基于流式细胞术的树突状细胞活化分析——利用免疫复合物

摘要

来源：Santana-Magal, N., 等 小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 肿瘤免疫复合物激活 视频实验杂志 (2018)

本视频演示了一种利用免疫球蛋白G（IgG）包被的肿瘤细胞评估树突状细胞活化状态的实验方案。树突状细胞会内吞IgG包被的肿瘤细胞，加工肿瘤抗原，并通过MHC-II分子将抗原呈递至细胞表面，同时共表达共刺激分子CD86。随后，对这些树突状细胞进行针对MHC-II和CD86的免疫染色，并通过流式细胞术分析，以鉴定其活化状态。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 肿瘤相关单核细胞来源树突状细胞的分离

1. 在超净工作台中，从 CO₂ 处死的小鼠体内取出肿瘤，并将肿瘤置于不含胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中。
   注意：建议在取肿瘤前对小鼠进行剃毛并喷洒 70% 乙醇，以最大限度减少毛发带来的潜在污染。确保肿瘤面积不超过 25 - 40 mm² ，因为较大的肿瘤中树突状细胞（DC）数量较少，且细胞脆弱，易发生死亡。若需要更多 DC，可在每只小鼠多个部位注射肿瘤细胞。
2. 在无菌超净台中，使用手术剪将肿瘤剪切成小块（约 1 × 1 mm²）。
   1. 将一只小鼠的所有肿瘤碎片加入一个含有磁力搅拌子的 30 mL 无菌平底管中，加入 5 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL IV 型胶原酶和 0.01 mg/mL DNase I。
      注意：髓系细胞即使在稳态下也通过糖酵解产生能量。因此，只能使用含葡萄糖的培养基（如 HBSS、RPMI 或 DMEM），因为葡萄糖缺乏仅 10 - 15 分钟即可导致细胞在 24 小时内发生死亡和凋亡。必须使用低内毒素的 IV 型胶原酶，因为胶原酶由革兰氏阳性菌....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PREMIUM	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	StemCell Technologies	7820
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-052-301
EasySep 单核细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	19861
胶原酶 IV	Sigma	C9697-50MG	每批次均需检测内毒素
DNase I	Sigma	DN25-10MG
HBSS	ThermoFisher	14025092
FBS	ThermoFisher	16140071	每批次均需检测内毒素
PE-CD11c	Biolegend	117307
APC-CD11b	Biolegend	101211
Brilliant Violet 650 MHCII	Biolegend	107641
AF48- CD86	Biolegend	105017
APC/Cy7-Ly-C6	Biolegend	108423
PE/Cy7-CD15	Biolegend	135523