等离子体光刻表面图案化用于构建细胞网络

摘要

已开发出一种通用的等离子体光刻技术，可用于生成稳定的表面图案，以引导细胞附着。该技术可用于构建细胞网络，包括模拟天然组织的细胞网络，并已应用于研究多种不同类型的细胞。

摘要

为了阐明各种细胞和分子现象，通常需要以微米和纳米级分辨率系统地操控细胞微环境。为满足这一需求，我们开发了一种等离子体光刻技术，通过构建特征尺寸从100 nm到毫米范围的图案化表面来调控细胞微环境。该技术的目标是以可控的方式研究单个细胞以及细胞群体的行为及其相互作用。

这种等离子体光刻方法基于通过物理模具屏蔽低温等离子体与基底表面的接触，从而选择性地改性表面化学性质。这种选择性屏蔽会留下一种化学图案，可引导细胞的黏附与移动。该图案或表面模板可用于构建细胞网络，其结构可模拟自然界中的组织形态，并为实验研究提供可控的环境。该技术非常适合研究生物学现象，因其能在透明聚合物基底上以生物相容的方式稳定地形成表面图案。这些表面图案可持续数周至数月，因而可在较长时间内引导细胞相互作用，有利于研究细胞的长期过程，如分化与适应。表面改性主要为化学性质，因此不会引入形貌或物理干扰，影响结果解读。此外，该方法不涉及任何剧烈或有毒物质即可实现图案化，且适用于组织培养。同时，该技术可应用于多种类型的聚合物基底，这类材料因其性能可调，已成为生物学应用中的理想选择并被广泛使用。该方法还可实现较高的分辨率，有助于隔离迁移、黏附或结合等特定过程，从而在单细胞至多细胞水平上进行明确、清晰的观察。

该方法已被用于构建由不同类型细胞组成的多样化网络，以研究细胞迁移、信号传导、组织形成以及网络中神经元的行为与相互作用。

方案

1. 用于图案化的模具制备

1. 图案的概念设计。创建用于形成细胞网络、控制细胞接触、隔离细胞、模拟天然结构或以其他方式引导细胞黏附和定位的图案。
2. 基于计算机辅助设计（CAD）的图案设计及光掩模制备。在 AutoCAD 等 CAD 软件中设计所需图案，然后送至外部公司制作光掩模。
3. 通过光刻技术制备主图案。根据所构建结构的尺寸，使用玻璃载片并涂覆薄层正性光刻胶或厚层负性光刻胶进行图案化。选用玻璃载片是因为其成本低、比硅晶圆更坚固，且破碎时产生的粉尘较少。此外，也可使用其他方便的结构（如衍射光栅）作为主图案。
4. 将已图案化的载片与一组未图案化的载片堆叠并固定。所有操作均在洁净工作台内进行，以最大限度减少灰尘污染。
5. 制备主模具。用略大于载片堆叠尺寸的铝箔制成容器，加入30 g聚二甲基硅氧烷（PDMS），然后将其倾倒覆盖在光刻图案化表面上，形成初始模具。PDMS需脱气，并静置固化一至两天。
6. 固化完成后，将PDMS从主图案上剥离，形成下一步使用的模具。
7. 取6 g双组分环氧树脂（Devcon #14310(6 g)），混合1分钟，随后倒入主模具中，进行脱气并静置固化。环氧树脂的脱气必须迅速完成（<8 min），需多次进行气泡破裂循环，并仅在树脂凝固前使用薄层，以便有效去除气泡；所用的6 g环氧树脂可形成薄层，有利于快速去除气泡。
8. 一小时后，双组分环氧树脂部分固化，可在其上再添加更多环氧树脂而不需再次脱气，以形成更厚的结构，便于后续操作。环氧树脂随后继续固化一至两天。
9. 固化完成后，将环氧树脂从PDMS主模具中取出，并用胶带包裹环氧模具边缘，形成容器。然后将PDMS浇注到环氧模具上，对PDMS进行脱气并固化一至两天，从而制备出工作模具。
10. 固化后，将工作模具从环氧模具上剥离，并妥善保存以保持清洁。

2. 利用模具对表面进行图案化以引导细胞

1. 将工作模具的微小片段切下，并放置于聚苯乙烯培养皿中。这些霉菌片段的位置需进行标记。
2. 利用这些小片段构成三脚架结构，并施加配重，以确保工作模具与培养皿表面紧密贴合。通过观察培养皿底部可判断放置是否良好。
3. 将组装好的样品放入等离子体腔室中。使用空气等离子体，在150 Pa、29.6 W（最大功率）条件下进行10分钟的等离子体处理。
4. 等离子体处理完成后，移除模具及配重装置。
5. 将培养皿置于生物安全柜内的紫外光下照射10分钟以完成灭菌，并在接种细胞前一直存放于该处。

3. 用细胞接种表面

1. 使用针对该细胞类型的常规方案培养 SH-SY5Y CRL-2266 人神经母细胞瘤细胞或其他细胞。
2. 在将 SH-SY5Y CRL-2266 人神经母细胞瘤细胞接种到图案化表面之前，通过肉眼观察测定细胞的融合度。
3. 采用常规的细胞传代方法，将细胞从培养皿表面消化下来。
4. 待细胞悬浮后，将其稀释至适当浓度，再接种到图案化培养皿表面，以达到在图案化区域所需的融合度。
5. 让细胞沉降并贴附于表面。
6. 将图案化培养皿孵育数小时至数天，使细胞在等离子体形成的图案上有序组装。
7. 在培养神经母细胞瘤细胞时，每天需添加全反式视黄酸（10 μM），以诱导细胞向类神经元状态分化。添加视黄酸时需避光操作。
8. 连续数日每日添加视黄酸，之后即可观察到细胞分化现象。
9. 每 3–4 天更换一次培养基。

