性的菌株（例如 L. monocytogenes 10403S），或使用牛津培养基，后者可选择性支持某些微生物的生长 单核细胞增生李斯特菌.
• 如果 单核细胞增生李斯特菌 若来源未经检测，建议进行额外测试以确认其身份 单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes 为革兰氏阳性，不形成芽孢，可运动 <30°C，兼性厌氧，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性）。所获得的培养物也可在 单核细胞增生李斯特菌 选择性培养基以确保获得纯培养物。
• 干燥HBA平板可确保平板上细菌菌落的最佳分离。
• 制备甘油冻存菌种时 单核细胞增生李斯特菌，使用新鲜的HBA 单核细胞增生李斯特菌 培养时间少于 1 周且传代次数尽可能少的培养物（<5 最佳。
• 当制备新鲜样本时 单核细胞增生李斯特菌 从冻存的甘油菌种中复苏培养物时，首次传代应使用固体培养基（如HBA平板），因为 单核细胞增生李斯特菌 从冻存的甘油菌种直接转接至液体培养基时，菌株生长状况较差。

2. 准备与储存 单核细胞增生李斯特菌 用于感染的病毒原液 体内 感染研究

1. 划线 单核细胞增生李斯特菌 从冻存的甘油菌种（步骤1.7）中接种至HBA平板，操作如步骤1.3所述。将平板置于 37°C 过夜，以备次日使用。
2. 挑选一个单一的 单核细胞增生李斯特菌 从划线培养的菌落中挑取单个菌落，接种于10 mL BHI肉汤中。避免将琼脂带入肉汤。
3. 孵育 单核细胞增生李斯特菌 BHI 培养基于180 rpm的摇床中培养 37°C 对数中期（OD600 ≈ 0.4）。通常需要3-4小时。
4. 无菌取 0.9 mL 样品，在 3–4 小时振荡培养后于 600 nm 处测定 OD 值。若 OD 值小于 <0.3，然后继续在180 rpm的摇床中培养 37°C 直到 OD 读数约为 0.4。
5. 向10 mL中加入1 mL无菌80%甘油（v/v） 单核细胞增生李斯特菌 BHI 肉汤培养物（OD600 ~0.4）。轻柔混匀后，分装至 1.5 mL 微量离心管中，每管 0.5–1 mL。
6. 将等份样品置于冰上 10 分钟，然后于 -70°C. 留取一份等分试样不进行冷冻，用于测定浓度 单核细胞增生李斯特菌 在感染性毒株中，其滴度通常在10的数量级⁹ CFU/mL
7. 进行未冻存样本的1:10连续稀释 单核细胞增生李斯特菌 PBS 中的感染性储备液稀释至 10^-8 稀释。涂布 100 μL 将未稀释样品及每个后续稀释度的样品，用玻璃涂布棒在预先干燥的HBA平板（步骤1.1）上进行双份涂布。将平板置于 37°C 过夜。
8. 统计每块平板上的菌落数量并确定 单核细胞增生李斯特菌 使用以下计算公式测定冷冻感染性菌种的浓度：浓度（CFU/mL）= 菌落数 × 稀释倍数 / 0.1 mL。用于计数的平板应理想地含有30–300个菌落，以确保对活菌CFU浓度的可靠估算。
9. 储存数天后 单核细胞增生李斯特菌 -80 ℃保存的感染性毒种70°C，解冻一管。测定活细胞浓度 单核细胞增生李斯特菌 如步骤2.7和2.8所述。该浓度应与步骤2.8中测定的新鲜制备的感染性病毒原液的浓度相近。

提示与注意事项：

• 单核细胞增生李斯特菌 感染性菌种保存于较低浓度的甘油（8%）中，而非 单核细胞增生李斯特菌 用于长期常规保存（40%）
• 冷冻 单核细胞增生李斯特菌 感染性毒株通常在 -80 ℃ 下保持稳定70°C 最长可保存3个月。若使用超过3个月，建议从新鲜样本重新制备新的感染性毒株 单核细胞增生李斯特菌 在HBA平板上培养。
• 如果解冻后样品的浓度 单核细胞增生李斯特菌 感染性毒株（步骤 2.9）与步骤 2.7 和 2.8 中所述新制备的毒株不同（即 >菌落形成单位（CFU）下降20%时，应制备新的冷冻感染性原液。
• 尽管最初制备冷冻菌种相较于为单次实验准备新鲜细菌接种物更为耗时，但制备冷冻菌种 单核细胞增生李斯特菌 使用感染性菌液可在感染前准确测定CFU浓度，并在使用同一冻存菌液感染小鼠时提高实验间的重复性。

