转染哺乳动物细胞的批量过量培养中抗体的生产

摘要

来源：Elgundi, Z. 等，治疗性抗体的实验室规模生产与纯化 J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了一种利用稳定转染的哺乳动物细胞生产治疗性抗体的方法。添加胰蛋白胨可促进细胞分裂，导致细胞过度生长，并支持更高的抗体产量。收集含抗体的培养基，经过滤后储存，以供后续使用。

方案

注意：本方案必须使用合适的哺乳动物表达载体。此处使用包含两个表达盒的单个构建体（即， 重链和轻链的表达由不同的启动子驱动。曲妥珠单抗的重链和轻链此前已被克隆至该载体中。该载体由Andrew Beavil赠送，通过非营利性质粒库获得。

1. 载体DNA的回收与扩增

注意：载体DNA以软琼脂穿刺培养物的形式提供，宿主菌为 Escherichia coli  XL-1 Blue菌株；该载体带有潮霉素抗性基因。

1. 将无菌的接种针或接种环插入穿刺培养的软琼脂中，然后在含有75 µg/ml 潮霉素的Luria Bertani (LB) 琼脂平板上划线以获得单菌落。于37 °C培养18–24小时。
2. 挑取单菌落接种于5 ml含有75 µg/ml 潮霉素的优质肉汤（Terrific broth, TB）中。在37 °C、225 rpm振荡条件下培养18–24小时。
3. 利用过夜培养物制备质粒DNA的甘油保存液：取800 µl培养物与200 µl 80%甘油在冻存管中轻轻混匀，于-80 °C冻存。
   1. 将100 µl过夜培养物加入含75 µg/ml 潮霉素的100 ml TB培养液中，置于带挡板的摇瓶中（i.e., 1/1,000稀释）。在37 °C、225 rpm振荡条件下培养18–24小时。
4. 过夜培养后，按照中量/大量提取试剂盒的生产商说明书提取并纯化脱氧核糖核酸（DNA），但作如下修改：在最后一步使用水（pH 7.0–8.5）洗脱或重悬DNA。
5. 通过测定260 nm和280 nm处的吸光度检测DNA的浓度和纯度，然后将DNA于-20 °C保存。
   注意：可选步骤（强烈推荐）：使用载体特异性引物对DNA进行测序以确认其身份。

2. HEK-293 细胞的稳定转染

1. 在锥形瓶中，按照标准方案在添加了0.1%非离子型表面活性剂的无血清培养基中培养和维持HEK-293细胞（悬浮细胞）。细胞密度维持在2 × 10⁶ cells/mL⁵ 细胞/ml，并每四天传代一次。细胞培养条件为37 °C，5%二氧化碳（CO₂）。₂) 120 转/分钟旋转。      
   注意转染前，细胞培养时间不应少于4天，且不应超过4周。在含血清培养基中以单层形式培养的HEK-293细胞也可用于本实验。
2. 转染前一天，将 HEK-293 细胞以 3 × 10⁵ 个/孔的密度接种于 6 孔板中⁵ 细胞/毫升，加入含10%热灭活胎牛血清（FBS）的2毫升DMEM培养基，接种于12孔板的各孔中。转染当天，检查细胞是否已达到80-90%汇合度
3. 将DNA和聚乙烯亚胺（PEI）分别用转染培养基稀释，然后混合在一起。
   1. 每孔加入1.25 µg质粒DNA（12孔共15 µg），溶于300 µl转染培养基中，室温孵育5分钟。
   2. 稀释2.5 µl的1 mg/ml PEI溶液（12孔板用30 µl， 即 DNA与PEI按1:2比例加入300 µl转染培养基中，室温孵育5分钟。
   3. 将稀释的DNA加入稀释的PEI中，轻轻混匀，室温孵育15分钟。
4. 将50 µl DNA/PEI混合物逐滴加入到板的每孔中。轻轻摇动培养板以分散转染混合物，然后将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 24 小时。
5. 每孔加入 50 µg/ml 潮霉素 B，将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱₂ 10天。
   注意到第10天时，未转染的细胞将死亡并从培养板表面脱落，而稳定转染的细胞则保持存活并贴附在培养板上。
6. 更换孔中培养基，加入 1/4 体积的无血清培养基和 3/4 体积的 DMEM，后者添加 10% FBS即 0.5 ml 无血清培养基 + 1.5 ml DMEM = 最终血清浓度为 7.5%），培养 4 天。
7. 更换孔中培养基，加入等体积的无血清培养基与添加10% FBS的DMEM混合液即 1 ml 无血清培养基 + 1 ml DMEM = 最终5%血清浓度），培养4天。
8. 在孔板中更换培养基，加入3/4体积的无血清培养基和1/4体积添加10% FBS的DMEM即 1.5 ml 无血清培养基 + 0.5 ml DMEM = 最终血清浓度为 2.5%，培养 4 天。
9. 在孔中加入2 ml无血清培养基，培养基中添加0.1%非离子型表面活性剂（即终浓度为0%血清），孵育4天。
   注意：在无血清培养基适应过程中，维持50 µg/ml潮霉素B的选择性压力。适应无血清培养基的细胞会从孔板表面脱落，并可能在悬浮液中聚集成团。有关添加50 µg/ml潮霉素B的培养条件，请参见步骤2.1。
10. 使用移液器轻轻混匀12孔板中的悬浮培养物，并将细胞收集至一个单独的离心管中。
    1. 使用血细胞计数板对汇集的细胞进行计数，并将细胞以2 × 10⁶个/ml的密度接种于锥形瓶中，加入30 ml无血清培养基⁵ 细胞/ml。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 以及120 rpm的转速。每四天传代并扩增一次。
11. 继续扩大培养规模至所需细胞密度，以获得10管，每管含1 x 10⁶细胞⁷ 细胞/小瓶用于液氮冷冻保存。使用含10%二甲基亚砜（DMSO）的无血清培养基冻存细胞。         
    注意：可在每次传代培养时收集含有抗体的条件培养基，以确认蛋白质的表达，或用于优化纯化条件。为收集条件培养基并维持细胞进行传代培养，将细胞培养物在300 × g下离心5分钟，然后将上清液经0.22 µm滤膜过滤除菌。过滤后的上清液可在4 °C保存1至2周，或在-20 °C长期保存。

