本报告详细描述了在拉伸诱导心房颤动期间，对离体羊心左心房进行Langendorff灌注状态下同步心内膜和心外膜电兴奋光学标测的方法学与结果。
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摘要
摘要
心房颤动（AF）是一种复杂的心律失常，具有较高的发病率和死亡率。1,2 它是临床实践中最常见的持续性心律紊乱，预计在未来几年其患病率将进一步上升。3 长期以来已认识到心房内压力升高和扩张可导致AF的发生，1,4 这突显了使用动物模型和牵张刺激研究AF动态的重要性。理解AF的机制需要以高空间和时间分辨率对心脏电活动波进行可视化观察。虽然传统用于人类电生理研究的常规电标测技术可实现高时间分辨率，但因同时使用的房内电极数量有限，空间分辨率受到限制，无法对心律失常期间的电波进行详细追踪。20世纪90年代初引入的光学标测技术，实现了在动物模型中对颤动活动的大视野、亚毫米级空间分辨率的表征，5,6 并由此识别出快速旋转的电活动波（即“旋波”，rotors），这些旋波是心室或心房内颤动活动的起源。7-9 通过对光学标测数据进行时域和频域联合分析，可以揭示AF期间存在离散的高频周期性活动位点，以及左右心房之间的频率梯度。其中旋波频率最高的区域以最高频率激活，并驱动整体心律失常。10,11 这些旋波发出的电波在传播过程中与功能性或解剖性障碍物相互作用，从而产生颤动性传导现象。12 对左心房后壁（PLA）内膜面进行标测，有助于追踪AF波动力学中旋波频率最高的关键区域。尤为重要的是，PLA正是临床上通过腔内导管消融治疗终止AF最有效的部位，13 这进一步强调了从左心房内部研究AF动力学的相关性。本文介绍一种急性牵张诱导AF的绵羊模型，该模型在某些特征上类似于人类阵发性AF。该方法结合左心房的外膜标测，并利用连接于CCD相机的双通道刚性硬质内窥镜对PLA进行内膜光学标测，从而以最直接的方式观察对AF维持最为关键区域的电活动激活模式。
方案
1. 心脏摘除与兰格多夫灌注
体重35-40 kg的绵羊使用4-6 mg/kg的丙泊酚和60-100 mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉。通过开胸术取出心脏，并连接至Langendorff灌注系统，以240-270 ml/min的恒定流速灌注含氧Tyrode's溶液（95% O2, 5% CO2），pH值为7.4，温度为35.5-37.5 °CTyrode 溶液成分（单位：mM）为：NaCl 130，KCl 4.0，MgCl₂ 1，CaCl₂ 1.8，NaHCO₃ 24，NaH₂PO₄ 1.2，葡萄糖 5.6，白蛋白 0.04 g/L。Blebbistatin 10 μM （美国宾夕法尼亚州普利茅斯会议Enzo Life Science International, INC.）用于降低收缩力。
2. 离体灌注绵羊心脏中牵张诱导的心房颤动
采用离体冠状动脉灌注心脏模型，通过房间隔穿刺使两个心房内的腔内压力相等。除下腔静脉外，其余所有静脉开口均予以封闭；下腔静脉则插入导管，并连接至数字传感器（Biopac Systems 转换器-TSD104A；Biopac Systems, Inc.，Goleta，CA，美国）以及一根流出导管，流出导管末端的高度位于心房上方，用于调控心房内压力。随后将压力升高至 12 cm H2O，相对于 6 cm H2O 时的心房容积，此时心房容积增加约 30%。整个实验过程中保持压力稳定。在封闭静脉之前，将四极电极导管（Torq，美敦力公司/明尼阿波利斯/明尼苏达州/美国）置入各肺静脉内，利用 Biopac Systems 放大器（DA100C；Biopac Systems, Inc.，Goleta，CA，美国）记录两个远端电极的双极信号（采样率 1.0 kHz）。另外两个自制的双极电极分别放置于左心耳顶部和右心耳顶端。
3. 光学图谱实验装置
- 左心耳的心外膜标测。需要注射 5 至 10 ml 的 Di-4-ANEPPS（10 mg/mL）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA），并给予 10 分钟的负载期，以便在 532 nm 激光激发心外膜表面时获得电压敏感性荧光信号。发射的荧光信号通过 600 nm 长通滤光片，投射到 LittleJoe CCD 视频相机（80×80 像素，SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, USA）上，以每秒 800 帧的速率进行采集（见图 1A 的示意图）。在房颤（AF）期间，每隔 2 分钟获取一段持续 5 秒的视频。所标测的心外膜表面面积约为 14 cm2。
- 完整心脏中 PLA 的心内膜光学标测。第二个 LittleJoe CCD 相机（80×80 像素）与心外膜相机同步。将一个直径为 10 mm、双通道的刚性内窥镜（Everest VIT, Inc. Flanders, NJ, USA），其视场角为 90 度，经左心室前壁穿过二尖瓣，对准 PLA 的心内膜表面。在 PLA 上光学标测的区域约为 4 cm2，可清晰显示四支肺静脉及心房隔肺束（图 1A、B）。通过定制的目镜适配器将内窥镜与 CCD 相机进行 C 型接口连接。532 nm 激光光通过液体导光管（芯径 0.2 英寸）导入内窥镜的激发通道。
4. 心房颤动实验方案
通过位于左心耳（LAA）上方的起搏电极进行爆发性起搏（12 Hz，5 ms 脉冲，2 倍舒张期阈值），在持续心房牵张条件下诱发心房颤动（AF）。允许 AF 持续 50 分钟，并以每 2 分钟间隔采集 5 秒的光学电影。双极记录连续采集。光学电影的采集同时触发双极记录中 5 秒片段的同步采集。
5. 频率分析
频率分析可识别心房颤动期间激活频率较高的区域，并揭示左心房与右心房之间的频率梯度。通过对每个像素记录的荧光信号时间序列应用快速傅里叶变换算法（FFT），可从每段光学影像生成优势频率（DF）图谱7。FFT 同样应用于与光学影像同步的 5 秒双极信号（高通滤波设为 3 Hz，低通滤波设为 35 Hz）。
