追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

摘要

本文介绍了早期鸡胚的表面标记及ex ovo组织培养技术。文中展示了适用于延时明场、荧光和光学相干断层扫描成像的技术方法。通过高时空分辨率追踪表面标记，能够在二维和三维条件下计算形态发生应变（形变）等运动学参数。

摘要

胚胎上皮会经历复杂的形变（例如弯曲、扭转、折叠和拉伸），以形成早期胚胎的原始器官。在这些细胞层表面追踪标记点是估算形态发生量（如生长、收缩和剪切）的成熟方法。然而，并非所有表面标记技术都易于适配常规成像方式，且各自具有不同的优势与局限性。本文中，我们描述了两种标记方法，并展示了每种技术的应用价值。第一种方法利用磁性铁颗粒，同时在胚胎上施加数百个荧光标记，进而用于量化形态发生过程中的二维组织形变。第二种方法则使用聚苯乙烯微球作为非侵入性光学相干断层扫描（OCT）成像中的对比剂，以追踪三维组织形变。这些技术已在本实验室成功应用于研究早期头褶、心脏和大脑发育的物理机制，且应可广泛适用于多种形态发生过程。

方案

1. 一般实验准备

1. 在超净工作台中配制组织培养用培养基。
   1. 稀释杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1 L 瓶装，含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺），加入 10 mL 青霉素/链霉素/新霉素抗生素。
   2. 用无菌移液管移除 100 mL DMEM，并加入 100 mL 鸡血清替代。
   3. 将含 10% 鸡血清和 1% 抗生素的 DMEM 分装至无菌的 15 mL 锥形离心管中，冷冻保存。
2. 配制含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）。将 100 mL 10× PBS、900 mL 去离子水以及 1 mL 浓缩钙镁溶液（100 mg/mL CaCl₂•2H₂O，100 mg/mL MgCl₂•6H₂O）混合均匀。
3. 将鸡蛋以纵向方向置于培养箱中孵育至所需发育阶段，依据 Hamburger 和 Hamilton¹ 分期标准（例如，HH 5 期约为孵育 23–25 小时，HH 11–12 期约为 42–48 小时）。
4. 采用滤纸载体法从鸡蛋中取出胚胎。
   1. 将鸡蛋底部轻敲于直径 150 mm 的培养皿边缘，掰开蛋壳底部，将内容物倒入培养皿中。
   2. 使用钝头镊子去除蛋中较厚且黏稠的蛋清部分。
   3. 裁剪直径为 2–3 cm 的 Whatman #2 滤纸圆片，使用单孔打孔器在滤纸中央打孔。将滤纸环放置于蛋黄表面，使胚胎位于环中央孔洞下方并保持可见。
   4. 用显微剪刀沿滤纸外缘剪下，再用精细镊子将滤纸从蛋黄上取下。
   5. 用 PBS 轻柔冲洗胚胎，以去除附着的卵黄颗粒（HH5 期胚胎可能需要浸泡 15–20 分钟以彻底清除残留卵黄）。将滤纸组件从液体中取出，置于 35 mm 培养皿中，腹面朝上。在第一层滤纸环上叠加第二个滤纸环，使胚胎夹于两环之间。在外围套上金属环（直径约 1.5–2 cm），以固定胚胎。
   6. 将胚胎浸入培养基中，使用明场显微镜检查其形态是否正常及发育阶段是否准确。
5. 使用拉针仪制备尖端精细的玻璃针（内径 1.5 mm）（World Precision Instruments，Sarasota FL），用于后续组织解剖和标记操作。

2. 使用磁性铁颗粒对HH 5期胚胎进行DiI标记

1. 在室温下，向少量还原铁粉（Mallinckrodt Baker, Inc.，Phillipsburg, NJ）中加入几滴饱和的DiI酒精溶液，待其自然干燥。（通常在酒精蒸发后，颗粒会结块。）用拉制的微移液管尖端将结块的铁颗粒打散，转移至微量离心管中，用去离子水反复冲洗并浸泡。
2. 为标记HH 5期胚胎的外胚层细胞，将已取出的胚胎（即整个滤纸装置）背侧朝上置于盛有足量培养基的35 mm培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。使用玻璃针去除卵黄膜，暴露外胚层细胞。（注意不要刺破胚胎。）
3. 用巴斯德移液管吸取一列已标记的铁颗粒（悬浮于去离子水中）。在解剖显微镜下，将移液管尖端浸入液面以下，并置于胚胎正上方。用指尖缓慢来回滚动移液管，使颗粒从管中振落，均匀撒布于胚胎表面。
4. 当胚胎表面覆盖足够颗粒后，小心将其放入37°C培养箱中孵育约10分钟。取出胚胎，使用强磁铁去除表面颗粒。
5. 使用配备视频相机并设置适当滤光片的荧光显微镜，采集胚胎的明场和荧光图像，如图2A、B所示。
6. 观察标记密度。若需更高密度，可重复上述操作，增加颗粒用量并相应延长孵育时间。若标记过密，可在装有已标记颗粒的微量离心管中加入少量未标记铁颗粒，混匀内容物。使用新的胚胎重复标记过程，并再次评估标记密度。