3. 从批量过量培养中进行大规模抗体生产

注意：抗体生产可从步骤 2.11 继续进行，其中现有细胞根据拟建立的批量过量培养体积扩增至所需的细胞密度。否则，从冷冻保存中解冻的细胞在扩增至适当的细胞密度和体积后，从此阶段开始。可使用多种培养补充剂以优化抗体生产；本方案中展示了使用酪蛋白胨提高抗体产量的方法。

1. 在两个锥形瓶中，将细胞以 2 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度接种于 100 ml 无血清培养基中（用于比较未添加营养物与添加营养物培养条件下抗体的产量）。在 37 °C、5% CO₂ 、120 rpm 条件下培养。
2. 24 小时后，向添加营养物的培养体系中加入胰蛋白胨，使其终浓度为 0.5%。用无血清培养基补足未添加营养物培养体系的体积，使其与前者体积相等。
3. 从第 8 天开始，使用血细胞计数板每天对培养物进行细胞计数，以监测细胞活力。当细胞活力低于 80% 时，收集培养上清液。
   1. 通过在 3,000 × g 条件下离心 15 分钟收集上清液，然后使用 0.22 µm 滤器对上清液（含抗体）进行过滤除菌。将上清液储存在 4 °C（短期）或 -20 °C 冷冻（长期）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pFUSE 载体系列	N/A	InvivoGen	重链和轻链抗体基因分别在两个独立的载体中表达，需共转染。
mAbXpress 载体系列	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	重链和轻链抗体基因分别在两个独立的载体中表达，需共转染。参见：Jones, M. L. 等. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010)。
pVITRO1 载体	N/A	N/A	单个载体中，重链和轻链抗体基因分别由独立的启动子驱动。  参见：Dodev, T. S. 等. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014)。
GS 载体系列	N/A	Lonza	多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。
多顺反子载体系列 1	N/A	N/A	多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。参见：Li, J. 等. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007)。
多顺反子载体系列 2	N/A	N/A	多顺反子载体，重链和轻链抗体基因在同一转录本中共表达并翻译。参见：Ho, S. C. 等. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012)。
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883	Addgene	含曲妥珠单抗抗体基因及潮霉素抗性基因的哺乳动物表达载体；pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ 由 Andrew Beavil 惠赠。
Fast-Media Hygro 琼脂	fas-hg-s	Jomar Life Research	用于制备含 75 µg/ml 潮霉素的低盐 LB 琼脂。
Fast-Media Hygro TB	fas-hg-l	Jomar Life Research	用于制备含 75 µg/ml 潮霉素的低盐 TB 肉汤。
甘油，BioXtra，≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	用水配制成 80% 溶液，高压灭菌。室温保存。
Jestar 2.0/LFU 质粒大提试剂盒	G221020	Astral Scientific	质粒大提试剂盒；用去离子水（pH 7.0–8.5）洗脱或重悬 DNA。
FreeStyle 293-F 细胞	R790-07	Life Technologies	适应无血清培养基悬浮培养的 HEK-293 细胞系。
FreeStyle 293 表达培养基	12338-018	Life Technologies	专为维持 293-F 细胞系生长及高效蛋白表达而配制的无血清培养基。
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	非离子型表面活性剂；即 Pluronic F-68；用水配制成 10% 溶液，使用 0.22 μm 滤器过滤除菌。4°C 保存。
DMEM，高糖	11995-065	Life Technologies
热灭活胎牛血清	10082-147	Life Technologies
聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000	23966	Polysciences, Inc.	用水配制成 1 mg/ml 溶液。用 1 M HCl 调节 pH 至 7.0（溶液变澄清），使用 0.22 μm 滤器过滤除菌。使用前于 -80°C 保存。
OptiPro SFM	12309-050	Life Technologies	用于转染的无血清培养基
潮霉素 B 溶液	ant-hg-1	Jomar Life Research
二甲基亚砜（DMSO）	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
胰蛋白胨（酪蛋白胨）	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	用 PBS 配制成 20% 溶液，使用 0.22 μm 滤器过滤除菌。4°C 保存。
BLItz 系统	45-5000	fortéBIO	用于生物层干涉测量（BLI）的仪器。