6. 心房颤动动力学
- 相图的生成。房颤动力学的分析利用通过希尔伯特变换生成的相位电影。14 简而言之，通过变换原始时间序列信号，使每个频谱分量均移动其对应的四分之一周期，从而确定每个像素点记录的动作电位的瞬时相位。15 随后，从变换后信号与原始信号比值的反正切函数中获得信号的瞬时相位。相位角以-π到π弧度之间的数值表示，并采用连续的颜色方案构建相图，其中连续的空间相位变化反映了兴奋、复极化和恢复的过程。14
- 激活模式的表征。可利用相位电影识别多种类型的激活模式（图2），包括以下几类：
- 旋涡（rotor）通过所有相位汇聚于一个持续超过一次旋转的奇点来识别（图2A）。
- 突破波（breakthrough）定义为在视野中出现并以靶样模式向外传播的波前（图2B）。
- 时空有序的周期性波定义为在同一位置连续出现至少四个具有相似传播方向和波间间隔的周期性波（图2C）。
进一步的定量分析可实现最高频率区域与从该特定区域获得的最常见激活模式之间的空间关联。后者突显了绘制左心房内膜表面图谱的关键作用，因为在急性房颤期间，最高频率区域通常位于该部位。
7. 代表性结果：
在急性牵张诱导的房颤期间，存在从左心房后壁（PLA）到左心耳（LAA）和右心耳（RAA）的优势频率（DF）梯度。最高DF区域位于肺静脉口部或其附近，或位于PLA的某处11。图3展示了一次典型的房颤发作，其中最高DF定位于PLA（右下肺静脉）。研究结果支持PLA内存在驱动房颤的高频激动源，这与阵发性人类房颤消融手术中观察到的从左至右的DF梯度一致16
利用相位图电影对激活模式进行定量分析显示，旋动子（rotor）数量在左肺左房（PLA）以及PLA与左心耳（LAA）交界处最多。8 偶尔可识别出持续时间较长的旋动子，其旋转中心（奇点）位于最高频率区域。10 由于心房组织具有三维结构，因此在PLA的标测心内膜表面发现旋动子，提示这些旋动子的旋转中心（丝状结构，filament）最终垂直于标测区域的表面。图4展示了从PLA心内膜记录到的一个旋动子，同时伴有向LAA方向传播的纤维性传导，这与PLA和LAA之间的频率梯度（分别为9 Hz和6.4 Hz）相一致。PLA处的旋动子数量始终多于LAA，表明PLA上的折返在维持本模型心律失常中具有关键作用。
总体而言，研究结果支持以下理论：左心房内稳定且快速的旋转子可能驱动急性牵张诱导的心房颤动，而由此产生的离心波在向右心房传播过程中会经历复杂且空间分布不均的传导阻滞模式，表现为纤维性传导，并伴随主导频率逐步降低。
图1. 实验装置的示意图。A：通过左心室前壁和二尖瓣口插入一根刚性内窥镜，并将其对准左心房后壁（PLA）的心内膜表面。CCD相机与内窥镜耦合，激光照明通过连接至内窥镜下部的激光液导提供。心外膜标测在左心耳（LAA）上进行。双极电极置于右心房和左心房顶部。额外的双极信号来自肺静脉。B：为说明目的，打开左心房侧壁后的侧视图。内窥镜尖端照亮PLA的心内膜表面。一个双极电极位于左心房顶部。LAA：左心耳。LV：左心室。RA：右心房。RV：右心室。
图 2. 生成相位电影后识别出的不同激活模式。A：左心耳（LAA）的连续快照显示旋子围绕其旋转中心（奇点）转动。从左至右，完成一次完整旋转。B：LAA 上的一种突破性激活模式示例。波从前视野的右上角出现，并向外传播。C：四个在时空上有序的周期性波（分别在 0、182、352 和 512 ms）从后左房（PLA）区域向 LAA 传播。等时线以 10 ms 间隔绘制。底部为动作电位不同相位的图例，采用颜色编码。
图3. 在Langendorff灌注的离体绵羊心脏中，识别急性牵张诱导心房颤动期间活动频率最高的区域。A：左心耳（LAA）、右心耳（RAA）和左心房后壁（PLA）的解剖视图。PLA图像为包含四个肺静脉（PVs）的标测区域的内窥镜视图。B：通过光学标测在LAA和PLA上获得的优势频率（DF）图。RAA的频率值来自双极心内电图。最高频率区域位于PLA。C：代表性功率谱图，其中PLA区域右侧肺静脉处的最大DF为12.4 Hz。LSPV：左上肺静脉。LIPV：左下肺静脉。RSPV：右上肺静脉。RIPV：右下肺静脉。引自参考文献11（David Filgueiras Rama） & José Jalife。心房颤动的潜在机制。在 临床电生理学家的基础科学，第3卷（Charles Antzelevitch 编），141-156页（SAUNDERS，2011年）。
图4. 来自左心房后壁（PLA）和左心耳（LAA）的同步相位图（A，B）与优势频率图（C）。A：来自PLA的连续快照，显示一个旋转子及其奇点的漂移。B：来自LAA的同步相位快照。激活模式显示出与纤维性传导一致的传播波。在纤维性传导区域，奇点也与波破裂现象相对应。（另见视频4）C：PLA与LAA的同步优势频率图。最快区域位于PLA（9 Hz），这与相位图分析中旋转子的存在相对应。LAA的最高频率为6 Hz，与纤维性传导相对应。在C图右侧，显示了来自PLA和LAA的单像素光学激活信号。
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讨论
在离体绵羊心脏中，急性牵张诱发的心房颤动（AF）具有一些与人类阵发性心房颤动相似的特性。绵羊心脏心房内压力的急性升高可使心房颤动长时间维持，类似于在心房扩张患者中观察到的较高心房颤动风险1。绵羊心房中存在从左到右的优势频率（DF）梯度，这一点也与人类电生理研究中记录的结果相似16。因此，理解该急性模型中维持心房颤动的机制，可能有助于改进目前用于人类阵发性心房颤动的治疗策略。当前方法的一些局限性包括：首先，在离体心脏中难以重现自主神经系统对颤动的影响，这限制了将结果外推至in vivo（体内）情况；其次，该模型聚焦于急性牵张诱发的心房颤动，因此其结论不应推广至已发生结构重构的心脏，在后者中，纤维化以及电学特性的改变可能会影响左肺动脉（PLA）和左心耳（LAA）的激活模式。最后需要指出的是，由于光学成像技术的限制，以及电压敏感性染料和运动解耦合化合物的毒性，目前在活体受试者中尚无法实现光学标测技术。
