首先通过电生理学方法对神经元进行表征，然后吸出记录电极内神经元的胞质，进行逆转录-PCR分析，以检测神经递质合成酶、离子通道和受体的mRNA表达情况。
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本文内容
摘要
摘要
在哺乳动物中枢神经系统中，具有不同分子和功能特征的多种神经元相互混杂，难以分离，且通常无法通过形态学特征轻易识别。因此，分析特定类型神经元中的基因表达往往十分困难。本文介绍了一种将全细胞膜片钳记录技术与单细胞逆转录聚合酶链式反应（scRT-PCR）相结合的方法，用于分析黑质中不同类型神经元的mRNA表达谱。首先利用电生理技术记录单个神经元的神经电生理特性和功能特性；随后吸取已进行电生理鉴定的单个黑质神经元的胞质，进行scRT-PCR分析，以获得神经递质合成酶、受体和离子通道的mRNA表达谱。由于该方法具有高选择性和高灵敏度，因此在因缺乏合适抗体或蛋白表达水平过低而无法使用免疫组织化学时尤为适用。该方法也可应用于其他脑区的神经元研究。
方案
1. 脑切片制备
- 使用年轻的（15-40日龄）雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠。（我们也在小鼠中使用相同的方案。）在深度乌拉坦麻醉下，将动物断头，并迅速取出脑组织。然后使用Leica振动切片机（VT-1200S）切割出包含黑质中前部的300 μm厚冠状脑片。切片过程在冰浴、充氧的高蔗糖切割液中进行，切割液成分为（单位：mM）：220 蔗糖，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，25 NaHCO3，0.5 CaCl2，7 MgCl2，10 D-葡萄糖。溶液持续通入95% O2/5% CO2混合气体以维持氧合状态并保持pH值为7.4。整个操作过程中需保持切割液处于冰浴状态。
- 脑片被置于充满充氧人工脑脊液（aCSF）的孵育室中孵育，aCSF成分为（单位：mM）：125 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH2PO4，25 NaHCO3，2.5 CaCl2，1.3 MgCl2，10 D-葡萄糖。溶液持续通入95% O2/5% CO2混合气体以维持氧合状态并保持pH值为7.4。孵育温度先为34 °C，持续45分钟，随后降至室温，直至将脑片转移至记录室。
2. 黑质神经元的电生理特征鉴定
- 将一片脑切片转移至灌流有含氧人工脑脊液（aCSF）的膜片钳记录室中，灌流液温度维持在 32 °C。
- 使用 PC-10 拉制仪（Narishige，东京，日本）将经高压灭菌处理的硼硅酸盐玻璃毛细管（KG-33，内径 1.10 mm，外径 1.65 mm，King Precision Glass，Claremont，CA）拉制成记录电极，并用无 DNase 和 RNase 的去离子水（Fisher Scientific）配制的细胞内液（含 135 mM KCl、0.5 mM EGTA、10 mM HEPES、1.5 mM MgCl2，pH 调至 7.3）灌注电极。电极在浴液中的电阻为 2–3 MΩ。
- 根据其特有的解剖位置确定黑质区域（图 1A1-2）。在配备微分干涉差（Nomarski）光学系统和 60 倍水浸物镜的视频显微镜（Olympus BX51W1）下，选择黑质致密部（SNc）和黑质网状部（SNr）中的大细胞（可能为多巴胺能神经元和 GABA 能神经元）进行记录。形成吉欧姆级高阻封接的全细胞记录模式（图 1B1），可进行电流钳和电压钳分析。为最大限度减少 mRNA 降解，电生理记录时间应尽可能短暂（≤5 分钟）。一种可行方案是仅记录细胞膜电位和放电特性，以获取目标神经元的电生理特征图谱（图 B2-3），此类简短记录约需 1 分钟即可完成。
3. 细胞质吸出
- 在完成对 SNr GABA 和 DA 神经元的电生理特征鉴定与表征后，通过轻柔的口吸作用吸取细胞质。此过程中也可能吸出细胞核，导致基因组 DNA 污染。必须保持封接的紧密性不被破坏；否则，细胞外碎片（包括 mRNA）可能被吸入膜片电极内，污染细胞内容物。只要在 -70 mV 下维持电流的增加不超过 100 pA，即可认为封接完整性良好。
- 随后，通过折断移液管尖端并施加微弱正压，将吸取的细胞内容物排出至 0.2 mL 的 PCR 管中。每个 PCR 管收集一个细胞的内容物。接收细胞内容物后，预先在冰上冷却的收集用 PCR 管应立即放入 -20 °C 冰箱中。
- 为排除可能含有 mRNA 的细胞外碎片污染，将膜片电极插入组织但不实际吸取细胞质，随后对该电极内容物进行逆转录 PCR（RT-PCR）检测。
4. 逆转录（RT）