3. 准备 单核细胞增生李斯特菌 接种物与小鼠静脉注射

1. 测定浓度 单核细胞增生李斯特菌 每只小鼠的注射剂量。静脉注射时，CFU在 200 μL 每只小鼠接种的接种物剂量相同。
2. 解冻一份冷冻保存的等分试样 单核细胞增生李斯特菌 感染性病毒原液（来自步骤 2.6）。用 PBS 将感染性病毒原液稀释至所需浓度 单核细胞增生李斯特菌 CFU 浓度。注射所需体积的两倍，以确保有足够的接种物用于注射及浓度测定 单核细胞增生李斯特菌 注射前后菌落形成单位（CFU）（步骤 3.3 和 3.7）。
3. 从已准备好的溶液中取出两份 0.1 mL 等分试样 单核细胞增生李斯特菌 接种物，并在注射小鼠前用 PBS 将每份等分试样稀释至 1:10。取每种稀释液 0.1 mL 接种于 HBA 平板，37℃过夜培养 37°C. 计数菌落数量，并确定注射前的浓度 单核细胞增生李斯特菌 接种物浓度（CFU/mL）=（菌落数 × 稀释倍数）/ 该稀释倍数下接种的毫升数。
4. 将待注射的小鼠转移至洁净的笼子中。将笼子置于距离250瓦红外灯约50 cm处，加热5分钟以温暖小鼠（也可使用其他合适的加热装置，但需确保不会烫伤小鼠或使笼内温度升高至 40°C 也可使用）。将小鼠放入固定装置中以进行尾静脉注射。
5. 轻轻混匀 单核细胞增生李斯特菌 悬浮液，以确保每次加载注射器时悬浮液保持均匀一致。
6. 找到小鼠的侧尾静脉，用70%乙醇棉片轻轻擦拭后注射 200 μL 的 单核细胞增生李斯特菌 使用带有27号针头的注射器接种菌液（至所需浓度）。用无菌纱布轻轻按压穿刺伤口。将小鼠放回笼中。
7. 当所有小鼠注射完成后，使用剩余的接种物重复步骤 3.3，以测定注射后的接种物浓度 单核细胞增生李斯特菌 接种物
8. 量的 单核细胞增生李斯特菌 注入小鼠的菌落形成单位（CFU）报告为注射前和注射后测定的平均CFU 单核细胞增生李斯特菌 接种物样品。

提示与注意事项：

• 在比较抗性小鼠品系（例如 C57BL/6）与易感小鼠品系（例如 BALB/c）之间的细菌载量和免疫反应时，我们通常注射 500 - 3,000 CFU（200 μL 浓度为 2,500 CFU/mL - 15,000 CFU/mL 的接种物）。
• 如果感染性菌液在 PBS 中的稀释倍数至少为 10⁵，则通常无需洗涤步骤以去除残留培养基/甘油。如果感染性菌液在 PBS 中的稀释倍数不足 10⁵，则应在步骤 3.2 中增加洗涤步骤以去除残留培养基/甘油，具体如下：向解冻的感染性菌液中加入 9 mL PBS，并在 4°C 下以 2100 × g 离心 10 分钟收集细菌。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 10 mL 无菌 PBS 中，重复离心，再将细菌沉淀重悬于所需体积的 PBS 中。按照步骤 3.3 和 3.7 所述方法测定注射前和注射后单核细胞增生李斯特菌（Listeria）接种物样品的平均 CFU。需注意，此洗涤步骤可能导致部分细菌损失，建议预先确定损失量，并在制备所需浓度的接种物时予以校正。
• 向小鼠注射单核细胞增生李斯特菌（Listeria）后，应安全丢弃注射器和针头。

