本方案特别描述了通过聚乙二醇沉淀法从蛋黄中提取总IgY的方法，并提供了有关IgY技术的一般信息。
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摘要
摘要
可通过肌肉注射免疫母鸡（左右侧Musculus pectoralis，注射体积为0.5–1.0 ml），或采用基因枪质粒免疫法进行免疫。根据抗原的免疫原性，仅需一次或3–4次加强免疫，即可获得高滴度抗体（可达1:100,000–1:1,000,000）。通常情况下，一只母鸡可持续产蛋约72周，之后产蛋能力逐渐下降。本方案描述了通过沉淀法（PEG，Polson et al. 1980）从蛋黄中提取总IgY的方法。该方法包含两个关键步骤：第一步是去除脂质，第二步是从第一步所得上清液中沉淀总IgY。将提取的IgY在缓冲液（通常为PBS）中透析后，可在-20°C下保存一年以上。提取物的纯度约为80%，每枚鸡蛋中总IgY含量为40–80 mg，具体数值取决于产蛋母鸡的年龄。随着母鸡年龄增长，每枚蛋中总IgY含量从约40 mg逐渐增加至80 mg（以PEG沉淀法为准）。一只母鸡每年产蛋量约为325枚，这意味着基于平均每枚蛋含60 mg总IgY计算，每年可获得约20 g总IgY的潜在收获量（见表1）。
方案
1. 实验方案——通过聚乙二醇沉淀法提取IgY
图1展示了IgY提取流程的示意图（见表2）。该方案最初由Polson et al. 于1980年描述。
所有步骤均应佩戴乳胶手套操作。
- 小心敲碎蛋壳，将蛋黄转移至“蛋黄勺”中，以尽可能去除蛋清。
- 将蛋黄转移至滤纸上并滚动，以去除残留的蛋清，然后用采血针或类似工具（如移液器吸头）切开蛋黄膜。将蛋黄倒入50 ml离心管中，并记录蛋液体积（V1）。
- 加入两倍于蛋黄体积的PBS与蛋黄混合（总体积为V1+V2），然后按总体积加入3.5%的PEG 6000（以克计，粉末状），涡旋混匀，随后在滚轴混合器上滚动10分钟。该提取步骤使混合物分离为两相：一相为“蛋黄固体和脂类物质”（引自Polson等，1980年的原始描述），另一相为含有IgY及其他蛋白质的水相。
- 将离心管在4°C下以10,000 rpm（相当于13,000 × g，Heraeus Multifuge 3SR+，固定角转子）离心20分钟。将上清液（V3）通过折叠滤纸过滤后转移至新离心管中。
- 根据新体积计算，向管中加入8.5%的PEG 6000（以克计），涡旋混匀，并参照步骤3在滚轴混合器上滚动混匀。
- 重复步骤4，但此次弃去上清液。
- 用玻璃棒和涡旋振荡器小心将沉淀溶解于1 ml PBS中，再加入PBS至终体积为10 ml（V4）。向该溶液中加入12% PEG 6000（w/v，1.2克），并按步骤3的方法处理（涡旋、滚轴混合）。
- 重复步骤6，小心将沉淀溶解于800 μl PBS中（使用玻璃棒和涡旋振荡器）。待气泡完全消失后，用移液器将提取液转移至透析袋中。用400 μl PBS冲洗离心管，并将冲洗液一并加入透析装置中（V5）。（透析装置及膜的准备方法见附录。）
- 将提取液在0.1%生理盐水（1,600 ml）中透析过夜，并使用磁力搅拌器轻轻搅拌。次日清晨更换为PBS，继续透析三小时。
- 随后用移液器将IgY提取液从透析袋中取出，转移至2 ml离心管中。最终体积约为2 ml（V6）。
- 将样品用PBS稀释50倍后，在280 nm处进行分光光度法测定蛋白质含量（mg/mL），并根据Lambert-Beer定律及IgY的消光系数1.33进行计算（见图2）。图4展示了制备样品的质量（纯度和回收率均约为80%）。
- 建议将样品分装后于-20°C保存（避免在-70°C下冷冻样品）。
- 最终制备物的质量可通过JoVE实验方案中描述的简单SDS-PAGE进行分析，详见 https://www.jove.com/details.php?id=1916
2. 附录——使用透析袋前，必须按照生产商的建议以以下方式准备：
- 将20根透析袋剪成30 cm长的小段，放入2000 ml的玻璃烧杯中。
- 加入1,750 ml的5 mM EDTA溶液。
- 在透析袋上方放置一个玻璃漏斗，确保透析袋完全浸没于EDTA溶液中。将溶液加热并煮沸5分钟（使用电热板）。倾去溶液，透析袋用蒸馏水清洗三次。
- 再次加入1,750 ml EDTA溶液，煮沸5分钟，然后如上所述用蒸馏水清洗三次。
- 最后将透析袋在蒸馏水中煮沸10分钟，并于4°C下保存。使用无菌镊子取出透析袋。
3. 代表性结果
图 1. 根据 Polson et al. 1980 年原始描述，采用聚乙二醇沉淀法提取 IgY 的示意图。单击此处查看大图。
图 2. 免疫母鸡蛋黄中总 IgY 随年龄变化的发育情况。数据表示每周每枚蛋中总 IgY 的平均值及标准差（SD，n = 4 只产蛋母鸡）。来源：[Pauly et al. 2009]。
图 3.