3. 用于 HH11-12 胚胎光学相干断层扫描（OCT）成像的聚苯乙烯微球标记

1. 在35 mm的培养皿中，用PBS配制直径为10 μm的黑色微球溶液（Polysciences Inc., Warrington, PA）。（微球应足够大以在OCT成像中产生对比度，但又应足够小，使其尺寸接近单个细胞的量级。具体数值将根据所用OCT系统的分辨率和所研究的组织类型而有所不同。）通常每毫升PBS中加入一滴原液（2.6%固体含量的乳胶）即可。使用22号针头将该溶液吸入10 mL注射器中。涡旋振荡30秒，以确保微球均匀分散。
2. 使用计算机硬盘片对拉制的玻璃针尖进行磨边²。针尖直径应足够大，以使微球能够通过开口，但同时应尽可能小，以尽量减少注射过程中对组织的损伤。
3. 用注射器将微球溶液注入已磨边的玻璃针中。轻轻弹击微量移液管，确保溶液已到达针尖。
4. 使用显微操作器，将玻璃针置于与胚胎相同的视野中。应可见微球从移液管尖端缓慢流出。
   1. 若无微球从微量移液管中流出，可能是发生堵塞。此时应使用新的玻璃针重复步骤3.2–3.4。
   2. 若视野中微球过多形成遮蔽，则移液管尖端可能过宽。应更换新的移液管和新的胚胎，重复步骤3.2–3.4。
5. 将移液管尖端插入脑管腔内。注意不要刺穿组织的腹侧底部。当微球和液体进入管腔时，可见组织出现短暂性肿胀。这表明插管成功；此时应迅速撤出玻璃针。
6. 使用明场显微镜检查脑管内腔中微球密度是否足够。在进入第4节操作前，让微球沉降20–30分钟。

4. 数据采集

* 以下方法非常适用于上述荧光标记技术。然而，在使用微球标记技术时，样品在孵育箱与成像系统之间转移过程中微珠可能发生脱落。在此情况下，最好直接进行步骤 4.2（该步骤完全避免了样品的移动或扰动）。两种方法中，胚胎均在浸没于液体培养基的条件下进行培养。如果胚胎未完全浸没（某些传统组织培养技术即存在此情况），组织几何形态会因异常高的表面张力负荷而发生显著改变，导致应变分布无法准确反映正常的三维形态发生过程^{3, 4}。此外，将组织浸没在液体中还可防止光学相干断层扫描（OCT）成像时液-气界面产生的高对比度干扰，从而避免胚胎形态及标记物坐标的观察受到遮蔽。

1. 胚胎培养（常规）
   1. 获取首批图像（明场、荧光或OCT）后，将最多七个含有胚胎的35 mm培养皿放入一个150 mm的培养皿中，并将整个装置置于一个小塑料袋内。向袋内加入几滴去离子水以保持湿度，并用95% O₂ / 5% CO₂混合气体充满袋子。将胚胎置于37°C培养箱中（Queue Stabiletherm，Asheville，NC），培养至下一次成像时间点。使用此方法，可在同一天对多个胚胎进行实验。
2. 延时培养（自动化）
   1. 将标记好的胚胎放入Delta T培养皿中（外径35 mm，中央孔径23 mm，带锥形侧壁，玻璃厚度0.17 mm；Bioptechs，Butler，PA），内含1.2 mL培养基。
   2. 用玻璃盖盖住培养皿，并使用Bioptechs Delta T4培养皿控制器将其维持在37°C（防止冷凝）。通过Mini-Pump Variable Flow装置（Fisher Scientific）提供的95% O₂ / 5% CO₂混合气体持续灌流胚胎。在气体到达胚胎前，将其通入置于加热板（<100°C）上的去离子水中，以实现加热和加湿。该实验装置的示意图见图1。
   3. 设置软件以在用户指定的时间间隔自动采集图像。对于我们的荧光显微镜，使用Openlab软件（PerkinElmer，Waltham，MA）；对于OCT系统，则使用扫频光源Thorlabs软件（Newton，NJ）。由于该方法目前一次仅能处理一个延时实验，因此通常最好让此类培养过夜运行。可通过安装与成像系统的硬件和软件兼容的自动可移动载物台来克服此限制⁵。

5. 代表性结果：

在每次实验中，标签通过 Volocity（PerkinElmer）自动追踪，或通过 ImageJ（NIH）中的手动追踪插件进行手动追踪。在荧光标记技术中，我们使用 Matlab 程序 gridfit 对标记点坐标拟合二维曲面，从而计算形态发生表面应变^{6, 7}。随后采用标准公式将这些值转换至相关的胚胎坐标系中。 alternatively，在光学相干断层扫描（OCT）技术中，曲面由分割后的图像体数据生成（可通过 Matlab 或 Caret⁸ 等标准软件获得），并可在样本最大或最小曲率方向上计算应变⁹。