4. 肝脏和脾脏的摘除 单核细胞增生李斯特菌用于分析的感染小鼠

1. 在感染后预期的时间点，采用当地动物伦理委员会批准的方法（如 CO₂ 窒息法）对感染小鼠实施安乐死。
2. 安乐死后立即使用 1 mL 注射器和 25 号针头进行心脏采血，尽可能收集多的血液。取出胆囊并切断下腔静脉。
3. 将肠道轻轻推向右侧以暴露肝门静脉，将肝叶翻向头部和左侧，使肝脏移至膈肌所在位置。肝门静脉从右下侧进入肝脏底部。
4. 使用 26 号针头向肝门静脉注入 10 mL PBS 进行肝脏灌注。通过门静脉注入的 PBS 将从被切断的下腔静脉流出。肝脏灌注可确保所获取的细胞来源于肝脏组织而非循环血液。
5. 将灌注后的肝脏从小鼠体腔中取出，置于 FACS 缓冲液中，并冰上保存。继续进行步骤 5.1，为后续 FACS 分析准备肝脏组织。
6. 从小鼠体内取出脾脏，置于 FACS 缓冲液中，并冰上保存。
7. 称量整个脾脏重量，将其切为两半后称量其中一半的重量。将一半脾脏放入 FACS 缓冲液中，进入步骤 6.1；另一半放入冰上的均质袋（Stomacher 袋）中，进入步骤 7.1。

提示与注意事项：

• 在步骤 4.5 和 4.6 中，应使用足量的 FACS 缓冲液完全浸没组织，以尽量减少组织任何部分暴露于空气。
• 将长度为 ½ 英寸、26 号的针头弯曲约 30 度，可更便于将 PBS 注入肝门静脉。
• 当灌注充分时，注入 1–2 mL PBS 后，肝脏颜色会从深红色变为浅棕色。
• 若无需对肝脏进行 FACS 分析，则无需进行灌注。可直接将肝脏分离并收集至均质袋（Stomacher bag）中，并按步骤 7 所述进行处理。
• 对于小鼠的安乐死，首选二氧化碳（CO₂）窒息法，因其对脾脏和肝脏中细菌菌落形成单位（CFU）及免疫细胞活性的影响最小。若无需采集血液，可采用颈椎脱位作为替代的安乐死方法。建议避免使用可能影响器官重量或免疫细胞活性的方法（例如硫喷妥类药物）。

5. 用于流式细胞术分析的肝细胞悬液制备

1. 将肝脏置于含有 FACS 缓冲液（步骤 4.5）的 70 μm 细胞滤筛中，该滤筛置于 60 mm 培养皿内，使用 5 mL 注射器的推杆将组织压过滤筛，直至形成单细胞悬液。
2. 将培养皿中的肝单细胞悬液转移至 50 mL 带螺口盖的锥形离心管中，并用预冷的 FACS 缓冲液补足总体积至 40 mL。
3. 涡旋混匀细胞悬液，取 1 mL 分装样用于测定肝脏的细菌负荷量。转至步骤 7.3，用此 1 mL 分装样替代 Stomacher 袋中的组织匀浆液。
4. 在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟沉淀细胞，弃去上清液，用 40 mL 预冷的 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，再次在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于 20 mL 室温等渗 Percoll 液中，在室温下以 700 × g 离心 12 分钟。弃去上清液及浮于顶部的盘状细胞层（即肝细胞）。将含有白细胞的沉淀重悬于 4 mL TAC 缓冲液中以裂解红细胞，并在室温下频繁颠倒混匀，孵育最多 10 分钟。
6. 将细胞悬液通过 100 μm 尼龙膜过滤至新的 10 mL 离心管中。
7. 在过滤后的细胞悬液下层加入 1 mL FCS/EDTA 缓冲液。在 4°C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再用 5 mL FACS/EDTA 缓冲液重悬细胞沉淀。
8. 在 4°C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，根据沉淀体积，将细胞沉淀重悬于 0.5–3 mL FACS/EDTA 缓冲液中。
9. 根据步骤 5.8 中的悬液体积，用台盼蓝将细胞悬液稀释 1:5–1:20。使用血细胞计数板（图 4A）计数活肝白细胞，并按下式计算总活细胞数：每器官活细胞数 = 计数区域内的细胞数 × 稀释倍数 × 10⁴ × 体积（mL）。随后可使用特异性抗体标记肝单细胞悬液中目标细胞表面标志物，并通过 FACS 进行分析。

