基于流式细胞术的树突状细胞活化分析——利用免疫复合物

摘要

来源：Santana-Magal, N., 等 小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 肿瘤免疫复合物激活 视频实验杂志 (2018)

本视频演示了一种利用免疫球蛋白G（IgG）包被的肿瘤细胞评估树突状细胞活化状态的实验方案。树突状细胞会内吞IgG包被的肿瘤细胞，加工肿瘤抗原，并通过MHC-II分子将抗原呈递至细胞表面，同时共表达共刺激分子CD86。随后，对这些树突状细胞进行针对MHC-II和CD86的免疫染色，并通过流式细胞术分析，以鉴定其活化状态。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 肿瘤相关单核细胞来源树突状细胞的分离

1. 在超净工作台中，从 CO₂ 处死的小鼠体内取出肿瘤，并将肿瘤置于不含胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中。
   注意：建议在取肿瘤前对小鼠进行剃毛并喷洒 70% 乙醇，以最大限度减少毛发带来的潜在污染。确保肿瘤面积不超过 25 - 40 mm² ，因为较大的肿瘤中树突状细胞（DC）数量较少，且细胞脆弱，易发生死亡。若需要更多 DC，可在每只小鼠多个部位注射肿瘤细胞。
2. 在无菌超净台中，使用手术剪将肿瘤剪切成小块（约 1 × 1 mm²）。
   1. 将一只小鼠的所有肿瘤碎片加入一个含有磁力搅拌子的 30 mL 无菌平底管中，加入 5 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL IV 型胶原酶和 0.01 mg/mL DNase I。
      注意：髓系细胞即使在稳态下也通过糖酵解产生能量。因此，只能使用含葡萄糖的培养基（如 HBSS、RPMI 或 DMEM），因为葡萄糖缺乏仅 10 - 15 分钟即可导致细胞在 24 小时内发生死亡和凋亡。必须使用低内毒素的 IV 型胶原酶，因为胶原酶由革兰氏阳性菌（Clostridium histolyticum）产生。
3. 在 37 ^oC 培养箱中，以磁力搅拌器以约 200 - 400 rpm 搅拌 20 - 30 分钟。
4. 加入 5 mL 完全培养基，剧烈重悬细胞。
5. 通过 70 µm 细胞筛过滤细胞。在 4 ^oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟以沉淀细胞。
   注意：不要在酶消化后直接分离细胞，因为某些肿瘤存在坏死，含有较多细胞碎片或细胞外基质。应将细胞加载至 15% 密度梯度介质上，以仅获得完整细胞。
6. 将 9 mL 密度梯度介质与 1 mL 10× 磷酸盐缓冲液（PBS）混合，以调节渗透压并获得 100% Percoll 储备液。将 1.5 mL 密度梯度介质储备液与 8.5 mL HBSS 混合，并剧烈混合肿瘤来源的细胞沉淀。在 15% 密度梯度介质上方轻轻覆盖 2 mL DMEM，室温下以 400 rcf 离心 20 分钟。弃去上清液，细胞将形成底部沉淀。
   1. 用含 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 10 mL HBSS（分离缓冲液）重悬沉淀细胞两次，并在 4 ^oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟以沉淀细胞。
   2. 在光学显微镜下使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数细胞。
7. 将 1 × 10⁸ 个细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中，在 4 ^oC 下与 30 μL CD11b⁺ 偶联磁珠孵育 15 分钟。
   注意：避免使用 CD11c 偶联磁珠，因其会激活 DC 并诱导细胞死亡。不要尝试使用抗 CD16/32 抗体阻断 FcγRII 和 FcγRIII。阻断抗体会与 FcγR 结合，强烈诱导丝裂原活化蛋白（MAP）激酶的磷酸化，从而启动 DC。
   1. 加入 9 mL 分离缓冲液以去除未结合的多余磁珠，并在 4^oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。
8. 吸弃上清液，将细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中。将细胞加载至预清洗的磁柱上。用 3 mL 分离缓冲液洗涤磁柱两次。
   1. 将磁柱从磁架上取下。用移液器将 6 mL 分离缓冲液加入磁柱，推动活塞将磁性标记的细胞冲洗至无菌收集管中。在 4 ^oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。
   2. 将细胞重悬于每 1 × 10⁷ 个细胞 100 μL 的缓冲液中，并用以下荧光素偶联抗体染色：谱系阴性（TCRb、Siglec F、B220、CD19、FceRI 和 Ly6G）、 MHCII、Ly-6C。
9. 通过侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）设门分选小细胞，并在补充了 5 ng/mL GM-CSF 的完全培养基中培养——在 37 ^oC 孵育 1 小时，使巨噬细胞贴壁。随后，将未贴壁的松散细胞转移至新的培养皿中。
   注意：小鼠单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）定义为 CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int。Ly6C 的表达在不同肿瘤模型间差异显著，在某些模型（如 LMP）中，MoDC 完全不表达 Ly6C。一个 100 mm³ 的 B16F10 肿瘤通常含有约 5 × 10⁴ 个 DC，最终获得约 4 - 5 × 10⁶ 个总细胞。其中 10 - 15% 为免疫细胞，8 - 10% 为 MoDC。可通过在多个部位接种肿瘤细胞以增加 DC 数量。仅分选 SSC/FSC 小的细胞，因为其他髓系细胞也可能表达 CD11c 和 Ly6C 等标志物。
   可选：将肿瘤浸润单核细胞分选为表达 Ly6C^hi 且 MHCII 阴性的 SSC/FSC 小细胞。随后，在体外 in vitro 使用 50 ng/mL GM-CSF 培养单核细胞以获得 DC。