我们采用铁颗粒标记技术，对早期鸡胚头部褶皱形成过程中外胚层细胞的运动进行标记和追踪。如图2A所示，荧光标记的细胞分布于整个胚胎。在不同时间间隔下，分别采集了胚胎的明场和荧光图像 体外 培养。随后利用追踪标记的运动（图2B、C）计算头褶形成过程中动态变化的形态发生应变分布（图2D-F）。

同样，我们采用聚苯乙烯微球技术追踪早期鸡胚脑部中脑-后脑边界处的组织运动。如图3 B-D所示， bead的运动被追踪了6小时，并根据标记物坐标计算出表征组织在纵向和周向变形的应变。需要注意的是，该方法能够处理明显的三维变形，因为bead倾向于附着在脑内腔管腔的各个侧面上（图3A）。

图1. 延时组织培养装置示意图。

图 2. 利用追踪的荧光标记定量早期鸡胚中的二维组织形变。(A) 去除铁颗粒后 HH 5 期胚胎的明场/荧光叠加图像。DiI 标记的外胚层细胞（红色）分布于整个胚胎。(B,C) 使用 ImageJ 追踪标记细胞的运动。在胚胎坐标系（X,Y）中计算标记物的位移。注意，A 和 B 为同一图像。(D-F) 头褶形成过程中纵向应变分布的动态等高线图。相对于 HH 5 期（即 A 和 B）计算拉格朗日纵向应变，分别为孵育 (D) 75 分钟、(E) 120 分钟 和 (F) 165 分钟后的结果。这些应变描述了在 HH 5 期胚胎中原本沿 Y 轴方向的线元长度的变化。有关利用追踪标记坐标计算形态发生应变的更多细节，参见 Filas et al. (2007)⁶ 和 Varner et al. (2010)⁷。注意，C 和 F 为同一图像。比例尺 = 500 μm。

图 3. 量化早期鸡胚脑组织的三维形变。（A）黏附于脑管背侧（黑色箭头）和腹侧（白色箭头）的聚苯乙烯微球，在横截面中可清晰区别于周围组织。OCT 重建图像的腹侧视图显示了在（B）HH12 期和（C）培养 6 小时后，中脑-后脑边界附近的微球位置（M：中脑，H：后脑）。若干组微球被圈出，以突出显示组织的整体形变。（D）根据这些形变计算出的纵向（E_zz）和周向（E_θθ）拉格朗日应变。中脑-后脑边界处的正向纵向应变和负向周向应变反映了该区域在培养过程中发生轴向伸长和周向缩短。有关在形态发生过程中对复杂表面形态发生应变的计算更多细节，可参见 Filas et al. (2008)⁹。比例尺 = 200 μm。

讨论

两种组织标记技术被用于 体外孵化 早期鸡胚的培养。第一种方法利用磁性铁颗粒递送荧光脂溶性染料，可同时标记数百个细胞。然而，该方法目前与光学相干断层扫描（OCT）不兼容，因为荧光染料在OCT中通常与周围组织的对比度较低¹⁰因此，我们展示了一种使用聚苯乙烯微球标记组织以进行活体 OCT 时间序列分析的替代技术。该技术可生成三维数据集，但必须注意避免微球从组织上脱落。在适当的实验条件下采用这两种方法中的任何一种，均可实现可靠的组织标记。 体外孵化 早期胚胎发育。这两种方法均使用易于获取且相对低成本的材料（如铁粉、聚苯乙烯微球），可在形态发生过程中实现组织形变的定量分析。在这两种情况下，组织标记物均可被简便且可重复地应用于胚胎组织，且无需特殊设备，从而使该实验技术易于被领域内的新手所掌握。对所得数据进行可视化与分析（例如通过计算形态发生应变图）将有助于揭示您的模型系统中形态发生的力学机制。^{6, 7, 9, 11, 12}.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM — 高糖	Sigma-Aldrich	D5796
青霉素/链霉素/新霉素	Sigma-Aldrich	P4083
鸡血清	Invitrogen	16110-082
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D1408	10X
Whatman #2 滤纸	Whatman, GE Healthcare	1002 090	直径 90mm
玻璃微量移液管	World Precision Instruments, Inc.	TW150-6	内径 1.5mm
DiI	Invitrogen	D-282
低铁	Mallinckrodt Baker Inc.	5320
10 μm 直径微球（黑色）	Polysciences, Inc.	24294
Delta T 培养皿（用于延时培养）	Bioptechs	04200415B	厚度 0.17mm，黑色
Delta T4 培养皿控制器	Bioptechs	0420-4-03
Mini-Pump 可调流速装置	Fisher Scientific