使用磁性激活细胞分选从小鼠脑脱髓鞘病变中分离小胶质细胞

摘要

来源:Zhang， H. et al. 在脱髓鞘动物模型中通过磁激活细胞分选分离小鼠原代小胶质细胞。J. Vis. Exp. （2022 年）。

该视频演示了一种使用磁性细胞分选从小鼠大脑脱髓鞘病变中提取小胶质细胞的方案。该方案包括解剖含有小胶质细胞的病变脑组织，用特异性酶处理组织以获得单细胞悬液，并利用小胶质细胞受体特异性磁珠分离小胶质细胞。

方案

所有涉及动物样本的程序均已经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. 材料

1. 在开始实验步骤之前准备以下解决方案:
   1. 通过将胎牛血清 （FBS， 2%） 添加到磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备上样缓冲液。
   2. 向 PBS 中加入中性红 （NR） 染料（最终 1%）。
2. 使用市售的成人脑解离试剂盒制备以下溶液（参见材料表）。
   1. 要制备酶混合物 1，将 1.9 mL 缓冲液 Z 和 50 μL 酶 P 移液到 15 mL 离心管中。
   2. 要制备酶混合物 2，请将 20 μL 缓冲液 Y 和 10 μL 酶 A 移液到 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 准备碎屑清除溶液。

2. 小鼠灌注和解剖

1. 麻醉前 2-3 小时腹膜内 （ip） 向小鼠注射 500 μL 1% NR 染料的 PBS 溶液><。 注意:在脱髓鞘小鼠模型中腹膜内注射 NR 有助于识别病变（图 1）。
2. 用戊巴比妥 （50 mg/kg，ip） 麻醉小鼠，并通过检查疼痛反应确保小鼠成功麻醉。
3. 打开鼠标的胸腔，露出心脏。
4. 小心地切掉右心房的一个小角落，并从左心室用 20-30 mL 的冷 PBS 心内灌注小鼠。
5. 在麻醉下将小鼠斩首。
6. 打开老鼠的头骨，小心地将大脑从头骨中释放出来。
7. 将大脑转移到小鼠脑切片模具中，将大脑切成 0.1 厘米的切片。
8. 取出脑切片，将它们放入培养皿 （60/15 mm） 中的冷 PBS 中。使用显微外科镊子，在立体显微镜下显微解剖胼胝体周围由 NR 染料标记的病灶><。 注意:确保解剖的组织尽可能完整，以便于后续转移;总解剖进度应在 2 小时内完成。
9. 将解剖的组织转移到含有适量冷加载缓冲液的 15 mL 离心管><中。 注意:将来自 2-3 只小鼠的胼胝体组织作为一个样品汇集在一个试管中。

3. 组织解离

1. 将解剖的组织以 300 ×g 离心 30 秒（达到此速度后）以收集管底部的样品。
2. 在培养箱中将酶混合物 1 和 2 预热至 37 °C。
3. 将 1,950 μL 预热的酶混合物 1 添加到一个样品中，并在 37 °C 的培养箱中消化 5 分钟。
4. 加入 30 μL 预热的酶混合物 2 并轻轻混合。
5. 在 37 °C 的培养箱中消化 15 分钟，每 5 分钟轻轻混合一次。
6. 消化后向试管中加入 4 mL 冷 PBS，轻轻摇晃。
7. 将 70 μm 过滤器放在 50 mL 离心管上，并用 500 μL 冷 PBS 预湿过滤器。将消化的组织样品通过过滤器过滤解离的组织，然后将 50 mL 离心管中的过滤悬浮液转移到 15 mL 离心管中><。 注意:如果组织量太少，请跳过此步骤。
8. 将过滤的组织样品在 4 °C 下以 300 × 离心 10 分钟，然后缓慢完全吸出上清液><。 注意:除酶消化外，所有步骤都应在冰上进行。

4. 清除碎片

1. 用 1,550 μL 冷 PBS 轻轻重悬细胞沉淀。
2. 加入 450 μL 冷溶液以去除碎屑并充分混合。
3. 使用 1,000 μL 移液器将上述混合物缓慢、轻柔地覆盖在 2 x 1 mL 的冷 PBS ><中。 注意: 将离心管倾斜 45°，然后用移液管沿管壁缓慢添加 PBS。
4. 将试管缓慢而轻柔地转移到离心机中，并在 4 °C 和 3,000 × g 下旋转 10 分钟。
5. 离心后寻找三层。使用 1,000 μL 移液器完全吸出两个顶层（图 2）。
6. 用冷上样缓冲液填充试管至 5 mL，然后轻轻倒置试管 3 次。
7. 在 4 °C 和 1,000 × g 下离心 10 分钟。完全吸出上清液，避免破坏细胞沉淀。

5. 小胶质细胞的磁性分离

1. 用 90 μL 上样缓冲液重悬细胞沉淀，并加入 10 μL CD11b（小胶质细胞）珠子。
2. 充分混合并在 4 °C 下孵育 15 分钟。
3. 加入 1 mL 上样缓冲液，用 1,000 μL 移液器轻轻上下移液，孵育后洗涤细胞。将细胞在 4 °C 和 300 × g 下离心 10 分钟，并完全吸出上清液以去除未结合的珠子。
将
4. 细胞重悬于 500 μL 的上样缓冲液中。
5. 将 MS 色谱柱及其分离器置于磁场中，以便在磁场中进行正向选择。
6. 按照制造商的方案，用 500 μL 上样缓冲液冲洗色谱柱，以保护细胞并确保磁选效率。
7. 将细胞悬液涂在 MS 色谱柱上，丢弃包含未标记细胞的流出液。
8. 向柱中加入 500 μL 上样缓冲液 3 次，以洗去粘附在柱壁上的细胞并丢弃流出液><。 注意:仅在色谱柱储液器为空时添加新的上样缓冲液进行洗涤。
9. 清洗色谱柱后，从分离器中取出色谱柱，并将其放在 15 mL 离心管上。
10. 向色谱柱中加入 1 mL 上样缓冲液，并将柱塞推至底部以冲洗出磁性标记的细胞。重复此步骤 3 次以完全收集磁性标记的细胞。

结果

图 1:由中性红色染料标记的局灶性脱髓鞘病变的图像。

图 2:离心形成的三层图像。在碎片清除过程中，必须去除顶部的两层（第 1 层 + 第 2 层）（参见协议步骤 4.5）。

材料