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使用免疫复合物对树突状细胞活化进行基于流式细胞术的分析

July 8th, 2025

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源:Santana-Magal， N.， et al. 小鼠单核细胞衍生的树突状细胞及其随后的肿瘤免疫复合物体外激活的分离方案。J. Vis. Exp. （2018 年）

该视频演示了使用免疫球蛋白 G （IgG） 包被的肿瘤细胞评估树突状细胞活化的方案。树突状细胞内化 IgG 包被的肿瘤细胞，加工肿瘤抗原，并通过 MHC-II 分子以及共刺激分子 CD86 的共表达将它们呈递在表面。然后，这些树突状细胞进行 MHC-II 和 CD86 靶向免疫染色和流式细胞术分析，以确定其激活状态。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 分离肿瘤相关单核细胞衍生的树突状细胞

  1. 在层流罩中，从 CO2 安乐死小鼠中去除肿瘤，并将肿瘤置于不含胎牛血清 （FBS） 的 RPMI 培养基中。
    注意:强烈建议在去除肿瘤之前给小鼠剃毛并用 70% 乙醇喷洒它们，以尽量减少皮毛的潜在污染。确保肿瘤不超过 25 - 40 mm2，因为较大的肿瘤具有较少的树突状细胞 （DC），这些细胞往往很脆弱并且容易发生细胞死亡。如果需要更多的 DC，可以在每个小鼠的多个部位注射肿瘤细胞。
  2. 在无菌层罩下，使用手术剪刀将肿瘤切成小块（约 1 x 1 mm2）。
    1. 将一只小鼠的所有肿瘤片段加入带有磁力搅拌棒的 30 mL 无菌平底管中，该管含有 5 mL 汉克平衡盐溶液 （HBSS）、2 mg/mL 胶原酶 IV 和 0.01 mg/mL DNase I.
      谨慎:骨髓细胞通过糖基化产生能量，即使在稳定状态下也是如此。因此，仅使用含有葡萄糖的培养基（例如，HBSS、Roswell Park Memorial Institute （RPMI） 和 Dulbecco's Modified Eagle 培养基 （DMEM）），因为葡萄糖饥饿仅 10 - 15 分钟就会导致细胞死亡和 24 小时内细胞凋亡。仅使用低内毒素胶原酶 IV，因为胶原酶是由革兰氏阳性菌（溶组织梭菌）产生的。
  3. 在带有磁力搅拌器的 37 oC 培养箱中以约 200 - 400 rpm 的速度搅拌 20-30 分钟。
  4. 加入 5 mL 完全培养基并剧烈重悬。
  5. 通过 70 μm 细胞过滤器过滤细胞。在 4 oC 400 rcf 下离心 5 - 10 分钟以沉淀细胞。
    谨慎:不要试图在酶消化后直接分离细胞，因为有些肿瘤是坏死的，并且含有相对大量的细胞碎片或细胞外基质。将细胞施加在 15% 密度梯度培养基上，以仅获得细胞。
  6. 用 1 mL 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 悬浮 9 mL 密度梯度培养基，以调节渗透压并获得 100% Percoll 储备溶液。将 1.5 mL 密度梯度培养基储备液与 8.5 mL HBSS 混合，并将其与肿瘤来源的细胞沉淀充分混合。将 2 mL DMEM 轻轻地铺在 15% 密度梯度培养基的顶部，并在室温下以 400 rcf 离心 20 分钟。丢弃上清液，因为细胞会在试管底部形成沉淀。
      将
    1. 沉淀的细胞重悬于含有 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 10 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）（分离缓冲液）的 10 mL HBSS 中，洗涤沉淀细胞两次，并在 4 oC 400 rcf 下离心 5-10 分钟以沉淀细胞。
    2. 在光学显微镜下使用台盼蓝在血细胞计数器上计数细胞。
  7. 在 1 mL 分离缓冲液中重悬 1 x 108 个细胞，并在 4 oC 下与 30 μL CD11b + 偶联磁珠一起孵育 15 分钟。
    注意:避免使用 CD11c 偶联的微珠，因为这会激活 DC 并诱导细胞死亡。不要试图用抗 CD16/32 抗体阻断 FcγRII 和 FcγRIII。阻断抗体连接 FcγR，诱导丝裂原活化蛋白 （MAP） 激酶的强磷酸化，并引发 DC。
    1. 加入 9 mL 分离缓冲液去除多余的未结合珠子，并在 4°C 下以 400 rcf 离心细胞 5 - 10 分钟。
  8. 吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL 分离缓冲液中。将细胞涂在预洗的磁柱上。用 3 mL 分离缓冲液洗涤色谱柱两次。
    1. 从磁力架上取下色谱柱。将 6 mL 分离缓冲液移液到色谱柱上，然后推动柱塞将磁性标记的细胞冲洗到无菌收集管中。在 4 oC 下以 400 rcf 离心细胞 5 - 10 分钟。
    2. 以每 1 x 107 个细胞 100 μL 的浓度重悬细胞，并使用以下荧光团偶联抗体染色:Linage 阴性（TCRb、Siglec F、B220、CD19、FceRI 和 Ly6G）、MHCII、Ly-6C。
  9. 通过设门小细胞、使用侧向散射 （SSC） 和前向散射 （FSC） 对细胞进行分选，并在补充有 5 ng/mL GM-CSF 的完全培养基中培养—在 37 °C 下孵育细胞 1 小时，使巨噬细胞粘附在板上。然后，将松散和非贴壁细胞转移到新的培养皿中。
    注意:小鼠 MoDC 定义为 CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int。Ly6C 的表达可能因肿瘤模型而异，在某些模型（例如 LMP）中，MoDC 完全缺乏 Ly6C 表达。一个 100 mm3 B16F10 肿瘤通常包含 5 x 104 个 DC，总共产生大约 4 - 5 x 106 个细胞。在这些细胞中，10 - 15% 是免疫细胞，8 - 10% 是 MoDC。可以通过在多个部位注射肿瘤小鼠来实现 DC 数。仅对小的 SSC/FCS 细胞进行分选，因为其他髓系细胞可以表达 CD11c 和 Ly6C 等标志物。
    自选:将肿瘤浸润单核细胞分选为表达 Ly6Chi 且 MHCII 阴性的小 SSC/FSC 细胞。之后，用 50 ng/mL GM-CSF 体外培养单核细胞以获得 DC。

