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用于恢复颅脑放疗所致认知功能障碍的干细胞移植策略

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DOI：

10.3791/3107

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2011年10月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of California Irvine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

脑肿瘤患者通常需要接受颅脑放射治疗，这种治疗虽然有益，但常常导致严重的认知功能障碍。这一尚未解决的严重问题目前在临床上尚无应对措施，因此推动了我们致力于开发基于干细胞的疗法，以恢复放射治疗引起认知功能下降。

摘要

对于患有原发性或转移性脑肿瘤的患者，放射治疗往往是唯一的临床治疗手段。尽管放疗具有一定的疗效，但颅脑照射可能引发进行性且严重的认知功能下降，部分原因可能是神经干细胞的耗竭所致。随着脑癌患者生存期的延长，认知健康相关的生活质量日益受到关注，尤其是在目前尚无令人满意的长期治疗方法的情况下。

为应对这一严重的健康问题，我们采用干细胞替代策略来对抗辐射引起的认知功能下降。本模型使用经颅脑照射的无胸腺裸鼠。电离辐射可通过全脑照射或高度聚焦的束流定向照射海马体的方式递送。 lin耳 a基于直线加速器（LINAC）的立体定向放射外科治疗。照射后两天，将人神经干细胞（hNSCs）通过立体定向移植至海马体。随后在照射后1个月和4个月评估大鼠认知功能的变化、移植物细胞的存活情况以及分化特异性标志物的表达。我们的认知测试范式显示，移植了hNSCs的动物在认知功能方面表现出显著改善。无偏倚体视学分析显示，移植物细胞在移植后1个月和4个月时具有显著的存活率（10–40%），具体比例取决于移植细胞的数量和类型。移植物细胞广泛迁移，沿胶质细胞和神经元谱系分化，并表达多种未成熟和成熟表型标志物。

我们的数据表明，移植的人类干细胞可直接带来认知功能的益处，提示该操作未来可能为接受颅脑放射治疗个体的认知功能长期恢复提供一种有前景的策略。为了促进复制和拓展本研究所需关键操作步骤的传播，我们以书面和可视化形式记录了实验方案中的多个关键步骤，重点聚焦于立体定向放射外科和细胞移植过程。

方案

我们的实验方案如图1所示。

1. 用于移植的人类神经干细胞（NSCs）的培养与制备

  1. 本研究使用了 EnStem-A 细胞系（EMD Millipore）。神经干细胞（NSCs）由生产商常规验证，具有高水平表达多能性标志物 nestin 和 Sox2，低水平表达多能性标志物 Oct-4，并具备分化为多种神经表型的能力以及在多次传代后维持正常核型的特性。在我们的培养条件下，这些神经干细胞表现出 Sox2 和 nestin 的高表达，并保留了分化能力，如先前所述1。神经干细胞培养于经多聚-L-鸟氨酸（20 μg/ml）和层粘连蛋白（5 μg/ml）包被的组织培养处理过的培养瓶中。细胞在神经扩增培养基（Millipore）中培养，添加 L-谷氨酰胺（2 mM）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；20 ng/ml）。贴壁的单层神经干细胞每隔一天（1:2）使用 accutase 作为解离试剂进行传代1。用于移植研究的神经干细胞均在第10代以内使用。
  2. 通过在移植前3天向生长培养基中添加 4 μM BrdU，对神经干细胞进行 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记。为验证 BrdU 标记指数（即 BrdU 阳性细胞的百分比），将细胞接种于腔室载玻片上，并采用标准免疫细胞化学方法检测 BrdU。用于移植的细胞通常显示标记指数超过 90%2。此外，移植的人源干细胞也可通过人特异性核抗原标志物（HuNu）进行检测2。
  3. 移植当天，将 accutase 和神经扩增培养基置于 37°C 水浴中预热。细胞在孵育培养基（含 10 μM Y-27632 的神经扩增培养基）中孵育1小时。Y-27632（ROCK 抑制剂，EMD-Calbiochem）用于提高神经干细胞移植后的存活率。
  4. 孵育1小时后，移除孵育培养基，细胞用 accutase 处理5分钟。短暂处理后，加入等体积的神经扩增培养基以中和 accutase，并通过 70 μM 细胞滤网过滤细胞。
  5. 使用血细胞计数板计数细胞，并以注射培养基（含 10 μM Y-27632、40 ng/ml bFGF 和 20 ng/ml BDNF 的神经扩增培养基）将每微升调整为 1.0 × 105 个活神经干细胞。
  6. 细胞按步骤1.5所述保存于神经扩增培养基中，移植前置于冰上，且应在6小时内使用，以尽量减少因长时间冷藏导致的细胞死亡。