2. 肿瘤-IgG 免疫复合物的制备

1. 在完全 DMEM 培养基中，将肿瘤细胞于 75 cm² 培养瓶中培养至 70% 汇合度。
   1. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 以使细胞从培养瓶脱离，并在光学显微镜下监测细胞形态，避免过度消化。
   2. 每 2 mL 胰蛋白酶加入 8 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用，随后在 4 ^oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟以收集细胞。
      注意：使用商用 PCR 试剂盒检测肿瘤细胞中是否存在 Mycoplasma ；使用 Limulus Amebocyte Lysate （LAL）检测法检测革兰氏阴性菌和真菌内毒素。血清必须经 0.22 μM 滤膜过滤，并检测是否含有联邦法规 9 项病毒。此外，取 100–200 μL 培养基或血清滴加至 LB 琼脂或肉汤培养基上，在 37 ^oC 培养 2 天进行微生物检测。
   3. 用 10 mL PBS 重悬细胞以去除残留的胰蛋白酶和血清，400 rcf 离心 5–10 分钟。吸除上清液，并重复洗涤两次。
2. 在室温下用 1.8% 缓冲型多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
   1. 用 10 mL PBS 重悬细胞进行洗涤，在 4 ^oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。
   2. 吸除上清液，并重复洗涤两次。
      可选步骤：对于肿瘤摄取实验，可将细胞在含 1 μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的 PBS 中于 37 ^oC 孵育 5 分钟进行标记。随后在冰上用完全培养基淬灭 CFSE 10 分钟。应用含 2% 血清的 PBS 对细胞进行充分洗涤，以去除残留染料。
3. 将细胞重悬于荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含 2% FCS 和 5 mM EDTA 的 PBS）中，并加入 0.5 μg/mL 抗 CD16/32 抗体以阻断潜在的非特异性蛋白-蛋白相互作用。以每 100 μL 含 1 × 10⁵ 个细胞的浓度接种至 U 型底 96 孔板。
   1. 加入不同稀释浓度的肿瘤结合抗体，范围为每 1 × 10⁵ 个细胞 5 μg 至 5 ng。将 96 孔板置于冰上孵育 15–20 分钟。
      注意：如前所述，IgG 抗体系从未经处理的 20–24 周龄雌性小鼠血清中通过蛋白 A 柱分离获得。
4. 每孔加入 150 μL PBS 洗涤细胞，随后在 4 ^oC、400 rcf 条件下离心 5–10 分钟。
   1. 弃去上清液，重复洗涤两次。将细胞重悬于含荧光标记二抗的 100 μL FACS 缓冲液中，冰上孵育 20 分钟。
   2. 每孔加入 200 μL FACS 缓冲液洗涤，400 rcf 离心 5–10 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。
   3. 通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的最低抗体浓度。
      注意：若抗体染色后肿瘤细胞的平均荧光强度（MFI）较同型对照未增加至少五倍，则不应在后续功能实验中使用该抗体。

