本文描述了一种用于脑型疟疾寄生虫滞留的体外模型1。恶性疟原虫感染的红细胞被筛选以结合永生化的人脑微血管内皮细胞。筛选获得的寄生虫表现出独特的表型。该筛选方法可应用于多种P. falciparum菌株和内皮细胞系。
本文内容
摘要
摘要
大多数人类疟疾死亡由红细胞期的Plasmodium falciparum寄生虫引起。脑型疟疾是该病最危及生命的并发症，其特征是处于色素性滋养体阶段的Plasmodium falciparum感染红细胞（iRBC）在脑部微血管中积聚2-4。这种微血管阻塞（即隐匿）可导致酸中毒、缺氧以及有害的炎性细胞因子释放（详见综述5）。隐匿现象也见于人体大多数微血管组织中2, 3。目前对iRBC如何黏附于血管壁的机制仍了解甚少。
永生化人脑微血管内皮细胞系（HBEC-5i）已被用作 体外 血脑屏障模型6。然而， 恶性疟原虫 感染红细胞与HBEC-5i细胞的黏附能力较弱 体外，不同于脑型疟疾中出现的密集滞留现象。因此，我们开发了一种涂板筛选实验，用于选择（富集）不同类型 P. falciparum 用于与HBEC-5i细胞黏附的虫株筛选，以获得高结合能力的寄生虫群体，更真实地反映实际发生的情况 体内.
取处于色素滋养体阶段的寄生虫培养物（感染红细胞与未感染红细胞的混合物）样品，洗涤后接种于培养在培养皿上的 HBEC-5i 细胞层上并进行孵育。孵育后，轻轻洗涤去除未感染的红细胞及未结合的感染红细胞。向少数仍附着于 HBEC-5i 的感染红细胞中加入新鲜的未感染红细胞，过夜孵育。当裂殖体阶段的寄生虫破裂释放裂殖子后，裂殖子重新侵入红细胞，次日收集环状体阶段的寄生虫。继续培养寄生虫直至获得足够材料（通常需要 2 至 4 周），即可进行新一轮筛选。根据 P. falciparum 菌株的不同，通常需要进行 4 至 7 轮筛选，才能获得大多数寄生虫均能结合 HBEC-5i 的群体。结合表型在数周后会逐渐丧失，表明变异表面抗原基因表达发生了转换，因此需定期在 HBEC-5i 上进行筛选以维持该表型。
综上所述，我们开发了一种筛选方法，使P. falciparum寄生虫呈现出更强的“脑型疟疾黏附”表型。我们成功地在HBEC-5i细胞上筛选出4种P. falciparum菌株中的3种。该方法也已成功用于筛选能够结合人皮肤和肺部内皮细胞的寄生虫。重要的是，该技术可用于富集组织特异性的寄生虫群体，从而鉴定出与脑内皮结合的候选寄生虫配体。此外，该检测方法还可用于筛选潜在的抗滞留药物7。
方案
一般建议
人脑微血管内皮细胞（HBEC-5i）的培养方法此前已在文献6, 8中描述。P. falciparum 寄生虫的培养方法同文献9所述。HBEC-5i 细胞和 P. falciparum 寄生虫培养物必须始终在无菌条件下进行。所有试剂均需在 37°C 预热。我们建议定期通过 PCR 检测支原体污染10（使用 Minevera Biolabs 试剂盒，按照制造商说明书操作）。本方案的总体流程见图 1。
1. 内皮细胞常规培养
- 准备必要的试剂。
| 需配制的培养基 | 试剂 | 数量 |
| "DMEM incomplete" | DMEM-F12 Ham | 500ml |
| L-谷氨酰胺 200mM | 5ml | |
| 青霉素/链霉素 100X | 5 ml | |
| NaOH 1M | 1.3 ml（调节pH至7.4） | |
| "DMEM complete" | "DMEM incomplete" | 450ml |
| 胎牛血清（经热灭活） | 50ml | |
| 内皮细胞生长添加剂 | 5 ml |
- 在通气的 25 cm² 培养瓶中培养 HBEC-5i2 含10 ml DMEM完全培养基的培养瓶 37°C 5% CO₂ 培养箱2.
