一种用于将人类神经前体细胞共培养诱导分化为神经元的技术

摘要

来源：Su, C. T. E.，等 一种评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种将人类神经前体细胞（NPCs）分化为神经元的方法。将NPCs接种至已建立的小鼠星形胶质细胞-大鼠皮层神经元共培养体系中，以促进NPCs向神经元分化。通过共聚焦显微镜观察细胞形态，验证分化效果。

方案

1. 诱导性多能干细胞的制备

1. 在6孔板中，使用添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养人成纤维细胞。
2. 在开始重编程成纤维细胞之前，用Matrigel包被6孔板，并在室温下孵育至少1小时。当细胞融合度达到80%时，吸除成纤维细胞培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
3. 加入足量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖整个孔板，于37 °C孵育10分钟。
4. 待细胞从孔壁脱落之后，加入相当于胰蛋白酶体积两倍的含10% FBS的DMEM以终止消化反应。轻柔吹打细胞悬液，使细胞充分分散。使用血细胞计数板对单细胞数量进行计数。
5. 将7 × 10⁵个细胞转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
6. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于电穿孔溶液中。按照制造商说明书对成纤维细胞进行电穿孔。将细胞重悬于100 µl电穿孔缓冲液中，加入每种附加体质粒1 µg。设置电穿孔参数为1,650 V、10 ms、3次脉冲。
7. 将细胞悬液转移至添加10% FBS的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，每孔接种5 × 10⁴个细胞至6孔板。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
8. 转染48小时后，吸除成纤维细胞培养基，更换为mTeSR培养基。此后每日更换培养基，直至诱导性多能干细胞（iPSC）克隆可进行分离。iPSC克隆通常在28–35天后可见。
9. 当克隆适合分离时，通过机械切割法分离一个iPSC克隆，并将其重新接种至含10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）的mTeSR培养基中，接种于Matrigel包被的6孔板。每日更换培养基。

2. 人类神经前体细胞的神经诱导与维持

1. 当iPSC培养物汇合度约为20%时，移除mTeSR培养基，并更换为神经诱导培养基。每隔两天补充一次培养基。
2. 7天后，移除神经诱导培养基，并更换为人NPC维持培养基。在传代培养前，每隔两天补充一次培养基，持续最多7天。
3. 在传代培养前，用Matrigel在室温下包被培养板/瓶，至少孵育1小时。
4. 从汇合的人NPC培养物中移除培养基，用1×PBS洗涤一次，然后吸除PBS。
5. 加入足量的细胞解离溶液以覆盖所有孔，于37 °C孵育5分钟。
6. 确保所有细胞均已解离。向孔/瓶中加入相当于细胞解离溶液体积两倍的DMEM/F-12（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）。
7. 将含有细胞的DMEM/F-12转移至15 ml离心管中，以200 × g离心5分钟。
8. 移除上清液，将细胞重悬于5 ml人NPC维持培养基中。轻轻吹打细胞悬液，使细胞充分分散。
9. 将总细胞数的三分之一接种至Matrigel包被的培养孔/瓶中，并加入足量补充了10 µM Y-27632的培养基。将培养容器置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   1. 每3至4天以1:3比例传代一次，每隔一天补充培养基。保持人NPC培养物的高密度，以防止分化。

3. 人NPCs在共培养体系中向神经元的分化

1. 在人NPC向神经元分化之前，将其与慢病毒载体Synapsin1-tdTomato共孵育。在人NPC分化前一日，预先制备星形胶质细胞/皮层神经元共培养体系。
2. 用1×PBS洗涤人NPC培养物一次，加入足量细胞解离液覆盖所有孔/培养瓶，于37 °C孵育5分钟。
3. 确保所有细胞均已脱落。向孔/培养瓶中加入相当于解离液体积两倍的DMEM/F-12培养基，转移至15 ml离心管中，以200 × g离心5分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于5 ml神经元分化培养基中。轻轻吹打细胞悬液，使细胞团块分散为单细胞。使用血细胞计数板计数单细胞数量。
5. 小心吸除星形胶质细胞/皮层神经元培养物中的培养基。以5 × 10³ 个细胞/cm² 的密度，将人NPC接种至每孔24孔板中，每孔加入500 µl含10 µM Y-27632的神经元分化培养基。轻柔地将含人NPC的培养基加入各孔，避免扰动星形胶质细胞和皮层神经元。
6. 将培养板置于37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。每两至三天更换一半新鲜培养基，持续至少28天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Epi5 附加体质粒诱导多能干细胞重编程试剂盒	Invitrogen	A15960
DMEM/F12 培养基	Lonza	12719F
Matrigel	BD Biosciences	354277
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103049
BSA	Sigma	A7906
PBS	Thermo Scientific	SH30028.02
15 ml 离心管	BD Biosciences	352096
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056
50 ml 离心管	BD Biosciences	352070
24 孔板	Corning	9761146
6 孔板	Corning	720083
T25 培养瓶	Corning	430641
Neon 转染系统	Invitrogen	MPK5000	用于人成纤维细胞的电穿孔
正常人皮肤成纤维细胞	PromoCell	C12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE	Addgene	20945