使用自动化的丝线肌动描记法研究肠系膜动脉的收缩与舒张

摘要

本文介绍了一种用于离体肠系膜动脉张力测量的自动化肌动图方法。该方法采用Mulvany-Halpern自动双丝肌动仪510A，测定血管对苯肾上腺素和细胞外钙的反应。该技术可独立、一致地测定直径为60 - 300 μm的小血管对激动剂的等长收缩反应。

摘要

近端阻力血管（如肠系膜动脉）对周围阻力有显著贡献。这些直径在100-400 μm之间的微小血管主要根据机体的整体需求，调节血液流向各个器官。大鼠肠系膜动脉的直径大于100 μm。肌张力测定技术最初由Mulvay和Halpern¹描述，其基础是Bevan和Osher²提出的方法。该技术可在等长条件下提供关于小血管的信息，在此条件下可防止肌肉标本发生显著缩短。由于血管对不同激动剂的收缩力和敏感性依赖于拉伸程度（依据主动张力-长度关系），因此必须在等长条件下进行收缩研究，以避免固定金属丝产生顺应性。优选不锈钢丝而非钨丝，因为后者易发生氧化，从而影响记录的反应³。该技术可用于比较固定血管在激动剂作用下的收缩反应，以获得血管平滑肌细胞受体功能正常的证据。

我们在多项研究中已证实，用苯肾上腺素收缩的离体肠系膜动脉，在加入累积浓度的细胞外钙（Ca²⁺）后会舒张。²⁺_e）。研究结果使我们得出结论：表达G蛋白偶联Ca²⁺-感受受体（CaR）介导这一血管舒张反应。本文采用自动化的丝线肌张力测定法，结果显示来自Wistar、Dahl盐敏感型（DS）和Dahl盐抵抗型（DR）大鼠的肠系膜动脉对Ca的反应不同²⁺_e. Wistar大鼠的组织显示出更高的Ca²⁺-敏感性相比DR和DS大鼠有所降低。DS大鼠肠系膜动脉中CaR表达减少与Ca敏感性降低相关²⁺_e诱导的离体预收缩动脉舒张。数据表明，在肾上腺素能张力升高（如高血压状态下）时，钙敏感受体（CaR）是肠系膜动脉舒张所必需的；同时提示Dahl动物模型中存在固有的CaR信号通路缺陷，且在DS大鼠中这一缺陷更为严重。

该方法可用于测定血管反应性 离体 在肠系膜阻力动脉及其他类似的小血管中，不同激动剂和/或拮抗剂之间的比较可轻松且一致地进行并列评估^6,7,8.

方案

1. 大鼠肠系膜小动脉的分离

1. 在密闭容器中使用异氟烷麻醉动物，并用酒精擦拭腹部。
2. 行腹正中切口开腹，暴露肠系膜床。
3. 使用剪刀切除约85 cm的肠道及其供血血管（即肠系膜上动脉）。近端切口靠近幽门，远端切口靠近回盲部。肠道节段取自深度麻醉的实验大鼠，通过开胸心脏穿刺法处死动物后获取。
4. 将切除的组织置于涂有涂层的培养皿中，内含PSS溶液，并在室温下进行肠系膜动脉的解剖分离。
5. 将肠道近端固定在右侧，其余部分以逆时针方向展开固定（即近端在左，供血血管位于肠道远侧）。
6. 分离第二级和第三级血管分支，并连同一段近端血管一并解剖取出。
7. 分离静脉并游离动脉（含V形分叉点），通过去除脂肪组织和结缔组织进行清理。操作时应避免直接接触动脉，使用镊子轻柔牵拉，并剪开结缔组织膜进行分离。