- 细胞汇合时进行传代。用吸力移除旧培养基，使用DMEM不完全培养基或组织培养级PBS（含Ca²⁺、Mg²⁺）洗涤两次2+ 和 Mg2+ 预热的无（free） 37°C.
- 加入1 ml预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.025%胰蛋白酶，0.5 mM EDTA），轻轻晃动以覆盖整个培养瓶表面，于约2分钟内孵育 37°C.
- 在倒置显微镜下观察，确保至少90%的细胞已脱落。必要时，轻轻敲击培养瓶底部以松解贴壁细胞。加入10 ml完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞转移至15 ml锥形离心管中。在300 ×g条件下离心4分钟 g 室温（RT）下
- 弃去上清液，用10 ml DMEM完全培养基重悬沉淀。反复吹打溶液，充分重悬细胞。
- 向新培养瓶中加入1至2毫升细胞悬液，并加入8毫升新鲜培养基以维持培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并在培养基变黄前每2至3天更换一次培养基。
2. 为筛选准备内皮细胞
- 选择前两天，将纤连蛋白用无菌 PBS 稀释后加入2 μg/cm2)置于一个（或多个）60 mm 培养皿中。将培养皿在 5 至 20 分钟内孵育 37°C，然后移除纤连蛋白溶液，该溶液可在 4°C 一个月后可重复使用一次。
- 如1.3至1.5节所述的传代细胞。假设细胞达到100%汇合度，将其消化后重悬于10 ml DMEM完全培养基中（见1.6节）；若细胞汇合度较低，则使用等体积的培养基重悬。 例如 若融合度为80%，用8 ml重悬，取1.5 ml悬浮细胞加入纤连蛋白包被的培养皿中，再加入1.5 ml完全DMEM培养基。
- 将接种好的培养皿放入培养箱中。注意：理想情况下，两天后进行筛选时，细胞融合度应约为90%。
- 可选. 为激活 HBEC-5i，加入 TNF（肿瘤坏死因子）细胞因子，使其终浓度为 50μg/ml 在筛选前24小时。
3. Plasmodium falciparum 常规培养
- 准备所需的试剂（见下表）。通过白细胞去除过滤器过滤全血（O+型）来制备人红细胞（RBC）（有关疟原虫常规培养方法，参见《疟疾研究方法》出版物11）。用10 ml不完全RPMI培养基重悬红细胞，以400 g离心5分钟，洗涤两次。将洗涤后的红细胞以50% hematocrit浓度悬浮于不完全培养基中，于4°C保存。
| 待配制的培养基 | 试剂 | 用量 |
| "RPMI 不完全培养基" | RPMI 1640 (含碳酸氢盐) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| 葡萄糖 20% | 5ml | |
| L-谷氨酰胺 200mM | 5ml | |
| 庆大霉素 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0.7 ml (调节 pH 至 7.2) | |
| "RPMI 完全培养基" | "RPMI 不完全培养基" | 450ml |
| 混合人源（非免疫）血清 | 50ml |
- 在 2% 血细胞比容的条件下，使用 RPMI 完全培养基培养 P. falciparum 感染的红细胞，并在 37°C、3% CO2、1% O2 和 96% N2 的环境中孵育。每日制备吉姆萨染色涂片11，以评估寄生虫的发育阶段（图 2）。
- 定期（约每周一次）通过山梨醇处理12同步培养物。在进行筛选实验的前一天，目标为环状体阶段的培养物，寄生率应达到 5% 或更高（理想情况下至少为 10%）。
4. 筛选 P. falciparum 与内皮细胞的粘附作用
- 实验当天，疟原虫培养物应处于色素化的滋养体阶段（图2）（理想寄生率约为10%），而HBEC-5i细胞培养物应达到50%至100%融合度（理想为90%）。每皿HBEC-5i需使用30μl压积体积的疟原虫培养物。
