使用自动化的丝线肌动描记法研究肠系膜动脉的收缩与舒张

摘要

本文介绍了一种用于离体肠系膜动脉张力测量的自动化肌动图方法。该方法采用Mulvany-Halpern自动双丝肌动仪510A，测定血管对苯肾上腺素和细胞外钙的反应。该技术可独立、一致地测定直径为60 - 300 μm的小血管对激动剂的等长收缩反应。

摘要

近端阻力血管（如肠系膜动脉）对周围阻力有显著贡献。这些直径在100-400 μm之间的微小血管主要根据机体的整体需求，调节血液流向各个器官。大鼠肠系膜动脉的直径大于100 μm。肌张力测定技术最初由Mulvay和Halpern¹描述，其基础是Bevan和Osher²提出的方法。该技术可在等长条件下提供关于小血管的信息，在此条件下可防止肌肉标本发生显著缩短。由于血管对不同激动剂的收缩力和敏感性依赖于拉伸程度（依据主动张力-长度关系），因此必须在等长条件下进行收缩研究，以避免固定金属丝产生顺应性。优选不锈钢丝而非钨丝，因为后者易发生氧化，从而影响记录的反应³。该技术可用于比较固定血管在激动剂作用下的收缩反应，以获得血管平滑肌细胞受体功能正常的证据。

我们在多项研究中已证实，用苯肾上腺素收缩的离体肠系膜动脉，在加入累积浓度的细胞外钙（Ca²⁺）后会舒张。²⁺_e）。研究结果使我们得出结论：表达G蛋白偶联Ca²⁺-感受受体（CaR）介导这一血管舒张反应。本文采用自动化的丝线肌张力测定法，结果显示来自Wistar、Dahl盐敏感型（DS）和Dahl盐抵抗型（DR）大鼠的肠系膜动脉对Ca的反应不同²⁺_e. Wistar大鼠的组织显示出更高的Ca²⁺-敏感性相比DR和DS大鼠有所降低。DS大鼠肠系膜动脉中CaR表达减少与Ca敏感性降低相关²⁺_e诱导的离体预收缩动脉舒张。数据表明，在肾上腺素能张力升高（如高血压状态下）时，钙敏感受体（CaR）是肠系膜动脉舒张所必需的；同时提示Dahl动物模型中存在固有的CaR信号通路缺陷，且在DS大鼠中这一缺陷更为严重。

该方法可用于测定血管反应性 离体 在肠系膜阻力动脉及其他类似的小血管中，不同激动剂和/或拮抗剂之间的比较可轻松且一致地进行并列评估^6,7,8.

方案

1. 大鼠肠系膜小动脉的分离

1. 在密闭容器中使用异氟烷麻醉动物，并用酒精擦拭腹部。
2. 行腹正中切口开腹，暴露肠系膜床。
3. 使用剪刀切除约85 cm的肠道及其供血血管（即肠系膜上动脉）。近端切口靠近幽门，远端切口靠近回盲部。肠道节段取自深度麻醉的实验大鼠，通过开胸心脏穿刺法处死动物后获取。
4. 将切除的组织置于涂有涂层的培养皿中，内含PSS溶液，并在室温下进行肠系膜动脉的解剖分离。
5. 将肠道近端固定在右侧，其余部分以逆时针方向展开固定（即近端在左，供血血管位于肠道远侧）。
6. 分离第二级和第三级血管分支，并连同一段近端血管一并解剖取出。
7. 分离静脉并游离动脉（含V形分叉点），通过去除脂肪组织和结缔组织进行清理。操作时应避免直接接触动脉，使用镊子轻柔牵拉，并剪开结缔组织膜进行分离。

2. 血管的安装

1. 取两段较短的（约 4 cm）无钨不锈钢丝（40 μm），用精细镊子将其中一段插入每条动脉的管腔内，注意不要损伤内皮。如有必要，可用钢丝尖端打开管腔。若血液自血管流出，表明管腔已成功打开。
2. 将肌动描记仪腔室中充满生理盐溶液（PSS；mM：115 NaCl，4.7 KCl，1.4 MgSO₄.7H₂O，5 NaHCO₃，1.2 K_2....

讨论

高血压是心血管、脑和肾疾病发病率和死亡率的主要原因。人群中高血压的发病率较高，且在老年人群中盐敏感性高血压的发病率尤其高，黑人中的发病率高于白人。这被认为与黑人肾脏倾向于潴留钠有关⁹。盐敏感性是肾脏疾病的重要促成因素，且与内皮功能障碍相关，但其机制尚未完全阐明。我们实验室最近的研究发现，高盐饮食会降低盐敏感性大鼠的组织间液Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_IF），并升高收缩压^10,11。这些效应可能归因于肠系膜动脉和肾脏中CaR表达减少。若在盐敏感性高血压患者中也发现CaR水平的类似降低，则可能为开发新疗法提供靶点。我们一直采用自动化丝状肌动图法，利用多种高血压动物模型分离出的肠系膜动脉，研究血管对细胞外Ca²⁺_e的反应性，以阐明血管系统中CaR信号传导的机制。

[Ca²⁺]_e 在人体内维持在一个狭窄的范围内（1.1 - 1.4 mM）¹²，因此CaR必须能够检测[Ca

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Auto Dual Wire 肌小环张力测定系统-510ADMT-USA, Inc.	美国佐治亚州亚特兰大	100151
PowerLab/4SP 数据采集系统	ADInstruments	ML750	新型号提供 4-16 个输入通道。
戴尔 Dimension XPS Gen 4 计算机	Dell
Stemi SV II (Apo) 解剖显微镜（带目镜）	卡尔·蔡司公司
Wistar、Dahl盐敏感型、Dahl盐抵抗型大鼠	哈兰实验室
啮齿类动物饲料	哈兰实验室
去甲肾上腺素	Sigma-Aldrich
其他化学品			所有使用的化学试剂均为 commercially 可获得的最高纯度级别。