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1. 心脏摘除与兰格多夫灌注
体重35-40 kg的绵羊使用4-6 mg/kg的丙泊酚和60-100 mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉。通过开胸术取出心脏，并将其连接至Langendorff灌流系统，以恒定流速240-270 ml/min灌注含氧（95% O2，5% CO2）的Tyrode's溶液，灌流液pH为7.4，温度维持在35.5-37.5 °C。Tyrode's溶液的成分（单位为mM）为：NaCl 130，KCl 4.0，MgCl2 1，CaCl2 1.8，NaHCO3 24，NaH2PO4 1.2，葡萄糖5.6，白蛋白0.04 g/L。使用10 μM的Blebbistatin（Enzo Life Science International, INC. Plymouth Meeting, PA, USA）以降低心肌收缩力。
2. 拉伸诱导的离体灌注绵羊心脏心房颤动
采用离体冠状动脉灌注心脏模型，通过房间隔穿刺使两个心房内的腔内压力相等。随后封闭所有静脉开口，仅保留下腔静脉，将其插管并连接至数字传感器（Biopac Systems 转换器-TSD104A；Biopac Systems, Inc.，Goleta, CA, USA）以及一根流出道插管，流出道插管的开口高度位于心房上方，用于调控心房内压力。将压力升高至 12 cm H2O，可使心房容积较 6 cm H2O 时增加约 30%。实验全程保持压力稳定。在封闭静脉前，将四极电极导管（Torq，Medtronic Inc./Minneapolis/MN/USA）置入各肺静脉内，利用 Biopac Systems 放大器（DA100C；Biopac Systems, Inc.，Goleta, CA, USA）记录两个远端电极的双极信号（采样率 1.0 kHz）。另外两个自制的双极电极分别置于左心耳顶部和右心耳顶端。
3. 光学图谱实验装置设置
- 左心耳的心外膜标测。需要注射 5 至 10 ml 的 Di-4-ANEPPS（10 mg/mL）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA），并给予 10 分钟的负载期，以便在 532 nm 激光激发心外膜表面时获得电压敏感性荧光信号。发射的荧光通过 600 nm 长通滤光片，投射到 LittleJoe CCD 视频相机（80×80 像素，SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, USA）上，以每秒 800 帧的速率进行采集（见图 1A 的示意图）。在心房颤动期间，每隔 2 分钟获取一段持续 5 秒的视频。所标测的心外膜表面区域约为 14 cm2。
- 完整心脏状态下肺左心耳（PLA）的心内膜光学标测。第二个 LittleJoe CCD 相机（80×80 像素）与心外膜相机同步。将一个直径为 10 mm、双通道的刚性内窥镜（Everest VIT, Inc. Flanders, NJ, USA），其视场角为 90 度，经左心室前壁穿过二尖瓣，对准 PLA 的心内膜表面。在 PLA 上光学标测的区域约为 4 cm2，可清晰显示四条肺静脉及心房隔肺束（图 1A、B）。内窥镜通过定制的目镜适配器与 CCD 相机连接。532 nm 激光光通过液体导光管（芯径 0.2 英寸）导入内窥镜的激发通道。
4. 心房颤动实验方案
在持续心房牵张条件下，通过位于左心耳（LAA）上方的起搏电极进行爆发性起搏（12 Hz，5 ms 脉冲，2倍舒张期阈值）诱发心房颤动（AF）。心房颤动持续50分钟，在此期间每2分钟采集一次5秒的光学电影。双极记录持续进行。光学电影的采集同时触发双极记录中5秒时段数据的同步采集。
5. 频率分析
频率分析可识别心房颤动期间激活率较高的区域，以及左心房与右心房之间的频率梯度。通过对每个像素记录的时间序列荧光信号进行快速傅里叶变换（FFT）算法处理，可从每段光学影像生成优势频率（DF）图谱7。同样，对与光学影像同步的5秒双极信号（高通滤波设为3 Hz，低通滤波设为35 Hz）也进行FFT处理。
6. 心房颤动动力学
- 相图的生成。房颤动力学分析利用通过希尔伯特变换生成的相位电影。14 简而言之，通过变换原始时间序列信号，使每个频谱分量相应地移动其四分之一个周期，从而确定每个像素点记录的动作电位的瞬时相位。15 随后，通过变换后信号与原始信号之比的反正切值获得信号的瞬时相位。相位角以-π到π弧度之间的数值表示，并以连续的颜色方案呈现以构建相图，其中连续的空间相位变化反映了兴奋、复极化和恢复的过程。14