提示与注意事项：

• 除非另有说明，否则将细胞置于冰上保存。

6. 用于FACS分析的脾脏单细胞悬液的制备

1. 将脾脏的一半（步骤 4.7）与 FACS 缓冲液置于放置在 60 mm 培养皿中的 70 μm 细胞筛中，使用 5 mL 注射器的推杆轻轻将组织压过细胞筛，直至形成单细胞悬液。
2. 将培养皿中的脾脏单细胞悬液转移至 10 mL 离心管中，并用冷的 FACS 缓冲液定容至 10 mL。
3. 在 4°C 下以 350 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，弃去上清液，用 4 mL TAC 缓冲液重悬细胞沉淀以裂解红细胞，并在室温下孵育最多 10 分钟，期间频繁颠倒混匀。
4. 将细胞悬液通过 100 μm 尼龙膜过滤至新的 10 mL 离心管中。
5. 在过滤后的细胞悬液下层加入 1 mL FCS/EDTA 缓冲液，在 4°C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用 5 mL FACS/EDTA 缓冲液重悬细胞沉淀。
6. 在 4°C 下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，根据沉淀大小用 3–8 mL FACS/EDTA 缓冲液重悬细胞沉淀。
7. 根据步骤 7.6 中的悬液体积，用台盼蓝（0.4% 溶于蒸馏水）将细胞悬液稀释 1:10 至 1:20。使用血细胞计数板计数活脾细胞——参见步骤 5.9 计算每器官的总活细胞数。随后可使用针对目标细胞表面标志物的特异性抗体标记脾脏单细胞悬液，并通过 FACS 进行分析。

提示与注意事项：

1. 除非另有说明，否则将细胞置于冰上保存。

7. 组织中细菌载量的测定 单核细胞增生李斯特菌感染的小鼠

1. 将含有脾脏一半组织的均质袋（Stomacher bag）顶部折叠封口。在用手压紧均质袋防止泄漏的同时，将其平放在洁净的工作台或超净工作台内，用一支粗的圆珠笔反复滚压组织，直至袋内组织被充分碾碎。
2. 向每个含有碾碎组织的均质袋中加入 5 ml PBS。将均质袋放入均质器（Stomacher）中，以高速运行 10 分钟。
3. 用移液器混匀均质袋中的匀浆液（或 1 mL 肝细胞悬液）。以下操作设两个重复：取 300 μL 匀浆液转移至 96 孔平底板中。在 96 孔板的各孔内对每份组织匀浆样本进行 1:10 的系列稀释（将 30 μL 样本加入 270 μL PBS 中），直至稀释至 10^-5。
4. 使用玻璃涂布棒将每个稀释度的 0.1 mL 匀浆液小心涂布于预先干燥的 HBA 平板上。将平板置于 37°C 培养过夜。
5. 计数每个稀释度的菌落形成单位（CFU）数量，并根据所用组织比例（例如半只脾脏）、稀释倍数以及组织匀浆液总体积（5 mL 或 40 mL），计算每份组织的 CFU 数量：CFU/组织 = CFU/0.1 mL × 稀释倍数 × mL/组织；对于脾脏样本，需将该数值除以用于匀浆的脾脏样本所占的重量百分比（见步骤 4.7）。