2. 肿瘤-IgG 免疫复合物的制备

  1. 在 75 cm2 培养瓶中培养肿瘤细胞，在完全 DMEM 培养基中达到 70% 汇合。
    1. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 以从培养瓶中分离细胞，并在光学显微镜下监测细胞形态，以避免过度胰蛋白酶消化。
    2. 加入 8 mL 完全培养基（每 2 mL 胰蛋白酶）以抑制胰蛋白酶消化，并在 4 oC、400 rcf 下离心 5-10 分钟以沉淀细胞><。 注意:使用市售 PCR 试剂盒检查肿瘤细胞中的支原体。使用鲎试剂变形细胞裂解物 （LAL） 测定法检测革兰氏阴性菌和真菌内毒素。血清必须通过 0.22 μM 过滤，并检测 9 Code of Federal Regulations 病毒。此外，将 100 - 200 μL 滴加到 LB 琼脂或肉汤上，并在 37 °C 下培养 2 天，以测试培养基和血清。
    3. 将细胞重悬于 10 mL PBS 中，再次从胰蛋白酶和血清残留物中洗涤细胞，并以 400 rcf 离心 5 - 10 分钟。吸出上清液并重复洗涤 2 次。
  2. 在室温下将细胞在 1.8% 缓冲多聚甲醛中固定 10 分钟。
      将
    1. 细胞重悬于 10 mL PBS 中洗涤细胞，并在 4 oC 400 rcf 下离心 5 - 10 分钟。
    2. 吸出上清液并重复洗涤 2 次><。 自选:对于肿瘤摄取测定，可以通过在含有 1 μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE） 的 PBS 中于 37 oC 孵育 5 分钟来标记细胞。然后用完全培养基在冰中淬灭 CFSE 10 分钟。应在含有 2% 血清的 PBS 中充分洗涤细胞，以去除残留染料。
    3. 将
  3. 细胞重悬于荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液（补充有 2% FCS + 5 mM EDTA 的 PBS）和 0.5 μg/mL 抗 CD16/32 中，以阻断潜在的非特异性蛋白质-蛋白质相互作用。U 形板 96 孔/板，浓度为 1 x 105 个细胞/100 μL。
    1. 添加不同稀释度的肿瘤结合抗体，范围为 5 μg - 5 ng/1 x 105 个细胞。将板在冰上孵育 15-20 分钟
      注意:如前所述，在蛋白 A 柱上从幼稚的 20-24 周龄雌性小鼠的血清中分离 IgG 抗体。
  4. 通过添加 150 μL PBS 并在 4 oC 400 rcf 下离心板 5 - 10 分钟来洗涤细胞。
    1. 弃去上清液并重复洗涤两次。将细胞重悬于含有荧光团偶联二抗的 100 μL FACS 缓冲液中。将板在冰上孵育 20 分钟。
    2. 通过添加 200 μL FACS 缓冲液并以 400 rcf 离心板 5 - 10 分钟来洗涤细胞。弃去上清液并重复洗涤。
    3. 通过流式细胞术分析肿瘤结合并确定包被细胞所需的最低浓度。
      注意:与同种型对照相比，染色肿瘤细胞的平均荧光强度 （MFI） 不增加至少五倍的抗体不应用于后续功能测定。