四只接种不同抗原的母鸡的产蛋能力监测。箭头表示免疫接种日期（引自 [Pauly et al.
2009]）。点击查看高清图像。
图 4. 不同鸡蛋来源的单个 IgY 制品在还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
泳道 1 - 分子量标记物，泳道 2 - IgY 标准品，泳道 3-5 - 按本方案所述方法制备的不同 IgY 样品。这些样品为按照方案第 10 步所得的最终制品。
HC - 重链，LC - 冲链，? - 分子量约为 35 kDa 的少量杂质（可能为卵黄原蛋白 II 前体的 C 末端片段，[Klimentzou et al., 2006]）。
| 鸡 21 (抗原 A) | 鸡 22 (抗原 A) | 鸡 19 (抗原 B) | 鸡 23 (抗原 C) | |
| 产蛋数（总 IgY）1，2 年期间 | 625（38 g） | 626（38 g） | 545（33 g） | 608（37 g） |
| 产蛋数（总 IgY），第一年 | 345（20 g） | 304（16 g） | 326（18 g） | 308（17 g） |
| 产蛋数（总 IgY），第二年 | 280（18 g） | 322（21 g） | 219（15 g） | 300（20 g） |
| 第一年最高可能产蛋数的百分比2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| 第二年最高可能产蛋数的百分比 | 86 | 99 | 67 | 92 |
| 已处理的鸡蛋数量 | 565 | 620 | 283 | 401 |
1总IgY的量通过将鸡蛋数量乘以每枚鸡蛋平均60 mg蛋白质来计算，依据图2的数据。
2根据饲养者提供的信息，每年最多可能产卵 325 枚。
表1. 免疫不同抗原的鸡产蛋能力的两年统计数据。免疫不同抗原后四只母鸡最大产蛋能力的百分比，以及两年期间的IgY产量（另见图3）[Pauly et al. 2009]。
| 卵编号 | 产蛋母鸡编号 产蛋日期 | V1[ml] 卵黄体积 | V2[ml] PBS 体积 | 第一次 PEG 沉淀 [g] | 沉淀、离心和过滤后的体积 [ml] | 第二次 PEG 沉淀 [g] | 沉淀物 | 第三次 PEG 沉淀 [g] | 沉淀物 | 透析后体积 [ml] | 总蛋白浓度 mg/ml | 校正后总蛋白浓度 mg/ml |
| 2×V1，∑V1 + V2 | 3.5% [w/v]，∑V1 + V2 | 沉淀、离心和过滤后体积 V3 | 8.5% [w/v] V3 | 溶解于 V4 ml PBS 中 | 12% [w/v] V4 | 溶解于 V5 ml PBS 中 | 对 PBS 透析后体积 V6 | A280/ml | A280/ml ÷ 1.33 | |||
| 1 | H293 / 22.10. | 15 | 30 45 | 1.58 | 31 | 2.63 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 35.0 | 26.3 |
| 2 | H293 / 23.10. | 13 | 26 39 | 1.37 | 25 | 2.12 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 28.8 | 21.6 |
表2. PEG 沉淀的示例性实验方案
讨论
选择合适的IgY纯化方法受纯化规模（实验室或工业级）、成本效益、技术条件（实验室设备）以及对环境的影响（废物管理）等因素影响。De Meulenaer与Huyghebaert（2001年）以及Schade 等（2005年）已对多种IgY提取方法进行了详细综述。总体而言，这些方法可分为三大主要类别：