提示与注意事项：

• 只要总体积不超过制造商规定的最大容量，可同时在拍击式均质器中放置多个拍击袋
• 若无拍击式均质器，可使用组织匀浆器替代。或者，若采用以下方法（尽管效率较低），可手动研磨组织以替代步骤 7.1 和 7.2：将组织置于密封的无菌塑料袋中，平放在洁净工作台上，用手压紧袋口以防泄漏；用 500 mL 实验室玻璃瓶反复碾压塑料袋，直至组织完全捣碎。每袋中加入 5 mL PBS，然后进行步骤 7.3
• 步骤 7.4 中，HBA 平板必须彻底干燥（即琼脂表面无水分）非常重要；否则可能难以获得可准确计数的清晰单个 Listeria 菌落
• 若 HBA 平板数量有限，可采用以下替代步骤 7.4：在预先干燥的 HBA 平板底部（步骤 1.1）画线，将其分为五至六个区域，每个区域对应一个稀释度。将每种组织匀浆液的各稀释液分别精确移取 25 μL 至对应区域，切勿使用涂布棒涂开。待组织匀浆液液滴完全干燥后，将平板倒置。于 37°C 过夜培养。由于每滴液体在琼脂平板上可形成菌落，最多可分辨出约 80 个菌落
• 组织匀浆液的稀释倍数可能取决于动物体内 Listeria 的生长情况，可根据安乐死时动物表现出的症状进行估计。对于明显濒死的小鼠，可能需要进行更高倍数的稀释，以更准确地测定细菌载量。对于接种低剂量 Listeria 或在感染期结束时被实施安乐死的小鼠，可直接使用未稀释的组织匀浆液测定细菌载量
• 平板可在 37°C 下过夜培养，或在室温下培养 2–3 天

8. 代表性结果：

对于一个标准的感染实验， 单核细胞增生李斯特菌 从冻存的甘油菌种中取出菌液，在HBA平板上划线接种，如图1所示。若划线后获得的菌落较少，可能表明划线操作不当或冻存菌种状态不佳。 单核细胞增生李斯特菌 传染性菌种由新鲜划线的HBA平板制备，并储存于-70°C. 为测定细菌清除率和免疫应答，我们常规将解冻后的样本进行稀释 单核细胞增生李斯特菌 将感染性菌液稀释至 2,500 CFU/mL - 15,000 CFU/mL，并注射给小鼠 200 μL 以500 - 3,000 CFU的剂量感染它们。我们观察到，感染亚致死剂量的细菌后，小鼠 单核细胞增生李斯特菌 采用本方案后，小鼠在最初几天内可能出现短暂的毛发竖立、蜷缩姿势及体重下降。这些症状可作为视觉指标，用于评估个体小鼠感染严重程度，判断其是否与群体中其他小鼠表现出明显差异（即“明显”异常个体），以及是否需要实施安乐死，以防止其因感染导致过度痛苦或濒死。

在图2-5所示的结果中，小鼠使用 freshly thawed aliquot 感染 单核细胞增生李斯特菌 感染性菌液。在感染后的不同时间点，处死小鼠并取出肝脏和脾脏。图2显示了一个HBA平板，其中培养了来自单只小鼠的稀释脾脏匀浆液。随着稀释倍数的增加，菌落数量应明显减少，以便至少在两个稀释度下能够清晰计数独立的CFU。如果小鼠已清除病原体 单核细胞增生李斯特菌 感染（即检测限 = 100 CFU/组织），则 <5 单核细胞增生李斯特菌 HBA 平板上将出现菌落，该平板已接种 200 μL 未稀释组织匀浆液。若在分离过程中肝脏和/或脾脏受到肠道或其他外部细菌污染，则HBA平板上的菌落可能呈现不同形态（即不具有特征性的透明环和浅色外观） 单核细胞增生李斯特菌（Listeria） 菌落）和/或菌落计数可能与预期值不同 单核细胞增生李斯特菌 （即过少或过多）。图3显示了一个典型的 单核细胞增生李斯特菌 C57BL/6小鼠的清除曲线——请注意 单核细胞增生李斯特菌 通常从脾脏清除的速度快于肝脏，且清除过程直到感染后五天才发生。