尽管如此，采用光学标测技术，特别是本方案中展示的左心房心内膜标测，通过识别最高数量的转子并定位至频率最快的区域，加深了我们对心...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
部分由美国国立心肺血液研究所（NHLBI）基金 P01-HL039707 和 P01-HL087226 以及 Leducq 基金会（J.J. 和 O.B.）、西班牙心脏病学会奖学金、Fundación Pedro Barrié de la Maza 和 Fundación Alfonso Martín Escudero（D.F.R.）、法国心脏病学会（Fédération Française de Cardiologie）（R.P.M.）、心律学会奖学金、日本心脏基金会/日本心电学会（The Fellowship of Japan Heart Foundation/The Japanese Society of Electrocardiology）（M.Y.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| 丙泊酚 | Abbott Laboratories | 5206-04-03 | |
| 戊巴比妥 | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | |
| 18 号导引器 | Terumo Medical Corp. | SS*FF1832 | |
| 带气囊气管插管（9 mm） | DRE Veterinary | #9440 | |
| 光纤喉镜套件 | DRE Veterinary | #991 | |
| 光纤镜片 | DRE Veterinary | #984 | |
| 手术剪刀 | DRE Veterinary | #9702#1944 | |
| 手术刀柄 #3 实心 4" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| 无菌手术刀片 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9801-10 | |
| 通气袋 | Westmed | 562013 | |
| 西姆斯剪刀 弯头 锐/钝 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 | |
| 组织镊（×2） | DRE Veterinary | #1895 | |
| KANTROWITZ 胸部镊，11" | Biomedical Research Instruments | 34-1980 | |
| Finochietto 大型胸廓牵开器 | Kapp Surgical Instrument Inc. | KS-7301 | |
| 开胸剪 | Rostfrei Solingen | ||
| 塑料托盘 | Nalge Nunc international | Fischer | |
| Bonn 剪刀（×2） | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5840SC | |
| 外科缝合丝线 | Fisher Scientific | 50-900-04214 | |
| 显微解剖镊 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | |
| 四极电极导管（Torq）（×4） | Medtronic Inc. | 05580SP | |
| 数字传感器，Biopac Systems 换能器 | Biopac Systems, Inc. | RX104A | |
| Biopac Systems 放大器 | Biopac Systems, Inc. | DA-100C | |
| Di-4-ANEPPS | Sigma-Aldrich | D8604-5mg | |
| Blebbistatin | Enzo Life Sciences | BML-E1315-0025 | |
| LittleJ– CCD 视频摄像机（×2） | SciMeasure Analytical Systems, Inc. | ||
| 双通道刚性内窥镜 | Everest VIT, Inc. | R10-25-0-90 | |
| 灌注泵（×2） | Cole-Parmer | GK-77920-30 | |
| 温度探针 | Cole-Parmer | R-08491-02 | |
| pH 计 | Fisher Scientific | 01-913-806 | |
| 数字温度计 | Cole-Parmer | GK89000-10 | |
| 氧合器滤芯 | Sorin | 05318 | |
| 硅胶灌注管（L/S 15） | Masterflex (Cole Palmer) | 96410-15 | |
| 激光导光束（×6） | Oriel Corp. | 77536 | |
| 液体导光管（芯径 0.2 英寸） | Newport Corp. | 77556 | |
| 激光发生器（1 瓦）（×1） | Shanghai Dream Lsaer Tecchnology | SDL-532-1000T | |
| 激光发生器（5 瓦）（×1） | Newport Corp. | MILL 5sJ |
参考文献
- Kannel, W. B., Wolf, P. A., Benjamin, E. J., Levy, D. Prevalence, incidence, prognosis, and predisposing conditions for atrial fibrillation: population-based estimates. Am J Cardiol. 82, (1998).