- 收集到适量神经元的细胞内容物后（通常为10-20个），应立即开始逆转录（RT），以最大限度减少mRNA的降解。
- 由于单个神经元的细胞内容物量过少，不进行RNA分离步骤。为去除可能存在的基因组DNA污染，先用DNase I对吸取的细胞内容物进行消化处理（加入5 μL DNase I和1.6 μL DNase I缓冲液，25 °C孵育5分钟）。随后加入1.2 μL 25 mM EDTA，并在75 °C孵育5分钟以灭活DNase I。
- 使用基于SuperScript III逆转录酶的Cells-Direct cDNA合成试剂盒（Invitrogen，表1）合成cDNA。在50 °C下进行第一链cDNA合成，反应持续50分钟；然后在85 °C孵育5分钟以终止反应，并加入1 μL RNase H在37 °C孵育20分钟以消化mRNA。所得单链cDNA可于-20 °C保存，用于后续PCR扩增。
- 通过设置不加逆转录酶的阴性对照（RT-minus对照）来验证基因组DNA是否被完全去除，该对照组中除逆转录酶缺失外，其余反应组分均与实验组完全相同。
5. 两步 PCR 扩增
- 引物根据 GenBank 中的序列设计。在可能的情况下，使用跨越内含子的引物对，以帮助检测基因组 DNA 污染。引物对序列列于 表2引物对的有效性应首先通过全脑 mRNA 进行验证，以确保产生阳性产物。所有引物均由 Integrated DNA Technologies（美国爱荷华州科勒尔维尔）合成。
- 在第一阶段， 5 μL 的 30 μL cDNA 在引物对存在下扩增 35 个循环表 2). 使用热循环仪（MasterCycler，Eppendorf， 表12分钟 94 °C 用于初始变性，然后进行35个循环：15秒、 94 °C 变性，30 秒，于 55°C 退火，以及45秒在 72°C 延伸7分钟以完成最终延伸。 Taq DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及PCR扩增所需的所有其他组分均由PCR超级混合液提供（Invitrogen，表1)
- 在第二轮 PCR 中，上一轮的产物作为 1 μL 来自第1个st 阶段PCR扩增用作模板，并使用与第一阶段相同的引物对（表2进行40个循环，延伸时间缩短至30秒。使用相同的PCR超混合液。
- 2 的 PCR 产物nd 阶段扩增产物通过2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭（0.05 mg/100 mL胶）或GelGreen在紫外光下显影，并拍照记录图 B4). 随后切下阳性条带，使用 Qiagen 提取试剂盒进行提取（表1）并进行测序，然后与已发表的目标基因序列进行比对。
6. 典型结果：
黑质致密部（substantia nigra pars compacta）和黑质网状部（pars reticulata）中的多巴胺（DA）神经元，以及邻近黑质网状部中的GABA投射神经元，具有不同的电生理特性（Zhou et al. 2006；Ding et al. 2011）。如图1B2所示，SNr GABA神经元表现出约10 Hz的高频自发放电，其动作电位基底持续时间约为1 ms。在注入超极化电流时，SNr GABA神经元对超极化电流刺激呈现微弱的去极化回弹，表明这些神经元中Ih电流表达较弱（图1B2）。相比之下，黑质DA神经元表现出低频（约2 Hz）的自发性放电，其动作电位基底持续时间约为3 ms。DA神经元在受到超极化电流刺激时还表现出明显的回弹现象，表明其Ih电流表达较强（图1B3）（Zhou et al. 2006；Ding et al. 2011）。
单细胞RT-PCR在电生理学鉴定的SNr GABA能神经元中检测到谷氨酸脱羧酶1（GAD1，GABA合成的关键酶，也是GABA神经元的标志物）的mRNA，但在多巴胺（DA）神经元中未检测到（图1B4,5）。相反，在电生理学鉴定的SNc和SNr DA神经元中检测到酪氨酸羟化酶（TH，多巴胺合成的关键酶，也是DA神经元的标志物）的mRNA，而在GABA神经元中未检测到（图1B4,5）。因此，单细胞RT-PCR结果证实了电生理学对神经元类型的鉴定。接下来，采用单细胞RT-PCR分析电压门控Kv3通道亚基Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4的表达情况。这些亚基可依据其组合方式形成具有不同特性的电压门控K+通道（Ding等，2011）。在图1B4所示的SNr GABA神经元实例中，检测到Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4的mRNA。在图1B5所示的SNr DA神经元实例中，仅检测到Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4的mRNA。在汇总的数据中，Kv3.1在SNr GABA神经元中的检出频率高于黑质DA神经元，表明在快速放电的SNr GABA神经元中Kv3.1表达水平更高（Ding等，2011）。