图4显示了基于感染后不同时间点从感染小鼠脾脏和肝脏制备的单细胞悬液的细胞计数。该方法可实现 >肝组织单细胞悬液中白细胞纯度达95% >80% 来自脾脏。使用针对泛白细胞标志物 CD45（克隆号 30-F11）的单克隆抗体，可通过 FACS 分析确定白细胞纯度。通常，在清除感染的过程中，脾细胞和肝内白细胞的数量均会增加，其中肝脏中肝内白细胞的倍数增幅更大，但总量仍显著低于脾脏中脾细胞的增加量。通过使用针对细胞表面标志物的特异性抗体对单细胞悬液进行标记，可确定免疫细胞的类型和数量。标记后的细胞可通过 FACS 分析进行检测。图 5 提供了 CD8 的代表性结果⁺ T细胞。在标准的 单核细胞增生李斯特菌 C57BL/6小鼠感染后，CD8细胞的数量⁺ T细胞在感染后第2至3天因脾脏淋巴细胞减少而暂时降低，随后从第5天起在脾脏和肝脏中均显著增加。

图 1. 接种了Listeria的HBA平板。使用无菌接种环从冷冻甘油菌种中划线接种Listeria。平板在37°C下培养过夜。单个菌落周围出现的特征性透明圈是由于β-溶血所致。

图2. 组织匀浆来自一个 单核细胞增生李斯特菌-感染小鼠的HBA平板培养物。从一只小鼠中采集肝脏组织 单核细胞增生李斯特菌感染后3天的C57BL/6小鼠。制备组织匀浆并进行稀释后放置于 100 μl 10 的全板涂布^-4 稀释 (A) 和 10^-5 稀释（B），以及 25 μl 从原液到10⁻⁶的每个1:10稀释度，在HBA平板上各滴一滴^-5 (C). 将培养皿置于 37°C 过夜。选择能够计数单个菌落的稀释度，用于确定感染后该时间点的细菌载量（即每组织菌落形成单位，CFU/组织）。

图 3. Listeria 感染后第 3 天和第 7 天，感染的 C57BL/6 小鼠脾脏和肝脏中的细菌载量。C57BL/6 小鼠经约 2,000 CFU 的 Listeria 感染。在每个时间点处死小鼠，灌注肝脏，并与脾脏一同取出；将脾脏匀浆液（A）或肝脏单细胞悬液（B）进行系列稀释后接种于 HBA 平板，以测定细菌载量。实线表示几何平均值，竖直线表示标准误（SEM）。虚线表示本实验中准确测定细菌载量的检测下限为每器官 100 CFU。

图4. 感染小鼠组织的活菌计数。C57BL/6小鼠感染约2,000 CFU的 单核细胞增生李斯特菌在每个时间点处死小鼠，灌注肝脏并收获肝脏与脾脏。细胞经台盼蓝染色后，使用血细胞计数板按照步骤5.9（A）所述方法进行计数。脾细胞（B）和肝内白细胞（C）计数数据来自从单细胞悬液制备的样本 单核细胞增生李斯特菌感染小鼠。线条表示几何平均数。

图5. CD8 的 FACS 分析⁺ T 细胞在 单核细胞增生李斯特菌感染的小鼠。C57BL/6 小鼠感染约 2,000 CFU 的 单核细胞增生李斯特菌在每个时间点处死小鼠，灌注肝脏并收获肝脏与脾脏。制备单细胞悬液后，使用针对T细胞的特异性抗体（CD3、TCRβ、CD4、CD8）进行染色。（A）代表性流式细胞术图谱显示CD8%⁺ T细胞，± SEM。（B）总CD8⁺ 脾脏中的T细胞。（C）总CD8⁺ 肝脏中的T细胞

讨论

Listeria 是用于表征宿主对胞内细菌免疫应答的最常用生物体之一⁶。本文所述方案可实现对同一只小鼠特定组织中的细菌载量和免疫细胞应答进行测量。对每只感染小鼠的特定组织进行双重测量，可在小鼠群组内部及不同群组之间（代表不同小鼠品系或感染后不同时间点）提供更为可靠的比较。尽管通过口服途径感染 Listeria 也可用于研究小鼠的免疫应答，但通常采用静脉注射感染，原因如下：1）可确保细菌快速有效地进入血液循环；2）可产生同步且一致的全身性感染；3）Mus 属物种在编码 E-钙黏蛋白受体的基因上存在突变，该突变限制了 Listeria 通过口服途径的感染（此突变影响 Listeria 与小鼠 E-钙黏蛋白受体的结合能力，以及其有效穿越胃肠道上皮层的能力）^16-18。