- Wolf, P. A., Abbott, R. D., Kannel, W. B. Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke: the Framingham Study. Stroke. 22, 983-988 (1991).
- Miyasaka, Y. Secular trends in incidence of atrial fibrillation in Olmsted County, Minnesota, 1980 to 2000, and implications on the projections for future prevalence. Circulation. 114, 119-125 (1980).
- Ravelli, F., Allessie, M. Effects of atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart. Circulation. 96, 1686-1695 (1997).
- Gray, R. A., Pertsov, A. M., Jalife, J. Spatial and temporal organization during cardiac fibrillation. Nature. 392, 75-78 (1998).
- Gray, R. A. Mechanisms of cardiac fibrillation. Science. 270, 1222-1225 (1995).
- Samie, F. H. Rectification of the background potassium current: a determinant of rotor dynamics in ventricular fibrillation. Circ Res. 89, 1216-1223 (2001).
- Kalifa, J. Intra-atrial pressure increases rate and organization of waves emanating from the superior pulmonary veins during atrial fibrillation. Circulation. 108, 668-671 (2003).
- Mandapati, R., Skanes, A., Chen, J., Berenfeld, O., Jalife, J. Stable microreentrant sources as a mechanism of atrial fibrillation in the isolated sheep heart. Circulation. 101, 194-199 (2000).
- Yamazaki, M. Mechanisms of stretch-induced atrial fibrillation in the presence and the absence of adrenocholinergic stimulation: interplay between rotors and focal discharges. Heart Rhythm. 6, 1009-1017 (2009).
- Rama, D. F., Jalife, J. Mechanisms Underlying Atrial Fibrillation. Basic Science for Clinical Electrophysiologist. Antzelevitch, C. 3, SAUNDERS. 141-156 (2011).
- Berenfeld, O., Zaitsev, A. V., Mironov, S. F., Pertsov, A. M., Jalife, J. Frequency-dependent breakdown of wave propagation into fibrillatory conduction across the pectinate muscle network in the isolated sheep right atrium. Circ Res. 90, 1173-1180 (2002).
- Haissaguerre, M. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. N Engl J Med. 339, 659-666 (1998).
- Warren, M. Blockade of the inward rectifying potassium current terminates ventricular fibrillation in the guinea pig heart. J Cardiovasc Electrophysiol. 14, 621-631 (2003).
- Claerbout, J. F. Fundamentals of Geophysical Data Processing. , McGraw-Hill. New York. (1976).
- Atienza, F. Real-time dominant frequency mapping and ablation of dominant frequency sites in atrial fibrillation with left-to-right frequency gradients predicts long-term maintenance of sinus rhythm. Heart Rhythm. 6, 33-40 (2009).
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