4. 观察与分析

1. 通过定期拍摄活细胞的图像或视频，以观察细胞随时间推移的行为变化。进行活细胞成像时，将细胞置于显微镜载物台培养箱中，以维持细胞处于37 °C、100%湿度和5% CO₂的环境。细胞也可经固定和染色后，用于荧光显微镜下观察
2. 将已采集的细胞图像或视频导入图像分析系统，进行各项测量，包括细胞增殖速率、细胞大小、迁移速度、分化情况、排列方向、特定蛋白质的定位以及其他参数

5. 代表性结果：

采用等离子体光刻技术的典型结果是形成类似于任意或自然结构的细胞图案。图1a-b展示了所构建的神经元线条和神经网络。其他类型的细胞也可用于此技术，如图1c-d所示，其中人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和C2C12骨骼肌细胞形成了网格结构。此外，诸如聚-L-赖氨酸等材料也可被图案化，如图1e所示，以促进特定类型细胞的附着及其他用途。对于所示的神经元而言，所构建的是彼此之间具有连接的细胞网络。这模拟了大脑中神经元在相邻细胞之间形成明确连接的自然现象，而这些连接影响着大脑的功能。通过在实验室中构建此类结构，可系统地控制连接的数量、位置、频率及其他相关因素。这些排列所产生的结果可通过视觉进行测量，同时可施加化学或电刺激等额外输入，以探究网络的行为特性。

阴性结果表现为过度生长或不完整的图案，或样本受到污染。图案不完整或过度生长的原因可能是基底接种的细胞数量过少或过多，导致无法为图案提供理想的细胞数量。此外，如果图案设计不当（例如线条过窄），细胞将无法在其上成功贴附和生长。若样本受到污染，则说明在操作过程中某一环节未能保持适当的洁净度，但这种情况在严格遵循细胞培养操作规程时较为罕见，因为等离子体图案化过程本身也具有对基底的灭菌作用。

图1. 细胞与蛋白质的图案化。

讨论

本文介绍的细胞研究方法能够构建复杂的多细胞网络结构，模拟生物组织形态，同时提供一种生成亚细胞级别刺激的方法，从而便于研究细胞群体行为以及单个细胞对环境因素的响应。该方法操作简便且稳健，可在细胞培养实验室中使用低成本设备快速完成。该方法对细胞具有高度敏感性，易于观察细胞行为结果，且本身具有长期稳定性，可用于研究细胞的长期行为。此外，该方法适用于多种细胞类型，可创建任意图案，支持开展多样化的实验。该技术的长期稳定性源于等离子体处理所赋予的表面功能化修饰是表面本身的一部分，而非可被去除或降解的涂层或其他附加层。若在液体环境中保存，此类表面修饰可保持其引导细胞的能力达数月之久。

实验中最关键的部分是制备主模板，该模板最终将用于细胞引导，以确保获得有意义的结果。如果该模板设计不当，细胞将无法对模板做出适当响应，可能无法产生有用的行为。线宽、图案间距等参数会显著影响细胞与特定图案的相容性，通常可在初始光掩模上设计一系列此类参数，以筛选出最合适的图案设计。

与图案化操作相关的其他重要参数包括模具制备、保持无尘环境、细胞接种以及细胞培养的整体无菌性。模具制备可能受到多种转移步骤的影响，这些步骤旨在实现从环氧树脂模具上重复进行聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制。之所以采用环氧树脂模具，是因为在反复复制过程中，其不会像光刻胶模具那样在具有高宽比的小型结构上发生降解。如果转移 molding 操作正确，图案的尺寸和产率将不受影响；但如果操作不当，例如脱气不充分、固化不完全或加热过度，则可能导致气泡、表面粗糙或图案变形，从而影响最终结果。在保持无尘环境方面，必须尽可能保持模具清洁，因为任何灰尘都可能干扰工作用 PDMS 模具与表面之间的充分接触，进而影响等离子体屏蔽和化学图案化的准确性。此外，细胞接种密度也必须优化，以确保图案区域内细胞数量既不过少也不过多，同时必须维持无菌条件，避免所用细胞受到细菌或其他污染。

该技术还可与其他元件结合使用，例如微流控装置、微电极和机械探针，从而为细胞提供额外的刺激，以在实验过程中更好地模拟各种生理条件。未来的研究重点是探讨这些组合所产生的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
等离子清洗机与真空腔室	Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-001
倒置荧光与相差显微镜	Nikon Instruments	TE2000-U
显微镜载台培养箱	AmScope	Model TCS-100	经改装以包含可提供适宜气氛的封闭装置
聚苯乙烯培养皿	VWR international	25384-090
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning	Sylgard 184
环氧树脂	Devcon Inc.	2 ton clear epoxy #14310
细胞培养基	Various		培养基遵循相应细胞类型的标准化配方
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625