本实验方案中有几个关键步骤。首先，单核细胞增生李斯特菌（Listeria）接种物的储备液应由新鲜的HBA平板过夜培养物制备，以确保其活力和毒力。其次，在注射每只小鼠前后，必须准确测定接种物的CFU浓度，以确保第一只与最后一只注射小鼠之间的CFU浓度无显著差异。第三，向小鼠尾静脉注射Listeria的操作必须保持一致。最后，必须对肝脏进行灌注，以清除非驻留的白细胞，从而确保所检测的免疫细胞准确反映肝脏内的细胞组成，而非来自外周血中流经的白细胞。若上述任一步骤操作不当，均可能导致感染Listeria的小鼠之间在细菌载量和/或免疫应答方面出现不必要的个体间差异。

本方案的两个局限性在于研究者通过静脉注射感染小鼠的技术水平，以及组织中细菌载量的检测能力。如果由同一人注射大量小鼠，一旦冷冻接种物解冻后，Listeria 的存活率（即CFU浓度）可能会随时间下降（例如，第一只与最后一只小鼠注射之间间隔超过>2小时）。接种物在活性受损前能够完成多少只小鼠的注射，需由研究者自行判断。该方法的另一个局限性是，由于培养的组织匀浆量相对较少，无法准确检测低于100 CFU/器官的Listeria载量（例如图3显示，100 CFU/器官为检测下限）。为了更准确地测定较低的CFU/器官数值，可增加组织匀浆的接种量（每平板最多0.5 mL，可使用多个平板），从而提高组织取样比例以检测Listeria。若无Stomacher仪器，可在步骤7.1–7.2中采用其他组织匀浆方法替代，例如使用组织匀浆器。在实际操作中，若37°C培养箱空间有限，无法容纳所有感染小鼠组织样本的培养，HBA培养平板可在室温下培养2–3天（但室温下菌落生长较慢）。然而，在制备冷冻Listeria菌种时，不应使用室温培养。

本方案为在小鼠中表征Listeria感染提供了基本方法，除EGD菌株外，也可用于其他Listeria菌株。除了肝脏和脾脏外，还可制备淋巴结的单细胞悬液。在这两种情况下，这些单细胞悬液均可用于多种分析，包括免疫细胞亚群的检测以及分选后免疫细胞的体外刺激。一旦掌握基本技术，本方案还可进一步改进，用于分离Listeria特异性T细胞¹⁹、表征树突状细胞²⁰，或在感染后的特定时间点进行免疫细胞耗竭^21,22，从而更全面地表征感染Listeria小鼠的免疫应答。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
马血琼脂基础培养基第2号	Oxford Labware	CM0271	用于制备HBA平板的琼脂基础
脱纤维马血	Oxford Labware	HB1000	添加至琼脂基础中，终浓度为5-10%
脑心浸液（BHI）肉汤（10 mL）	Oxford Labware	TM456
脱水脑心浸液培养基	Oxford Labware	CM1135
96孔平底板	BD Biosciences	353072
70 μm 细胞滤器	BD Biosciences	352350
小型培养皿	BD Biosciences	351007
Stomacher 80 biomaster 实验室系统	Seward
塑料Stomacher均质袋	Sarstedt Ltd	86 9924 530
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3912
FACS缓冲液			含0.1% (w/v) 牛血清白蛋白的PBS溶液
等渗Percoll（PBS中含33.75% Percoll）	GE Healthcare	17-0891-01	33.75 mL Percoll、3.75 mL 10x PBS、62.5 mL 1x PBS混合配制成100 mL等渗Percoll
TAC缓冲液			含17 mM Tris、140 mM氯化铵的去离子水溶液
FCS/EDTA缓冲液			含10 mM EDTA的胎牛血清
FACS/EDTA缓冲液			FACS缓冲液加5 mM EDTA
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T6146	0.4% (w/v) PBS溶液，过滤除菌
2 mL 冻存管	Greiner Bio-One	121263
27号/1 mL 胰岛素注射器	Terumo Medical Corp.	SS10M2713
针头	Terumo Medical Corp.	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
注射器	Terumo Medical Corp.	SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)