图 1. SNr GABA 能神经元与黑质 DA 能神经元的电生理学鉴定。A： 黑质区域可通过其独特的解剖位置进行识别。A1 显示使用 1X 物镜拍摄的冠状面尼氏染色切片中 SNc 与 SNr 的位置。方框区域由 10X 物镜拍摄，并如箭头所示居中显示。细胞密集的 SNc 与细胞稀疏的 SNr 清晰可辨。A2 显示使用 4X 物镜拍摄的活体未染色冠状切片中 SNc 与 SNr 的位置。细胞密集的 SNc 与细胞稀疏的 SNr 同样可清晰识别。VTA，腹侧被盖区。B1 显示在全细胞模式下对 SNr GABA 能神经元进行膜片钳记录。B2 显示在电流钳记录模式下 SNr GABA 能神经元典型的电生理特性。这些神经元可自发产生高频、短时程的动作电位，并对超极化电流注入表现出微弱的 Ih 介导的“下垂”反应（sag response）。B3 显示黑质 DA 能神经元在电流钳记录模式下的典型电生理特性。它们自发产生低频、长时程的动作电位，并对超极化电流注入表现出显著的 Ih 介导的“下垂”反应（箭头所示）。因此，SNr GABA 能神经元与黑质多巴胺能神经元可通过电生理学特征明确区分。B4 显示从电生理学鉴定的 SNr GABA 能神经元中获得的单细胞 RT-PCR 产物的凝胶图像。检测到谷氨酸脱羧酶 1（GAD1）mRNA，但未检测到酪氨酸羟化酶（TH）mRNA。该 SNr GABA 能神经元中可检测到 Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3 和 Kv3.4 的 mRNA。B5 显示在电生理学鉴定的 SNr DA 能神经元中通过单细胞 RT-PCR 检测到神经元 Kv3 通道的 mRNA。在该 SNr DA 能神经元中检测到 TH mRNA，但未检测到 GAD1 mRNA。同时检测到 Kv3.2、Kv3.3 和 Kv3.4 的 mRNA。B6 显示汇总数据。
7. 可能的假阴性和假阳性结果
根据我们的经验，多个因素可能导致单细胞逆转录 PCR（scRT-PCR）结果出现假阴性。这些因素包括因膜片钳电极尖端堵塞而未能吸取足够量的细胞质、RNase 污染以及 PCR 引物效率低下。膜片钳电极尖端堵塞通常可在视频监视器上观察到，并表现为接入电阻升高。通过充分灭活 RNase 并佩戴手套可避免 RNase 污染。PCR 引物的有效性应通过使用脑组织穿孔样品提取的总 RNA 进行验证（Zhou et al. 2008；Ding et al. 2011）。
由于我们在进行逆转录之前总是先用DNase处理样本，因此从未出现过假阳性结果。理论上，如果不进行DNase消化，当目的基因为无内含子结构，或引物对未跨内含子区域设计时，可能因基因组DNA污染而导致假阳性检测。
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讨论
本文所展示的脑片膜片钳记录与单细胞逆转录聚合酶链式反应（scRT-PCR）相结合的方法，为研究已明确特征的单个神经元中离子通道、受体以及神经递质合成关键酶的mRNA表达谱提供了优良的技术手段。当目标蛋白因表达水平过低和/或缺乏合适的抗体而无法通过免疫组织化学等其他方法检测和定位时，该方法尤为适用（Surmeier等，1996；Zhou等，2009）。scRT-PCR具有高灵敏度和高特异性，能够检测到丰度较低的mRNA（Surmeier等，1996）。此外，该方法还可实现基因表达与单个已鉴定神经元的电生理及功能特性之间的关联分析（Liss等，2001；Zhou等，2008，2009；Ding等，2011）。根据已有文献证据及我们的实践经验，该方法适用于神经系统中的各类神经元。
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01DA021194和R01NS058850。
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材料
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<强>表1. 关键试剂与设备
<强>表2. 大鼠神经元Kv3通道、酪氨酸羟化酶（TH）和谷氨酸脱羧酶1（GAD1）mRNA的单细胞逆转录PCR引物对参考文献
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
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