利用磁性激活细胞分选法从小鼠脑部脱髓鞘病变中分离小胶质细胞

摘要

本视频演示了一种利用磁性细胞分选技术从小鼠脑内脱髓鞘病灶中提取小胶质细胞的实验方案。该方案包括解剖含有小胶质细胞的病灶脑组织，使用特定酶处理组织以获得单细胞悬液，并利用针对小胶质细胞受体的磁珠分离小胶质细胞。

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 材料

开始实验方案前，请准备好以下溶液：
1. 通过向磷酸盐缓冲液（PBS）中加入胎牛血清（FBS，终浓度2%）来制备上样缓冲液。
2. 向PBS中加入中性红（NR）染料（终浓度1%）。
使用市售的成年动物脑组织解离试剂盒（参见材料表）配制以下溶液。
1. 配制酶混合液1：用移液器将1.9 mL Buffer Z和50 μL Enzyme P加入15 mL离心管中。
2. 配制酶混合液2：用移液器将20 μL Buffer Y和10 μL Enzyme A加入1.5 mL微量离心管中。
3. 制备去碎片溶液。

2. 小鼠灌注与解剖

在麻醉前2-3小时，向小鼠腹腔内（i.p.）注射500 μL含1%尼罗红（NR）染料的PBS溶液。
注意：在脱髓鞘小鼠模型中腹腔注射尼罗红有助于识别病灶（图1）。
使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，i.p.）对小鼠进行麻醉，并通过检测痛觉反应确认麻醉效果。
打开小鼠胸腔，暴露心脏。
小心剪去右心房的一小角，从左心室进行心脏灌注，使用20–30 mL冰冷的PBS溶液。
在麻醉状态下将小鼠断头。
打开小鼠颅骨，小心将脑组织从颅腔中分离出来。
将脑组织转移至小鼠脑切片模具中，切成厚度为0.1 cm的脑片。
取出脑片并置于盛有冰冷PBS的培养皿（60/15 mm）中。在体视显微镜下，使用显微外科镊子显微解剖胼胝体周围被尼罗红染料标记的病灶组织。
注意：确保所解剖的组织尽可能完整，以利于后续操作；整个解剖过程应在2小时内完成。
将解剖所得组织转移至含有适量冰冷上样缓冲液的15 mL离心管中。
注意：将2–3只小鼠的胼胝体组织合并至同一根离心管中作为一个样本。

3. 组织解离

将解剖后的组织在300 ×g离心30秒（达到该转速后开始计时），使样品沉降至管底。
将酶混合液1和酶混合液2在37 °C培养箱中预热。
向一个样品中加入1,950 μL预热的酶混合液1，在37 °C培养箱中消化5分钟。
加入30 μL预热的酶混合液2，轻轻混匀。
在37 °C培养箱中继续消化15分钟，每5分钟轻轻混匀一次。
消化完成后，向管中加入4 mL冷的PBS，轻轻振荡。
将70 μm滤膜置于50 mL离心管上，并用500 μL冷的PBS预润湿滤膜。通过滤膜过滤消化后的组织样品，将滤过的悬液转移至15 mL离心管中。
注意：若组织量过少，可省略此步骤。
将过滤后的组织样品在4 °C、300 ×g离心10分钟，缓慢且彻底地吸除上清液。
注意：除酶消化步骤外，所有操作均需在冰上进行。

4. 去除碎片

5. 小胶质细胞的磁珠分选

用90 μL上样缓冲液重悬细胞沉淀，并加入10 μL CD11b（小胶质细胞）磁珠。
充分混匀，在4 °C孵育15分钟。
孵育后加入1 mL上样缓冲液，用1,000 μL移液器轻轻吹打液体上下混合以洗涤细胞。在4 °C、300 × g条件下离心10分钟，彻底吸除上清液以去除未结合的磁珠。
将细胞重悬于500 μL上样缓冲液中。
将MS柱插入分离器中，置于磁场中进行阳性筛选。
按照生产商说明书，用500 μL上样缓冲液冲洗柱子，以保护细胞并确保磁性分选效率。
将细胞悬液加至MS柱上，弃去流出液（含未标记细胞）。
每次加入500 μL上样缓冲液，重复洗涤三次，以洗去黏附在柱壁上的细胞，并弃去每次的流出液。
注意：仅当柱子储液腔排空后，方可加入新的上样缓冲液进行洗涤。
洗涤完成后，将柱子从分离器上取下，置于一个15 mL离心管上。
向柱内加入1 mL上样缓冲液，将推杆推到底部以洗脱磁性标记的细胞。重复此步骤三次，以完全收集磁性标记的细胞。

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显示LPC诱导的脱髓鞘病变的脑横切面，神经生物学中的显微分析。
图1：中性红染料标记的局灶性脱髓鞘病变图像。

替代文本：“细胞分级分离示意图；离心管中分离过程中的各层及细胞沉淀。”
图 2：离心后形成的三层结构图像。 在去除碎片的过程中，必须移除最上面两层（第1层 + 第2层）（见实验方案步骤 4.5）。

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