3. 使用肿瘤-IgG 免疫复合物激活 MoDC

1. 按照 2.1 至 2.4.3 节所述，用最低浓度的 IgG 包被肿瘤细胞。
   1. 在用肿瘤免疫复合物（IC）激活 MoDC 的前一天，更换含有 GM-CSF 的 MoDC 培养基。操作时，轻轻吸除培养基，并用预热的完全培养基洗涤细胞一次。
      注意： 分选后，分离得到的成熟肿瘤相关 MoDC 应在不含 GM-CSF 的完全培养基中培养至少 2 - 3 小时（甚至过夜），然后再用 IC 激活。
   2. 进行肿瘤细胞摄取分析时，将 CFSE 标记的肿瘤 IC 以 1:5（IC: MoDC）的比例加入 MoDC 中，每 1 × 10⁶ DC 使用 1 mL 完全培养基，于 37°C 孵育过夜 12 - 16 小时。
   3. 进行 MoDC 激活实验的流式细胞术（FACS）分析时，以 1:1（IC: MoDC）的比例加入肿瘤 IC，并在 37°C 孵育过夜 12 - 16 小时。
      注意： 强烈建议设置阳性对照孔，其中 MoDC 使用 1 μg/mL 的 LPS 或其他 TLR 激动剂进行刺激。
   4. 过夜激活后，吸除上清液，并用分离缓冲液或含 10 mM EDTA 的 HBSS 轻柔洗涤细胞三次。
   5. 为使 DC 从培养板上脱落，将细胞在含 10 mM EDTA 的 1 mL HBSS 中孵育 2 - 3 分钟，并通过剧烈吹打使细胞脱落。
   6. 以 400 rcf 离心细胞，然后将 1 × 10⁶ DC 重悬于 90 μL 含 2% FCS、5 mM EDTA 的 PBS（FACS 缓冲液）中，并加入 0.5 μg 阻断抗体。冰上孵育 5 - 10 分钟。
   7. 向细胞中加入 10 μL 染色抗体混合物，冰上孵育 15 分钟。
   8. 向细胞中加入 2 mL FACS 缓冲液，在 4 ^oC 下以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。
2. 将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。
   1. 上机检测前 1 - 2 分钟加入 0.5 - 1 μg/mL 的 DAPI，以排除死细胞。DAPI 孵育时间不宜过长，因为 MoDC 会在 10 - 15 分钟内摄取 DAPI。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PREMIUM	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	StemCell Technologies	7820
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-052-301
EasySep 单核细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	19861
胶原酶 IV	Sigma	C9697-50MG	每批次均需检测内毒素
DNase I	Sigma	DN25-10MG
HBSS	ThermoFisher	14025092
FBS	ThermoFisher	16140071	每批次均需检测内毒素
PE-CD11c	Biolegend	117307
APC-CD11b	Biolegend	101211
Brilliant Violet 650 MHCII	Biolegend	107641
AF48- CD86	Biolegend	105017
APC/Cy7-Ly-C6	Biolegend	108423
PE/Cy7-CD15	Biolegend	135523