3. 用 Tumor-IgG IC 激活 MoDC

  1. 用最低 IgG 浓度包被肿瘤细胞，如第 2.1 至 2.4.3 节所述
    1. 在用肿瘤 IC 激活 MoDC 前一天，更换含有 GM-CSF 的 MoDC 培养基。为此，请轻轻吸出培养基，并用预热的完全培养基洗涤细胞一次。
      注意:分离的成熟肿瘤相关 MoDC 应在不含 GM-CSF 的完全培养基中分选后培养至少 2 - 3 小时（甚至过夜），然后再用 IC 激活它们。
    2. 对于肿瘤摄取分析，将 CFSE 标记的肿瘤 IC 以 1:5 的比例（IC:MoDC）添加到 MoDC 中，并在每 1 x 106 DC 的 1 mL 完全培养基中孵育 12 - 16 小时。
    3. 对于 MoDC 活化实验的 FACS 分析，以 1:1 （IC: MoDC） 的比例添加肿瘤-IC，并孵育过夜 12 - 16 h.
      注意:强烈建议包括一个阳性对照孔，其中用 1 μg/mL 的 LPS 或其他 TLR 激动剂刺激 MoDC。
    4. 过夜活化后，吸出上清液，并用分离缓冲液或 10 mM EDTA HBSS 轻轻洗涤细胞 3 次。
    5. 要从板中分离 DC，将细胞在含有 10 mM EDTA 的 1 mL HBSS 中孵育 2 - 3 分钟，然后通过剧烈移液分离细胞。
    6. 以 400 rcf 离心细胞，并在补充有 2% FCS、5 mM EDTA（FACS 缓冲液）和 0.5 μg 封闭抗体的 90 μL PBS 中重悬 1 x 106 DC。在冰上孵育 5 - 10 分钟。
    7. 向细胞中加入 10 μL 染色抗体混合物，并在冰上孵育 15 分钟。
    8. 向细胞中加入 2 mL FACS 缓冲液，并在 4 oC 400 rcf 下离心 5 - 10 分钟。
  2. 将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。
    1. 在运行样品前 1 - 2 分钟添加 0.5 - 1 μg/mL 的 DAPI，以从分析中排除死细胞。不要过度孵育 DAPI，因为 MoDC 会在 10 - 15 分钟内吸收它。

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Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments Ficoll-Paque 高级版 GE 医疗 编号:17-5442-02 OptiPrep 准备 StemCell 技术 7820 元 CD45 微珠 米尔特尼 130-052-301 号 EasySep 单核细胞分离试剂盒 StemCell 技术 19861 年 胶原酶 IV 西格马 C9697-50毫克 检测每批产品的内毒素 DNase I 西格马 DN25-10MG系列 哈巴斯 赛默飞世尔 14025092 胎牛血清 （FBS） 赛默飞世尔 16140071 检测每批产品的内毒素 PE-CD11c 生物传奇 117307 APC-CD11b 生物传奇 101211 璀璨紫 650 MHCII 生物传奇 107641 AF48-CD86型 生物传奇 105017 APC/Cy7-Ly-C6 生物传奇 108423 PE/Cy7-CD15 生物传奇 135523

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