- 取1.5ml疟原虫培养物，以500g离心5分钟，洗涤两次。弃去上清液，每次用10ml新配制并预热的DMEM不完全培养基重悬。第二次洗涤后，将30μl压积体积的疟原虫用1.5ml含1% BSA的DMEM不完全培养基重悬。
- 用吸液法将HBEC-5i包被的培养皿洗涤两次，每次加入3ml不完全DMEM培养基。
- 将疟原虫悬液加入HBEC-5i培养皿中，于37°C孵育75分钟。孵育期间，在30分钟和60分钟时各轻柔摇动培养皿两次，沿四个方向以及顺时针和逆时针方向轻轻晃动，以重悬疟原虫。
- 孵育结束后，用塑料巴斯德吸管加入3ml预热的DMEM不完全培养基，并轻轻摇动，重复此洗涤步骤共5次。若同时处理多个培养皿，应将其置于温暖表面（例如装有37°C水的大烧瓶）上以维持温度。
- 在倒置显微镜下观察培养皿。若仍可见大量未感染红细胞，应按上述方法增加洗涤次数。操作培养皿时需格外小心，避免污染风险。
- 吸除培养基，向培养皿中加入3ml预热的含40μl压积体积新鲜未感染红细胞（uRBC）的RPMI完全培养基。
- 将培养皿放入密闭孵育室，通气3分钟，随后将孵育室置于37°C培养箱中过夜。
- 次日，参照第4.4节所述方法，但更彻底地用RPMI不完全培养基洗涤以收获疟原虫。将所有使用过的培养基（含重悬的红细胞）收集至15ml锥形管中。在倒置显微镜下检查，确认培养皿中所有红细胞已被清除。
- 离心收集疟原虫，弃去上清液，用5ml RPMI完全培养基重悬，将混合液转移至培养瓶中进行常规培养。
5. 典型结果
未筛选的寄生虫对 HBEC-5i 细胞的结合水平较低（图 3A）。因此，经过第一轮筛选后，收获的寄生虫数量极少，可能需要长达一个月的培养时间才能达到足够进行第二轮筛选的寄生虫血症水平。每完成一轮筛选后，越来越多的寄生虫能够结合内皮细胞，后续筛选可缩短间隔时间重复进行。经过 4–5 轮筛选后，可获得高结合能力的寄生虫群体（图 3）。
在我们实验中，HB3-HBEC 与 HBEC-5i 或 TNF 激活的 HBEC-5i 的结合水平相似（数据未显示）。
本文所述方案已使用4种P. falciparum菌株进行测试：HB3、IT/FCR3、3D7和Dd2（表1）。其中仅Dd2菌株在经过5轮筛选后仍无法与HBEC-5i结合。
HB3 寄生虫也经过筛选，以获得对人皮肤和肺微血管内皮细胞（HDMEC 和 HPMEC）的黏附能力。采用此处所述方法经过四轮筛选后，在 HDMEC 和 HPMEC 上均获得了高结合能力的虫群（图 4）。
图 1. 筛选流程概览。
图2. 发育阶段 P. falciparum 感染的红细胞1000倍显微镜下观察吉姆萨染色涂片。
图3. 疟原虫结合HBEC-5i细胞的典型示例。(A) 蓝色层为经戊二醛固定并用吉姆萨染色的HBEC-5i细胞，在1000倍显微镜下观察。在洗去未结合的红细胞（uRBC）和未结合的感染红细胞（iRBC）后拍摄图像。左侧面板显示单个未筛选的P. falciparum HB3株寄生虫结合至HBEC-5i细胞；右侧面板显示HB3-HBEC寄生虫经过5轮筛选后的结合情况。(B) 数据来自两次独立实验的平均值，每次实验均设两个重复。统计每内皮细胞上结合的寄生虫数量。
表 1. 成功筛选出能够结合 HBEC-5i 的Plasmodium falciparum菌株汇总。 注意，HB3 还在 TNF 激活的 HBEC-5i 上进行了筛选。经过 5 轮筛选后，Dd2 菌株与未筛选的 Dd2 相比，在结合 HBEC-5i 方面未显示出增加。
图4. 结合 P. falciparum HB3 寄生虫在经过四轮筛选前后与皮肤（HDMEC）和肺部（HPMEC）内皮细胞的结合情况。 尽管HDMEC和HPMEC的培养基略有不同（参见供应商说明书），但其筛选所用方案与HBEC-5i相同。图片为400倍放大下拍摄。
| 试剂名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| DMEM-F12 Ham | Sigma | D6421 | 用于DMEM完全培养基 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | GIBCO | 25030 | 用于DMEM和RPMI完全培养基 |
