本文介绍了早期鸡胚的表面标记及ex ovo组织培养技术。文中展示了适用于延时明场、荧光和光学相干断层扫描成像的技术方法。通过高时空分辨率追踪表面标记，能够在二维和三维条件下计算形态发生应变（形变）等运动学参数。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎上皮会经历复杂的形变（例如弯曲、扭转、折叠和拉伸），以形成早期胚胎的原始器官。在这些细胞层表面追踪标记点是估算形态发生量（如生长、收缩和剪切）的成熟方法。然而，并非所有表面标记技术都易于适配常规成像方式，且各自具有不同的优势与局限性。本文中，我们描述了两种标记方法，并展示了每种技术的应用价值。第一种方法利用磁性铁颗粒，同时在胚胎上施加数百个荧光标记，进而用于量化形态发生过程中的二维组织形变。第二种方法则使用聚苯乙烯微球作为非侵入性光学相干断层扫描（OCT）成像中的对比剂，以追踪三维组织形变。这些技术已在本实验室成功应用于研究早期头褶、心脏和大脑发育的物理机制，且应可广泛适用于多种形态发生过程。
方案
1. 一般实验准备
- 在超净工作台中配制组织培养用培养基。
- 稀释杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1 L 瓶装，含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺），加入 10 mL 青霉素/链霉素/新霉素抗生素。
- 用无菌移液管移除 100 mL DMEM，并加入 100 mL 鸡血清替代。
- 将含 10% 鸡血清和 1% 抗生素的 DMEM 分装至无菌的 15 mL 锥形离心管中，冷冻保存。
- 配制含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）。将 100 mL 10× PBS、900 mL 去离子水以及 1 mL 浓缩钙镁溶液（100 mg/mL CaCl2•2H2O，100 mg/mL MgCl2•6H2O）混合均匀。
- 将鸡蛋以纵向方向置于培养箱中孵育至所需发育阶段，依据 Hamburger 和 Hamilton1 分期标准（例如，HH 5 期约为孵育 23–25 小时，HH 11–12 期约为 42–48 小时）。
- 采用滤纸载体法从鸡蛋中取出胚胎。
- 将鸡蛋底部轻敲于直径 150 mm 的培养皿边缘，掰开蛋壳底部，将内容物倒入培养皿中。
- 使用钝头镊子去除蛋中较厚且黏稠的蛋清部分。 ....
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讨论
两种组织标记技术被用于 体外孵化 早期鸡胚的培养。第一种方法利用磁性铁颗粒递送荧光脂溶性染料，可同时标记数百个细胞。然而，该方法目前与光学相干断层扫描（OCT）不兼容，因为荧光染料在OCT中通常与周围组织的对比度较低10因此，我们展示了一种使用聚苯乙烯微球标记组织以进行活体 OCT 时间序列分析的替代技术。该技术可生成三维数据集，但必须注意避免微球从组织上脱落。在适当的实验条件下采用这两种方法中的任何一种，均可实现可靠的组织标记。 体外孵化 早期胚胎发育。这两种方法均使用易于获取且相对低成本的材料（如铁粉、聚苯乙烯微球），可在形态发生过程中实现组织形变的定量分析。在这两种情况下，组织标记物均可被简便且可重复地应用于胚胎组织，且无需特殊设备，从而使该实验技术易于被领域内的新手所掌握。对所得数据进行可视化与分析（例如通过计算形态发生应变图）将有助于揭示您的模型系统中形态发生的力学机制。6, 7, 9, 11, 12.
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM075200 和 R01 HL083393（LAT）基金的支持。我们感谢美国国立卫生研究院 T90 DA022871 项目以及 Mallinckrodt 放射学研究所为 BAF 提供的博士后资助，以及美国心脏协会 09PRE2060795 项目为 VDV 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM — 高糖 | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 青霉素/链霉素/新霉素 | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| 鸡血清 | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 滤纸 | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 直径 90mm |
| 玻璃微量移液管 | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 内径 1.5mm |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| 低铁 | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm 直径微球（黑色） | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T 培养皿（用于延时培养） | Bioptechs | 04200415B | 厚度 0.17mm，黑色 |
| Delta T4 培养皿控制器 | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump 可调流速装置 | Fisher Scientific |
参考文献
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
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