- 激活模式的表征。可利用相位电影识别多种类型的激活模式（图2），包括以下几类：
- 旋转波（rotor）通过所有相位汇聚于一个持续超过一个旋转周期的奇点来识别（图2A）。
- 局灶激动（breakthrough）定义为在视野中出现并以类似靶心的模式向外传播的波阵面（图2B）。
- 时空有序的周期性波定义为从视野中同一位置连续出现至少四个周期性波，且具有相似传播方向和波间间隔（图2C）。
进一步的定量分析可实现最高频率区域与从该特定区域获得的最常见激活模式之间的空间相关性。后者凸显了绘制左心房内膜表面图谱的关键作用，因为在急性心房颤动期间，最高频率区域通常位于该部位。
7. 代表性结果：
在急性牵张诱发的心房颤动（AF）期间，存在从后左房（PLA）到左心耳（LAA）和右心耳（RAA）的主导频率（DF）梯度。最高DF区域定位于某一支肺静脉附近或PLA内的某处。11 图3展示了一次代表性的心房颤动发作，其中最高DF位于PLA（右下肺静脉）。研究结果支持PLA内存在驱动心房颤动的高频激动源，这与阵发性人类心房颤动消融手术中观察到的从左至右的DF梯度一致。16
利用相位图电影对激活模式进行量化显示，旋动（rotor）数量最多的位置位于左肺左房（PLA）以及PLA与左心耳（LAA）交界处8。偶尔可识别出持续时间较长的旋动，其旋转中心（奇点）与最高频域位置重合10。由于心房组织具有三维结构特征，在PLA的标测心内膜表面发现旋动提示这些旋动的旋转中心（即旋动丝，filament）最终可能垂直于标测区域的表面。图4展示了从PLA心内膜记录到的一个此类旋动，同时伴有向LAA方向传播的纤维性传导，这与PLA和LAA之间的频率梯度一致（分别为9 Hz和6.4 Hz）。PLA处的旋动数量始终多于LAA，提示在此模型中，PLA上的折返在维持心律失常中起着关键作用。
总体而言，实验结果支持以下理论：左心房中稳定且快速的旋转子可能驱动急性牵张诱导的心房颤动，而由此产生的电波在向右心房传播过程中会经历复杂且空间分布的传导阻滞模式，表现为纤维性传导，并伴随主导频率进行性降低。
图1. 实验装置的示意图。A：通过左心室前壁和二尖瓣口插入一根刚性内窥镜，并对准左心房后壁（PLA）的心内膜表面。CCD相机与内窥镜耦合，激光通过连接至内窥镜下部的液体导光管提供照明。心外膜标测在左心耳（LAA）上进行。双极电极置于右心房和左心房顶部。额外的双极信号来自肺静脉。B：为便于说明，打开左心房侧壁后的侧视图。内窥镜尖端照亮PLA的心内膜表面。一个双极电极位于左心房顶部。LAA：左心耳。LV：左心室。RA：右心房。RV：右心室。
图2. 在生成相位视频后识别出的不同激活模式。A：左心耳（LAA）的连续快照显示旋子围绕其旋转中心（奇点）转动。从左至右完成一次完整旋转。B：LAA上一种典型的突破性激活模式。波阵面出现在视野的右上角，并向外传播。C：从后左房（PLA）区域向LAA方向传播的四个时空有序的周期性波（分别在0、182、352和512 ms时刻）。等时线以10 ms间隔绘制。底部为动作电位不同相位的图例，采用颜色编码。
图3. 在离体绵羊心脏Langendorff灌注模型中，识别急性牵张诱发心房颤动期间活动频率最高的区域。A：左心耳（LAA）、右心耳（RAA）及左心房后壁（PLA）的解剖视图。PLA图像为经内窥镜获取的标测区域视图，显示四个肺静脉（PVs）。B：通过光学标测获得的LAA和PLA区域的主导频率（DF）图谱；RAA区域的频率值来自双极心内电图。最高频率区域位于PLA。C：代表性功率谱图，其中右肺静脉PLA区域的主导频率最大值为12.4 Hz。LSPV：左上肺静脉。LIPV：左下肺静脉。RSPV：右上肺静脉。RIPV：右下肺静脉。引自参考文献11（David Filgueiras Rama） & José Jalife。心房颤动的潜在机制。在 临床电生理学家的基础科学，第3卷（主编：Charles Antzelevitch）141-156（SAUNDERS，2011）。
图 4. 来自左心房后壁（PLA）和左心耳（LAA）的同时相位图（A，B）与主导频率图（C）。A：来自PLA的连续快照，显示一个旋子及其奇点的漂移。B：来自LAA的同时相位快照。激活模式显示出与颤动性传导一致的传播波。在颤动性传导区域，奇点也与波破裂位置相对应。（另见视频4）C：来自PLA和LAA的同时主导频率图。最快区域位于PLA（9 Hz），这与相位图分析中旋子的存在相对应。LAA的最高频率为6 Hz，与颤动性传导相关。在C图右侧，显示了来自PLA和LAA的单像素光学激活信号。