2. 放射治疗——治疗计划与照射

  1. 将麻醉后的无胸腺裸鼠以俯卧位放入实验室磁共振成像（MRI）扫描仪中，头部朝上（头先进）。该3特斯拉扫描仪专为小型动物扫描设计，能够提供具有高空间分辨率的横断面（轴向）图像，并呈现优异的软组织对比度。扫描聚焦于颅骨区域，生成一组22张T2 E60加权图像，层厚为0.8 mm。这些图像提供了必要的信息，用于识别大鼠脑内的左右海马结构。
  2. MRI扫描后24小时，动物再次接受麻醉（麻醉混合物：氯胺酮30 mg/kg、赛拉嗪2.5 mg/kg和乙酰丙嗪1 mg/kg），并置于放射肿瘤学用CT扫描仪中，获取另一组横断面（轴向）图像数据。大鼠被放置在与MRI扫描时相同或相近的位置，CT设备设定为扫描颅骨区域，共生成106张层厚为0.8 mm的CT图像，作为放射治疗计划的数据基础。
  3. 治疗计划
    1. 通过DICOM（医学数字成像与通信）标准，将MRI和CT图像数据传输至ECLIPSE（Varian Medical Systems, Palo Alto, CA）治疗计划软件。ECLIPSE是一种先进且商业化的放射肿瘤学软件，用于为患者建模并设计最优的放射治疗方案。该软件整合从CT图像中提取的器官密度信息，用于计算体内辐射剂量分布。
    2. 用小型手术巾覆盖动物，仅暴露头部。将耳杆插入外耳道，将动物头部牢固固定于立体定位框架（Benchmark Digital, Leica-myNeurolab）中。将耳杆尖端滑入耳道时需格外小心。通过钩住大鼠上颌门齿并调节门齿杆高度至标准参考点，放置门齿杆，然后拧紧鼻夹。
    3. 调整头部在双侧耳杆之间的位置，使其居中，侧向移动最小（±4 mm），以达到立体定位零点。
    4. 下一步是确定所采用的照射技术。调强放射治疗（IMRT）和容积调强弧形治疗（VMAT），后者以RapidArc形式实现，是两种高精度照射技术，均使用6 MV光子束进行剂量递送3-6。两种技术的区别在于：IMRT通过多个静态射束路径照射，每条路径对应不同方向，但均汇聚于靶区，更适合极小靶区；而RapidArc则通过一个或多个围绕靶区的动态弧形照射递送剂量（图4）。
    5. 无论采用何种递送方式，均需在ECLIPSE的剂量优化窗口中输入靶区剂量、靶区适形度以及关键器官的剂量限制参数。结合器官体积信息，系统通过在照射过程中持续调节射束衰减，实现个性化剂量分布。
    6. 一旦生成治疗计划，ECLIPSE会将计算所得的剂量分布叠加显示在轴向、冠状和矢状图像上（图5），并以剂量-体积直方图（DVH）形式呈现（图6）。此时需评估该计划是否适合实施，或是否需要进一步优化。
  4. 照射过程
    1. 治疗计划获批后，从ECLIPSE中的CT治疗计划数据生成数字重建放射影像（DRR）。这些正交图像以骨密度加权，突出显示颅骨及其他骨性解剖标志。随后，治疗计划和DRR通过DICOM传输至治疗递送计算机系统。
    2. 递送系统控制一台Varian Trilogy直线加速器，该设备通常用于人类放射治疗。加速器配备120片由计算机控制的薄型多叶准直器（MLC），以及集成于机载成像（OBI）系统中的诊断级X射线成像系统。该递送系统接收ECLIPSE特定信息，并重新配置加速器中的准直器参数，以执行预定剂量递送。
    3. 此时准备大鼠进行照射，将其麻醉后用纸毯覆盖以保持体温。数分钟后，将大鼠连同纸毯一起置于治疗床上，仅暴露颅骨，体位与CT扫描时一致。此步骤至关重要，因为体位准确性直接影响剂量递送的精确性。
    4. 大鼠在治疗床上正确就位后，使用Trilogy的OBI系统采集一组正交X射线图像。这些高分辨率图像随后通过OBI图像融合软件与ECLIPSE生成的DRR进行融合。
    5. 利用软件对X射线图像与DRR进行数字化匹配，获得治疗床需调整的位置偏移量，以实现图像的共配准（图7）。在审核该偏移信息并确认其不会导致加速器与治疗床发生意外碰撞后，计算机自动执行偏移指令，治疗床随之移动至目标位置。
    6. 此时开始照射。采用6野IMRT计划递送10 Gy剂量时，射束开启时间约为10分钟；而双弧RapidArc则约需3分钟。治疗结束后，将大鼠移出治疗室，在加热垫上的饲养笼中恢复。

3. 人干细胞海马内移植的立体定位手术

  1. 动物饲养与手术准备
    1. 本研究采用来自美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）的两个月大ATN大鼠（品系0N01 Cr:NIH-rnu动物被饲养在无菌笼具中，并置于温度和光照可控的屏障环境中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。大鼠可自由摄取经高压灭菌的饲料和水，并每周使用Vetropolycin眼膏（Western Medical Supply，Arcadia，CA）清洁眼睛，以预防眼部感染。
    2. 立体定向手术期间，大鼠通过腹腔注射麻醉混合液（氯胺酮 30 mg/kg、赛拉嗪 2.5 mg/kg 和乙酰丙嗪 1 mg/kg）进行麻醉。注射后 10–15 分钟可达到完全麻醉状态，通过触觉反射（脚趾夹捏）监测镇静程度。若手术过程中需要，可追加原剂量的 15–20% 以维持足够的麻醉深度。
    3. 使用电动剪毛器去除头部毛发。手术区域应剃除约200%范围的毛发，以防止毛发引起感染。切口前，先用聚维酮碘/碘伏擦拭剃毛区域3次，再用70%酒精擦拭3次，清洁手术部位。
  2. 立体定向手术
    1. 立体定位仪（数字显示器和框架）、微型电动钻、干热灭菌器及其控制器应置于超净工作台内，以防止ATN大鼠手术过程中可能发生感染。可使用配备内置加热垫的立体定位手术台以维持动物术中体温。整个手术过程中，我们使用“Kimberly-Clark Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves”无菌检查手套（每只手套独立包装于无菌袋中，货号：55093）。此外，术者在手术过程中使用70%酒精喷雾对手部进行消毒。
    2. 用小型手术巾覆盖动物，仅暴露头部。将耳杆插入外耳道，将动物头部牢固地固定在立体定位仪（Benchmark Digital, Leica-myNeurolab）中。将耳杆尖端滑入耳道时需格外小心。将上切牙钩挂在大鼠上切牙上，调整切牙杆高度至标准参考点，然后拧紧鼻夹。
    3. 将头部位置在耳杆之间居中，侧向移动最小（± 4 mm），以达到立体定位零点。
    4. 完成上述定位步骤后，涂抹润滑性眼膏以防止眼睛干燥，并避免可能的碘或酒精溅入造成损伤。手术过程中至少使用该眼膏2次。
    5. 使用无菌手术刀沿头皮正中线做皮肤切口（2 cm），并用无菌棉签清洁。避免损伤尾侧和颈部肌肉区域。
    6. 使用解剖牵开器撑开骨膜，并用蘸有1%过氧化氢（以PBS配制）的棉签清除软组织。为控制出血，使用棉签或纱布施加牢固压力至少1分钟。用力刮擦以清洁颅骨，轻拍方式处理皮肤，直至颅骨缝、前囟和人字缝清晰可见。
    7. 以颅骨缝合点（bregma）为参考，利用大鼠脑图谱确定精确的立体定位坐标7每个半脑在四个不同的位点进行干细胞移植，所用立体定位坐标如下：
      1. 前-后（AP）方向位于颅骨缝前3.0 mm，内-外（ML）方向距中线1.8 mm，背-腹（DV）方向距脑表面3.2 mm。
      2. AP，3.6 mm；ML，2.5 mm；DV，3.2 mm
      3. AP，4.2 mm；ML，3.2 mm；DV，3.2 mm
      4. AP，4.2 mm；ML，3.2 mm；DV，3.2 mm
    8. 确定前囟后，应在数字显示/控制器（数字立体定位仪）上将所有三个坐标（前后、内外侧和背腹）归零。随后，使用前述坐标，通过固定在支架上的细尖标记笔在颅骨上标记精确的移植位点。
    9. 使用脚踏控制的微型电机钻（Leica-myNeurolab）和0.35 mm钻头（1/4号牙科磨头，碳化钒钻头）在颅骨上钻孔。注意避免损伤硬脑膜。若钻孔过程中发生出血，应用棉签施加稳固压力止血。切勿在钻孔部位使用酒精或碘剂，以免引起动物刺激。
    10. 大鼠接受双侧海马内注射神经干细胞悬液，注射体积最大为 1 μL 使用一个 5 μL Hamilton 微量注射器（30 号针头）。该体积内的细胞确切数量将根据实验具体情况而有所不同。为此，将微量注射器固定于立体定位仪上的小型探针夹持器中。小心将针头尖端插入颅骨，直至到达脑表面即 脑膜）。此时，应在数字显示屏/控制器上将DV坐标归零，然后轻轻将针插入至目标深度（DV，3.2 mm）。在注射细胞前等待1分钟。
    11. 注射 0.25 μL 体积/分钟（缓慢释放），使用定时器。当累计达到 1 μL 注射后，等待8分钟，再从移植部位撤出针头。此后，缓慢撤出针头（0.5 mm/min），以防止注射内容物通过针道发生毛细管回流。
    12. 按照步骤 3.2(j-k) 对剩余的移植位点（每半球 4 个）进行操作。
    13. 移除颅骨上的皮肤牵开器，使用钝头镊子轻轻牵拉回缩的皮肤，并用 Autoclips 外科缝合器（Leica-myNeurolab）施加 4–5 个无菌不锈钢夹。
    14. 将动物从固定架上取下后，注射镇痛剂（布托啡诺，0.1 mg/kg，皮下，每12小时一次）和乳酸林格氏液（5 mL/250 g成年大鼠，皮下）。
    15. 将动物放回笼中，笼子应置于加热垫上。在动物恢复意识前持续监测，之后再将其送回饲养室。在每个动物笼内另放一个培养皿，其中放置湿润的颗粒饲料（动物饲料）和Transgel。或者，也可使用DietGel Recovery（ClearH2O，缅因州波特兰）可作为水分和养分的来源。
    16. 在动物恢复期间进行监测，并给予镇痛处理（布托啡诺 0.02 mg/kg，每12小时一次，持续2天）。观察是否存在疼痛、痛苦、手术部位发红或感染的迹象。每日涂抹聚维酮碘或新孢霉素软膏一次（持续2–3天），以预防可能的感染。若在术后12小时内，经镇痛或抗生素治疗后仍持续出现感染、疼痛或痛苦的迹象，应咨询兽医或动物护理人员以获取进一步协助。

4. 代表性结果：

裸鼠辐照示意图；神经干细胞增殖、BrdU标记、移植。
图1. 实验方案的示意图。

CT 和 MRI 脑部扫描；轴向、冠状、矢状视图；诊断成像比较。
图 2. 在 ECLIPSE 软件中融合 CT（骨性解剖结构）与 MRI（软组织）图像。通过匹配轴向、冠状和矢状切面，可实现从不同成像方式获取的大鼠脑部关键解剖特征的共配准。

显示海马体及距离的脑部横截面 MRI；带有标注的解剖图。
图 3. 脑内勾画出的海马体区域。在图像融合后，海马体以及除海马体外的脑组织被识别，并沿轴向勾画，以定义这些器官的特定体积区域。这些区域提供了调整剂量分布至目标区域所需的解剖结构和体积信息。

放射治疗计划示意图，6野调强放疗与2弧容积调强弧形放疗的剂量分布分析。
图4. 使用调强放射治疗（IMRT）或以 RapidArc 形式实现的容积调强弧形治疗（VMAT）进行高精度照射的方案。这些技术可递送 6 MV 的光子束，前者以多个静态射束路径照射并汇聚于极小靶区体积（IMRT），后者则以一个或多个动态弧形射束聚焦于靶区（RapidArc）。

放射治疗计划，海马体照射；IMRT与RapidArc，剂量分布，CT扫描示意图。
图5. ECLIPSE计算的剂量叠加于轴向图像上。所示剂量为单侧或双侧海马体照射治疗计划的剂量分布。

左、右海马体的剂量-体积直方图；辐射剂量（Gy）与体积（%）的关系。
图6. ECLIPSE 计算的剂量-体积直方图。数据对比了在图5所示的单侧海马体治疗计划下，受照与非受照海马体体积的百分比。

使用OBI X射线系统进行放射治疗设置、CT图像、冠状位和侧位X射线对比。
图7. 放射治疗中基于图像引导的大鼠体位定位。在ECLIPSE系统中，由CT治疗计划数据生成的正交数字重建放射影像（DRR）与大鼠在治疗床上通过Trilogy机载成像（OBI）系统采集的正交X射线图像进行融合。DRR图像以骨密度加权，突出显示颅骨及其他骨性解剖标志，有助于与OBI图像进行配准。通过比对这两组图像，可获得治疗床所需的位置调整参数，以实现CT图像与X射线图像的精确配准。

海马区示意图；标注区域 CA1、CA3、DG；组织学脑图谱。
图 8. 立体定向手术后移植神经干细胞（NSCs）的位置。移植后1个月，对动物进行灌注，取脑组织切片，并用BrdU染色（以检测移植的NSCs），复染苏木精。针道（Nt，红线）显示了注射轨迹，将NSCs注入移植释放位点（Tr），位于胼胝体（CC）下方、CA1上方。移植的NSCs从Tr位点广泛迁移至宿主海马体各区域（齿状回，DG；齿状回门部，DH；CA1和CA3亚区；放大倍数×4）。比例尺，200 μm。

讨论

目前有大量研究正在探索利用干细胞在临床上恢复受损、衰老及病变组织正常功能的多种途径8。要最终实现这些目标，需要深入理解移植细胞在与正常未受损组织截然不同的独特微环境中的行为特征。我们的研究已证明，在经辐照的组织床中，颅内移植的神经干细胞（NSCs）能够功能性地恢复认知能力，这些细胞可在体内存活、迁移，并沿神经元和胶质细胞谱系分化2。目前尚不完全清楚这些细胞介导认知恢复的具体机制，但其实现依赖于以可重复的方式进行一系列严格控制的实验操作。本文详细描述了这些关键实验步骤，旨在加速干细胞疗法在改善脑部及其他类型癌症临床治疗过程中所导致不良认知效应方面的转化潜力。以下还强调了可能对数据质量产生重要影响的其他注意事项。

基于移植的疗法依赖干细胞作为关键试剂，因此必须仔细表征细胞培养物、维持无菌状态，并使用匹配的传代次数以确保结果的可靠性。在手术前，移植的人源干细胞用 BrdU 进行标记，以便在体内追踪这些细胞。in vivo。在我们的实验条件下，移植的神经干细胞（NSCs）未发生广泛增殖，因此 BrdU 标记的稀释并不构成问题。此外，也可通过免疫染色检测人源特异性标志物（如核基质蛋白（h-NUC 或 hNUMA）9 或人源特异性核抗原（HuNu）2）来区分移植的人源干细胞与宿主细胞。人源干细胞还可被多种荧光标记物标记，以方便其在宿主脑组织中的识别。

关注照射参数可定义精确的剂量递送技术，本文所述方法模拟了放射肿瘤学中的现行临床实践。干细胞在脑内的可重复移植同样至关重要，这可通过数字立体定位仪器实现。该装置能够精确操控微量注射器，将干细胞植入海马体等微小脑结构中，从而显著减少人为误差。利用该装置，神经干细胞（NSCs）被移植至大鼠海马体从前到后四个不同的位点。背腹（DV）坐标基于无胸腺裸鼠（ATN）的操作经验确定，以确保手术过程不会损伤海马结构2。大鼠脑的冠状切面展示了海马结构的关键组成部分，包括齿状回（DG）、齿状回门部（DH）以及CA1和CA3亚区（图8）。从可见针道（Nt，红线）背侧注入的移植神经干细胞表现为深染（棕色）细胞，沉积于胼胝体（CC）下方的移植释放位点（Tr），随后沿整个海马的隔颞轴迁移。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS）资助 R01 NS074388 581（C.L. Limoli）、加州再生医学研究所（CIRM）资助 RS1-00413（C.L.L.）、CIRM 培训资助 TG2-0115（M.M.A.）以及 CIRM 为支持视频记录工作向 JOVE 提供的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带45°和18°耳杆的数字立体定位仪颅内移植手术装置徕卡显微系统公司39463501有用附件：带加热器的载物台和可变电流源（用于手术期间维持体温）

参考文献

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