- 沉淀法：包括硫酸铵或硫酸钠沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法、辛酸沉淀法以及卡拉胶沉淀法。
- 层析方法：亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、硫亲和相互作用层析以及凝胶过滤层析。
- 超滤法。
通过结合多种方法可提高IgY制备物的纯度；例如，可将聚乙二醇（PEG）沉淀法与亲和层析法联合使用。在某些情况下，根据最终应用目的，仅使用IgY的水提取物即可获得良好效果（Akita & Nakai 1993）。根据我们的经验，通过PEG沉淀法获得的IgY样品在多种不同的免疫学检测中表现非常理想。通过标准化PEG沉淀方法，一名技术助理每周可处理约84枚鸡蛋，相当于每周获得4至7克总IgY。简单计算如下：一只产蛋母鸡经抗原免疫后，经过数次加强免疫，在30天内可产生效价达1:50,000的特异性抗体（Ab）。30枚鸡蛋 × 每枚2 ml IgY提取物（见实验方案及图3），共得60 ml总IgY，相当于抗体稀释体积达3,000升（一个水桶的容量为10升），即可用该抗体溶液填满300个水桶。因此，考虑到如此巨大的抗体产量，储存具有恒定质量和特异性的抗体库并非难事。该技术可减少多特异性抗体中常见的批次间差异。
除了数量方面的优势外，IgY 抗体相较于哺乳动物 IgG 还具有其他优点：不会激活哺乳动物补体系统，不与人抗鼠抗体（HAMA）、类风湿因子或人类血型抗原发生交叉反应（缺乏异种凝集素）。
IgY-Ab 的一个显著优势是所谓的系统发育距离。这种系统发育距离导致了即使在相同免疫条件下，哺乳动物与鸡所产生的抗体特异性常常存在显著差异。除了哺乳动物与鸟类免疫系统本身的差异外，这两大类动物在系统发育上的差异也促成了抗体特异性的不同。已有多个研究者报道，鸡在针对系统发育上高度保守的哺乳动物蛋白或多肽产生抗体时，其效率通常高于兔子（综述见 Schade 等，2005）。因此，某些保守的抗原在兔子免疫系统中可能保持“隐蔽”状态，从而仅引发微弱或“沉默”的免疫应答。此外，当鸡和兔子被同一哺乳动物抗原免疫时，鸡往往会产生在兔子中极难获得的抗体特异性。动物福利方面同样重要，因为抗体可非侵入性地从蛋黄中提取。结合基因枪（质粒）免疫技术，IgY 的生产可实现完全非侵入性（Witkowski et al. 2009）。
综上所述，利用母鸡生产抗体并通过聚乙二醇（PEG）沉淀法提取IgY，是一种非常经济高效的方法，可获得效价稳定且特异性很高的抗体，其效价可达1:1,000,000。由于鸟类（Aves）与哺乳类（Mammalia）之间存在较远的系统发育距离，鸡能够针对高度保守的哺乳动物抗原产生特异性抗体，而例如兔则往往难以做到这一点。通过IgY技术所获得的大量抗体，为IgY抗体在人类医学和兽医学中用于治疗或预防目的开辟了广阔的应用前景。
披露
动物实验严格按照柏林卫生与社会事务局（Landesamt fur Gesundheit und Soziales Berlin，H 0069/03）制定的指南和规定进行。
致谢
本工作由德国联邦教育与研究部资助（项目 BiGRUDI［生物危险情景：风险评估、超快速检测与鉴定生物恐怖相关制剂，13N9594］）。我们感谢柏林夏里特医学院药理学研究所 B. Diemar 提供的出色技术支持。
材料
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参考文献
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
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