使用单细胞RT-PCR技术分析黑质神经元中电压门控钾通道mRNA的表达谱

摘要

首先通过电生理学方法对神经元进行表征，然后吸出记录电极内神经元的胞质，进行逆转录-PCR分析，以检测神经递质合成酶、离子通道和受体的mRNA表达情况。

摘要

在哺乳动物中枢神经系统中，具有不同分子和功能特征的多种神经元相互混杂，难以分离，且通常无法通过形态学特征轻易识别。因此，分析特定类型神经元中的基因表达往往十分困难。本文介绍了一种将全细胞膜片钳记录技术与单细胞逆转录聚合酶链式反应（scRT-PCR）相结合的方法，用于分析黑质中不同类型神经元的mRNA表达谱。首先利用电生理技术记录单个神经元的神经电生理特性和功能特性；随后吸取已进行电生理鉴定的单个黑质神经元的胞质，进行scRT-PCR分析，以获得神经递质合成酶、受体和离子通道的mRNA表达谱。由于该方法具有高选择性和高灵敏度，因此在因缺乏合适抗体或蛋白表达水平过低而无法使用免疫组织化学时尤为适用。该方法也可应用于其他脑区的神经元研究。

方案

1. 脑切片制备

1. 使用年轻的（15至40日龄）雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠。（我们也在小鼠中使用相同的实验方案。）在深度乌拉坦麻醉下，处死动物并迅速取出脑组织。然后使用Leica振动切片机（VT-1200S）切割出包含黑质中前部的300 μm厚冠状脑片。切片过程在冰浴、持续通氧的高蔗糖切割液中进行，切割液成分如下（单位为mM）：220蔗糖、2.5 KCl、1.25 NaH₂PO₄、25 NaHCO₃、0.5 CaCl₂、7 MgCl₂、10 D-葡萄糖。溶液持续通入95% O₂/5% CO₂混合气体以维持氧合状态，并将pH值保持在7.4。整个操作过程中需保持切割液处于冰浴状态。
2. 脑片被转移至孵育 chamber 中，置于持续通氧的人工脑脊液（aCSF）中孵育，其成分如下（单位为mM）：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH₂PO₄、25 NaHCO₃、2.5 CaCl₂、1.3 MgCl₂、10 D-葡萄糖。溶液持续通入95% O₂/5% CO₂混合气体以维持氧合状态，并将pH值保持在7.4。孵育条件为34 °C下孵育45分钟，随后在室温下保存，直至将脑片转....

讨论

本文所展示的脑片膜片钳记录与单细胞逆转录聚合酶链式反应（scRT-PCR）相结合的方法，为研究已明确特征的单个神经元中离子通道、受体以及神经递质合成关键酶的mRNA表达谱提供了优良的技术手段。当目标蛋白因表达水平过低和/或缺乏合适的抗体而无法通过免疫组织化学等其他方法检测和定位时，该方法尤为适用（Surmeier等，1996；Zhou等，2009）。scRT-PCR具有高灵敏度和高特异性，能够检测到丰度较低的mRNA（Surmeier等，1996）。此外，该方法还可实现基因表达与单个已鉴定神经元的电生理及功能特性之间的关联分析（Liss等，2001；Zhou等，2008，2009；Ding等，2011）。根据已有文献证据及我们的实践经验，该方法适用于神经系统中的各类神经元。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR