在本视频中，我们演示如何制备和使用微加工柱阵列检测器（mPADs）来评估细胞收缩力的调节情况。
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摘要
摘要
在本视频中，我们将介绍利用微加工柱阵列测量细胞牵引力的方法。牵引力由肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用产生，在生理过程中发挥重要作用。在发育过程中，牵引力促使细胞从一个位置移动到另一个位置，以形成组织的早期结构。牵引力有助于机体的修复过程，对于伤口的正常闭合以及白细胞在体内的迁移和爬行至关重要。然而，在癌症转移或肿瘤周围血管生成的情况下，这些相同的力可能对健康造成不利影响。目前体外研究细胞最常用的方法是使用玻璃或聚苯乙烯培养皿。然而，这类基底刚性过高，无法直接测量细胞的牵引力，且可用于研究牵引力的方法相对有限。我们实验室开发了一种技术以克服这些局限。该方法基于垂直排列的柔性悬臂柱阵列，其刚度和尺寸尺度使得单个细胞可铺展于多个悬臂柱上，并在过程中使其发生偏转。我们所使用的柱体直径为3 μm，高度为10 μm，呈规则排列，柱心间距为9 μm。但这些物理参数可根据不同研究需求灵活调整。我们以硅模板为起始材料，最终的柱体由一种名为聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)，PDMS）的硅橡胶制成。通过显微镜可测量柱体的偏转程度，并据此计算产生该偏转所需的牵引力的大小和方向。我们将这类基底称为微加工柱阵列检测器（microfabricated post-array-detectors，mPADs）。接下来，我们将展示如何制备和使用mPADs来评估细胞收缩力的调控变化。
微加工柱阵列检测器，细胞牵引力，PDMS，细胞收缩力，悬臂柱，肌动蛋白-肌球蛋白，细胞迁移，伤口愈合，癌症转移，血管生成
方案
硅模板模具的制备
光刻
材料：
- 75 毫米硅晶圆
- SU-8 2 负性光刻胶（Microchem，美国马萨诸塞州波士顿）
- N2
方法：
- 将硅片在 120 °C 下脱水 2 小时。
- 对表面进行 7 分钟紫外臭氧处理，以去除有机物。
- 用氮气吹扫表面，以去除颗粒物。
- 涂覆 SU-8 2，覆盖约 70% 的表面（75 mm 硅片约需 10 ml）。
- 以 300 rpm/s 的加速度在 2000 rpm 下旋转 20 秒。
- 将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 95 °C。
- 在 95 °C 下对光刻胶进行 15 分钟前烘。
- 在 365 nm（I 线）下以 20 - 25 mJ/cm² 剂量进行泛光曝光，形成底层。
- 涂覆 SU-8 2 作为第二层光刻胶。
- 以 300 rpm/s 的加速度在 550 rpm 下旋转 20 秒，形成厚度约为 11 μm 的薄膜。
- 将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 65 °C。
- 在 65 °C 下对硅片进行 5 分钟前烘。
- 将加热板温度从 65 °C 逐步升至 95 °C。
- 在 95 °C 下对硅片进行 55 分钟前烘。
- 将硅片冷却至室温，持续 20 分钟。
- 将 mPAD 掩模对准硅片，并在 365 nm（I 线）下以 95 - 100 mJ/cm² 剂量进行曝光。
- 将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 95 °C。
- 在 95 °C 下对光刻胶进行 25 分钟曝光后烘烤。
制备
材料：
- 100毫米玻璃培养皿（5个）
- 丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）
- 异丙醇（IPA）
- N2
方法：
- 在通风橱中，用 PGMEA (2)、异丙醇（IPA）和正己烷（Hexane）(2) 分别填充五个培养皿。
- 将晶圆置于第一份 PGMEA 中 10 秒。
- 振荡晶圆 50 秒。
- 利用 PGMEA 的弯月面将晶圆转移至第二份 PGMEA 中。
- 振荡 5 秒。
- 利用 PGMEA 的弯月面将晶圆转移至异丙醇（IPA）中。
- 振荡 20 秒。
- 将晶圆转移至第一份异丙醇（IPA）中。
- 振荡 5 秒。
- 将晶圆转移至第二份异丙醇（IPA）中。
- 振荡 5 秒。
- 利用异丙醇（IPA）的弯月面迅速将晶圆从第二份 IPA 中取出，并用氮气（N₂）吹干。
- 检查图案。
- 在 120 °C 下对晶圆进行 14–20 小时的硬烘烤，以交联 SU-8。
- 使用金刚石切割器切割晶圆。
- 使用环氧树脂将晶圆固定在玻璃载片上。
- 对晶圆进行氟硅烷化处理（参见复制模塑中的说明）。
mPADS 的复制模塑
负模
材料：
- 一次性铝制称量皿
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂与固化剂（Dow，Midland，MI）
- 刀片
- 硅烷：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷
- 载玻片
- 玻璃巴斯德吸管
方法：
- 按重量比10:1混合PDMS，并在真空条件下脱气1小时，以去除气泡。
- 将硅胶母模放入铝舟中。
- 在铝舟内的母模上倒入50–60 g PDMS。
- 在真空条件下脱气30分钟，以去除气泡。
- 用快速氮气脉冲吹除PDMS表面滞留的气泡。
- 将铝舟放入对流烘箱中，在110 °C下加热15分钟，直至PDMS固化。
- 剪去铝舟。
- 用剃刀刮除硅胶母模下方多余的PDMS。
- 沿单一方向缓慢且持续地将PDMS从硅胶母模上剥离，以避免损坏母模。
- 检查硅胶母模是否受损。
- 将负模切割成4块。
- 重复步骤1–10，制备大量负模。
- 对负模进行1.5分钟的氧气等离子体处理以活化表面，或
- 对负模进行10分钟的臭氧处理以活化表面。
- 将负模放入干燥器中，使mPAD结构面朝上暴露。
- 在干燥器中心的玻璃载片上滴加250–500 μL硅烷。
- 将尖端含有150–200 μL硅烷的玻璃巴斯德吸管置于干燥器内。
- 抽真空使硅烷蒸发，并对负模进行超过>14小时的涂层处理。
mPADS
材料：
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底 & 固化剂（Dow，Midland，MI）
- 宽口一次性移液管
- 2” x 3” 玻璃载玻片
- 玻璃记号笔
- N2
方法：
- 按重量比10:1混合PDMS，并在真空条件下脱气1小时，以去除气泡。
- 将硅烷化处理的阴模放置成“十字”形。
- 用移液器将PDMS注入阴模中，确保微结构完全被覆盖，厚度达到1 mm。
- 静置30分钟，使PDMS中的气泡上升至表面。
- 在30分钟空闲时间内，用氮气流吹扫22×22 mm（No. 2）的玻璃盖玻片以去除灰尘。
- 对玻璃载片半片进行1.5分钟的氧气等离子体处理，以清洁并活化玻璃表面。
- 用短促的氮气脉冲吹除PDMS表面 trapped 的气泡。
- 用手轻轻将玻璃盖玻片的一边接触PDMS，等离子体处理过的面朝向PDMS，然后缓慢放下盖玻片，使PDMS与整个玻璃表面完全贴合，避免在盖玻片下方截留气泡。
- 将组装好的模具放入对流烘箱中，在110 °C下加热20小时，使其完全固化。
- 从烘箱中取出模具，使其冷却至室温。
- 用手握住玻璃载片顶部，从底部缓慢剥离阴模，从而释放出mPAD。
- 在显微镜下检查mPAD是否存在支柱塌陷现象。
- 每铸造四次后，通过等离子体和硅烷重新硅烷化模具。阴模在保持良好复制性能下的使用寿命约为6–20次。
将细胞接种到微图案化表面
压印
材料：
- 用于微接触印刷（uCP）的PDMS印章（参见 Tien, J & Chen, C. S.，《组织工程方法》，2001年，第113-120页）
- 乙醇（100% 和 70%）
- 灭菌去离子水
- 无菌去离子水中配制的50 μg/mL人纤维连接蛋白（BD Biosciences）
- 经0.2 μm滤膜过滤的5 μg/mL DiI溶液（D-3886，Molecular Probes，OR）
- 2% Pluronics F127（BASF，Mount Olive，NJ）
- 1×磷酸盐缓冲液
- 100 mm × 25 mm 培养皿（4个）
- 150 mm × 25 mm 培养皿（2个）
- 铝箔
- N2
- 镊子
- 无菌操作台
方法：
- 修剪微图案化PDMS芯片（mPADs）上多余的PDMS
- 若PDMS印章曾被使用过，需将其在100%乙醇中进行超声处理5分钟，以去除污染性蛋白质
- 在无菌操作台中，用镊子夹住印章侧面，先将其浸入新鲜的100%乙醇和无菌水中，随后用氮气（N₂）吹干
- 将印章放置于150 mm培养皿中，工作面朝上
- 将纤连蛋白溶液分装滴加至每个印章表面。先从每个印章的角落开始，然后是边缘区域，最后是内部区域。初始状态下PDMS表面具有疏水性，但随着蛋白吸附，表面逐渐变为亲水性。“由外向内”的操作方式可改变PDMS的接触角，从而减少完全覆盖印章所需的纤连蛋白溶液体积
- 在操作台中静置1小时，使蛋白充分吸附
- 通过向培养皿中倾倒去离子水（DI水）并使液面上升至完全覆盖印章的方式清洗印章
- 将印章转移至盛满去离子水的100 mm培养皿中进一步清洗
- 取出印章并用氮气（N₂）吹干
- 对mPADs进行7分钟臭氧处理，以活化表面便于后续印章转移
- 在通风橱内进行印章转移：将印章边缘接触mPAD表面，然后缓慢放下以确保完全贴合。用镊子轻轻敲击印章顶部，确保所有区域均良好接触，但需注意避免压塌微柱结构
- 用镊子小心取下印章
- 将mPADs浸入盛有100%乙醇的100 mm培养皿中约15秒。在转移过程中应迅速操作，防止微针结构发生脱湿现象
- 将mPADs浸入盛有70%乙醇的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入第二个盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入盛有去离子水的150 mm培养皿中
- 将mPADs浸入盛有100 mL DiI溶液的150 mm培养皿中
- 用铝箔覆盖，浸泡1小时
- 将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入盛有10 mL 2% Pluronics和90 mL PBS的150 mm培养皿中，最终Pluronics浓度为0.2%
- 盖上盖子，浸泡1小时
- 将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入第二个盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒
- 将mPADs浸入第三个盛有PBS的100 mm培养皿中约15秒
接种
材料：
- 选定的细胞系
- 胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶含 EDTA•4Na，Gibco 货号 25200-056）
- 生长培养基
- 1× 磷酸盐缓冲液
方法：
- 在无菌操作台中，将 mPADS 置于 100 mm 培养皿内，并加入 17 mL 培养基。
- 将培养皿放入培养箱中，使其升温至 37°C
- 使用胰蛋白酶悬浮细胞
- 反复吹打以分散细胞团块。
- 将细胞悬液转移至含有 mPADS 的培养皿中。添加细胞时应确保在分析时细胞保持为单细胞状态（无细胞间接触）。所需添加的细胞数量因细胞类型而异，取决于细胞的铺展面积和生长速率。
- 通过缓慢移液轻轻分散培养皿中的细胞。
- 将培养皿放入培养箱中孵育 2 小时，使细胞沉降并黏附到微针上。
- 检查 mPADS 上的细胞是否已铺展。铺展的细胞将呈现扁平形态，并跨越六个或更多微柱。
- 若细胞已铺展，将 mPADS 转移至新的 100 mm 培养皿中，并加入 21 mL 新鲜培养基。
- mPADS 现已准备好用于实验。
mPADS 染色与封片
固定
材料：
- 去离子水
- 多聚甲醛（16%）小瓶
- 10× 磷酸盐缓冲液
- 1× 磷酸盐缓冲液
方法：
- 在一个 50 mL 离心管中，加入 30 mL 去离子水、10 mL 多聚甲醛（整瓶）和 4.5 mL 10X PBS，配制固定液。
- 将约 25 mL 固定液加入一个 100 mm 培养皿中。
- 轻轻将带有细胞的 mPAD 浸入固定液中，室温孵育 20 分钟。
- 将 mPADs 放入含 1X PBS 的 100 mm 培养皿中，清洗三次。
- 即可进行免疫染色和封片。
分析细胞在mPADS上的受力
共聚焦成像
材料：
- 共聚焦显微镜
- 63倍物镜
- 用于二抗的滤光片组
- 绿色滤光片组（罗丹明），用于微针DiI成像。
方法：
- 将 mPADs 放置在载物台上，使用 300 ms 曝光时间、无像素合并的方式寻找单个细胞。
- 对微针顶部成像以获取顶部图像（TOP IMAGE）。
- 利用 z 轴控制读数，对微针进行成像以获取底部图像（BOTTOM IMAGE）。
- 对其他任何有染色的通道（如 Hoechst、鬼笔环肽等）进行成像。
图像分析
材料：
- 配备图像处理工具箱的 MATLAB
方法：
- 旋转并对齐顶部和底部图像
- 测量底部（未偏转）和顶部（偏转）位置的质心
- 计算位移
- 利用已知的微柱弹簧常数（取决于微柱几何形状），计算每个微柱上的力矢量
- 误差分析基于力的分辨能力，取决于图像分辨率和质心检测分辨率
- 根据自定义需求整理数据——例如，力的大小和/或方向、随时间变化的过程、在不同条件下进行的多次测量等
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参考文献
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells. Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. Wang, Y. L., Discher, D. E. 83, Elsevier. New York. 313-328 (2007).
- Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors. Mechanics & Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).
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