2. 血管的安装

1. 取两段较短的（约 4 cm）无钨不锈钢丝（40 μm），用精细镊子将其中一段插入每条动脉的管腔内，注意不要损伤内皮。如有必要，可用钢丝尖端打开管腔。若血液自血管流出，表明管腔已成功打开。
2. 将肌动描记仪腔室中充满生理盐溶液（PSS；mM：115 NaCl，4.7 KCl，1.4 MgSO₄.7H₂O，5 NaHCO₃，1.2 K₂HPO₄，1.1 Na₂HPO₄，1.0 CaCl₂，20 HEPES 和 5 葡萄糖，pH 7.4），并加入抗坏血酸（100 μM），在 37 °C 下平衡。用镊子小心地将穿线的血管段从培养皿中转移至室温下的腔室内，并将切除的近端血管段转移至肌动描记仪腔室，沿钢丝拉动末端，将其送入血管内。避免拉伸血管。
3. 将靠近端的钢丝在右侧连接测微计的夹具上，逆时针方向固定在近端固定螺钉下方。用镊子夹住钢丝的自由端，并顺时针方向将其固定在右侧夹具的远端固定螺钉下。确保沿钢丝的血管段位于夹具之间的间隙中，且不与夹具本身接触。
4. 将夹具旋开，将第二根钢丝与血管平行对齐，并插入血管远端的管腔内。借助已安装的钢丝作为引导，用一个连续动作轻柔地将钢丝穿过血管段的管腔。操作时握住钢丝距离血管约 1 cm 处，以避免在操作过程中拉伸血管，并避免触碰内皮。
5. 将夹具旋紧，确保第二根安装钢丝从右侧夹具上已固定的第一个钢丝下方穿过。
6. 将第二根钢丝的近端在左侧连接换能器的夹具上，顺时针方向固定在近端固定螺钉下。
7. 将钢丝的远端固定在左侧夹具的固定螺钉下，并拧紧以拉紧钢丝。
8. 安装完成后，在“安装菜单”中重置电机，并开始对血管进行标准化处理。

3. 归一化

Auto Dual Wire Myograph 系统-510A 具备自动归一化功能，该功能通过“归一化”菜单进行评估，允许血管在平衡 30 分钟后，根据制造商方案采用标准化程序拉伸至归一化的内周长 37 °C. 然后将指数曲线拟合到内周长压力数据。该步骤用于定义管腔直径（d100）该动脉原本应有的 体内 当处于松弛状态且跨壁压为 100 mmHg 时¹大鼠肠系膜动脉的标准化参数如下：

1. 目标跨壁压 = 13.3 kPa (100 mm Hg)。
2. 时间 = 60 秒；每个归一化步骤的持续时间。
3. IC₁/IC₁₀₀ = 0.9（IC₁ = 归一化内周长，IC₁₀₀ = 对应目标压力的内周长）。
4. 目镜校准 2*Δ (mm/目镜分划单位)；2 delta 出于编程原因。

使用显微镜目镜读数测量安装好的肠系膜动脉长度，当目镜中的十字线分别对准血管段的远端和近端时进行读数。具体而言，在解剖显微镜下以最大放大倍数，使用已校准的目镜测微尺测量安装血管段的长度。记录目镜分度下十字线对准血管段远端（a₁）和近端（a₂）时的读数。这些数值连同血管拉伸前后的显微测微尺读数一并记录，并输入程序菜单中，用于计算拟合曲线以及对应目标跨壁压为100 mm Hg时的内径值。

在我们的研究中，将动脉设定为管腔直径 d₁ = 0.9 × d₁₀₀，此时主动张力达到最大值。大鼠肠系膜动脉的主动张力达到或超过 10 mN 时，被视为实验的理想状态；主动张力较低的组织被弃用。

4. 反应的测量

标准化后，通过执行“标准启动”程序重新激活血管的机械和功能特性，该程序包括反复施加（通常为2或3次）5 μM去氧肾上腺素（PE）以获得可重复的收缩反应。在我们实验室中，典型的“标准启动”包括一系列刺激和洗脱步骤，如下所示：

1. 更换肌动描记室盖，并以95%空气和5% CO₂开始通气。
2. 用新鲜的PSS（含100 μM抗坏血酸）填充室腔。
3. 用5 μM PE收缩血管5分钟，并用PSS缓冲液洗涤4次。
4. 最后一次洗涤后，重新向室腔中加满PSS，等待3分钟，然后重复步骤（ii）和（iii）。

标准启动后，动脉即可用于实验。通过累积添加浓度递增的CaCl₂（0.5 - 4 mM）来评估收缩血管的舒张反应。当使用抑制剂时，需将血管在肌动描记仪腔室中与化合物预先孵育20分钟，并在整个检测过程中保持存在。

5. 数据分析

将血管和力信号的“归一化”数据直接转换为文本数据后，使用 SigmaPlot 11.0 作图程序（Systat Software, Point Richmond, CA）进行分析，并如图 1 所示进行绘图。浓度-反应数据通过程序中 Pharmacology 菜单下的四参数逻辑函数拟合实验数据，计算 EC₅₀ 值进行分析。组间和组内比较采用单因素方差分析（ANOVA），当 p < 0.05 时认为差异具有统计学意义。

6. 典型结果：

参数	Wistar	Dahl盐敏感型	Dahl盐抵抗型
L100 (μm)	83.26 ± 2.33	91.52 ± 4.67	117.45 ± 8.43*
X1	604.21 ± 41.97	752.24 ± 85.25	745.84 ± 110.09
r2	0.99 ± 0.003	0.97 ± 0.008	0.97 ± 0.007