| 青霉素/链霉素 100倍浓缩液（10000 单位/ml 和 10 mg/ml） | ScienCell | 0503 | 用于DMEM完全培养基 |
| 胎牛血清，热灭活 | ScienCell | 0025 | 用于DMEM完全培养基 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.025% 胰蛋白酶，0.5 mM EDTA） | ScienCell | 0103 | |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | 1052 | 用于DMEM完全培养基 |
| 组织培养处理的 60 mm × 15 mm 培养皿 | BD | 353002 | |
| 人纤维连接蛋白 | Millipore | FC010 | 使用浓度为 2 μg/cm2 |
| TNF | R&D Systems | 210-TA | 可选，使用浓度为 50 μg/ml |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | 用于RPMI完全培养基 |
| 庆大霉素 50 mg/ml | Lonza | 17-518Z | 用于RPMI完全培养基 |
| HEPES 1 M | Lonza | BE17-737E | 用于RPMI完全培养基 |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | 原代细胞系 |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | 原代细胞系 |
| HBEC-5i | 由 Francisco Candal（fcandal@cdc.gov）提供 |
表2. 材料
讨论
脑型疟疾的特征是寄生虫在脑部微血管中的滞留 P. falciparum 脑微血管内的感染性红细胞2, 3。然而， 体外 培养物的 P. falciparum 仅对HBEC-5i（人脑微血管内皮细胞模型）表现出较弱的细胞黏附能力。在此，我们建立了一种简便的富集方法，用于筛选并富集能够结合HBEC-5i的细胞群体，这一方法更具“体内 “类”表型。4个中的3个 P. falciparum 通过该方法成功筛选出虫株。此外，HB3也在HDMEC和HPMEC上被成功筛选，表明本方案可适用于多种疟原虫和内皮细胞类型。
不同的假设可以解释与Dd2菌株无结合的现象。最可能的原因是该寄生虫品系无 knobs 结构，这会严重阻碍其细胞黏附能力13, 14。
建议在筛选过程中同时培养未经筛选的寄生虫，以提供用于比较的对照。这将有助于例如比较结合型与非结合型寄生虫的转录组，从而有望发现寄生虫配体候选分子。
TNF 是一种在脑型疟疾患者体内高水平存在的细胞因子，已被证明可诱导 HBEC-5i 细胞多种表面蛋白的表达（Claessens 等，正在准备中，以及8, 15, 16）。在此情况下，正常 HBEC-5i 与活化的 HBEC-5i 结合的感染红细胞（iRBC）数量相似。
这种“隔离模型”还可用于研究感染性红细胞（iRBC）与内皮细胞之间的分子相互作用，以及潜在抗黏附药物的作用效果。在此情况下，我们建议将HBEC-5i细胞接种于较小的培养板中，例如“8孔细胞培养板”（BD 354628）或“CultureWell”（Sigma C7735-20EA）。
披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢美国佐治亚州亚特兰大市疾病控制与预防中心（CDC）技术转让办公室的 Francisco Candal 提供 HBEC-5i 细胞。本研究由惠康基金会资助（AC 获得四年制博士生奖学金，JAR 获得基础 biomedical 科学高级研究员项目，资助编号 084226）。
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