*Wistar 与 DR 的 L₁₀₀ 值之间的差异具有统计学意义。Shapiro-Wilk 正态性检验通过（p = 0.588）；方差齐性检验通过（p = 0.237）。

L₁₀₀ = 安装的血管段在目标跨壁压下的内径。

X₁ = 使安装的血管达到其标准化内周长所需的微调定位器设定值（即实验进行时所用的千分尺读数）。

r² = （X_i, Y_i）拟合指数曲线的回归系数。

注意：详细步骤见510A肌动图系统使用手册⁶。

表1. 来自“标准化菜单”中基础程序的Wistar、DS和DR大鼠肠系膜动脉段标准化参数的示例读数。数值为5只动物的平均值（± 标准误）。*Wistar与DS之间L₁₀₀值的差异具有统计学意义（p < 0.05）。

Wistar	DS	DR
14.2 ± 0.6	25.8 ± 2.7*	20.9 ± 1.3*

表2. 应用5 μM PE后，从Wistar、DS和DR大鼠分离的肠系膜动脉产生的张力（mN）。报告值为6-8只动物的均值（± SEM）。*与Wistar对照组相比差异显著（p < 0.05）。

图1. 在含1 mM Ca²⁺的生理盐溶液中，使用丝状肌动描记仪固定中国Wistar大鼠肠系膜动脉后，Ca²⁺_e诱导的PE收缩血管舒张。动脉在37 °C条件下持续通气平衡30分钟，并记录对Ca²⁺_e的反应。图中显示了加入5 μM PE后，再逐步累积加入Ca²⁺时典型的张力变化曲线。

图2. Ca²⁺_e-诱导的生理盐溶液（含1 mM Ca）中悬挂于张力测定仪上的DS大鼠肠系膜动脉在PE收缩后的舒张反应²⁺. 动脉在37℃下平衡30分钟 37 °C 持续通气及对 Ca 的响应²⁺_e 测定。添加时的代表性受力轨迹 5 μM PE 后依次累积加入 Ca²⁺ 如图所示。Ca²⁺ 与Wistar和DR大鼠的组织相比，该组织的舒张功能严重受损。

图 3. 在含 1 mM Ca²⁺ 的生理盐溶液中，使用丝状肌动描记器记录糖尿病大鼠肠系膜动脉在苯肾上腺素（PE）收缩后由细胞外 Ca²⁺_e- 诱导的舒张反应。动脉在 37 °C 下平衡 30 分钟，并持续通气，随后测定其对细胞外 Ca²⁺_e 的反应。图中显示的是加入 5 μM PE 后，再逐步累积添加 Ca²⁺ 的典型张力变化曲线。

图4. A. [Ca²⁺]_e-反应曲线。B. 通过将数据拟合至四参数逻辑曲线得出的舒张EC₅₀值柱状图。C. 从DR和DS大鼠分离的肠系膜动脉弓中CaR的表达情况。

讨论

高血压是心血管、脑和肾疾病发病率和死亡率的主要原因。人群中高血压的发病率较高，且在老年人群中盐敏感性高血压的发病率尤其高，黑人中的发病率高于白人。这被认为与黑人肾脏倾向于潴留钠有关⁹。盐敏感性是肾脏疾病的重要促成因素，且与内皮功能障碍相关，但其机制尚未完全阐明。我们实验室最近的研究发现，高盐饮食会降低盐敏感性大鼠的组织间液Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_IF），并升高收缩压^10,11。这些效应可能归因于肠系膜动脉和肾脏中CaR表达减少。若在盐敏感性高血压患者中也发现CaR水平的类似降低，则可能为开发新疗法提供靶点。我们一直采用自动化丝状肌动图法，利用多种高血压动物模型分离出的肠系膜动脉，研究血管对细胞外Ca²⁺_e的反应性，以阐明血管系统中CaR信号传导的机制。

[Ca²⁺]_e 在人体内维持在一个狭窄的范围内（1.1 - 1.4 mM）¹²，因此CaR必须能够检测[Ca

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Auto Dual Wire 肌小环张力测定系统-510ADMT-USA, Inc.	美国佐治亚州亚特兰大	100151
PowerLab/4SP 数据采集系统	ADInstruments	ML750	新型号提供 4-16 个输入通道。
戴尔 Dimension XPS Gen 4 计算机	Dell
Stemi SV II (Apo) 解剖显微镜（带目镜）	卡尔·蔡司公司
Wistar、Dahl盐敏感型、Dahl盐抵抗型大鼠	哈兰实验室
啮齿类动物饲料	哈兰实验室
去甲肾上腺素	Sigma-Aldrich
其他化学品			所有使用的化学试剂均为 commercially 可获得的最高纯度级别。