抗体染色 果蝇 蛹可增强对成虫腹部发育遗传学的基因分析。我们介绍了针对分期蛹的解剖、固定及抗体染色的实验方案。 黑腹果蝇 蛹腹部
本文内容
摘要
摘要
果蝇蛹腹部是研究上皮形态发生以及性二型形态发育的成熟模型系统1-3。在化蛹期间（约持续96小时，25 °C条件下），成虫盘细胞大量增殖，取代幼虫表皮，形成成虫腹部体节。这些成虫盘细胞在胚胎发育时期形成，在幼虫每个腹部体节中以成对的组织母细胞巢形式存在于侧部。四对组织母细胞巢分别发育为成虫背侧表皮（前、后背侧细胞巢）、腹侧表皮（腹侧细胞巢）以及各体节相关的气门（气门细胞巢）4。化蛹后，这些二倍体细胞（其体积小于较大的多倍体幼虫表皮细胞——LECs，因而可被区分）开始进行典型的增殖、迁移并逐步取代LECs的过程。可利用多种分子与遗传工具，研究参与成虫腹部形态发生的相关遗传通路的作用。通常在解剖成虫腹部表皮后分析最终的成虫表型。然而，对潜在分子过程的研究则需要对蛹期上皮组织进行免疫组织化学分析，而这面临独特挑战。动态变化的发育时序以及两种不同上皮细胞群体（幼虫与成虫盘细胞）之间的相互作用，导致组织脆弱，在解剖及后续处理过程中极易发生大量细胞丢失。我们已建立了一套针对果蝇蛹腹部上皮组织的免疫组织化学研究方法，包括解剖、固定、封片和成像步骤，可稳定获得高质量样品，适用于共聚焦显微镜或常规荧光显微镜观察。
方案
1. 第1天
开始前：
应采用标准培养方案维持健康的果蝇种群：在产卵3-4天后移除成虫，将培养瓶或培养管置于恒定温度下继续培养，直至三龄幼虫开始 wanderingrd 龄幼虫开始化蛹。幼虫/蛹的转变以预蛹的形成为标志（定义为化蛹后0小时，APF）。不动的蛹因其白色体色可与较老的蛹相区分，又因其椭圆形且略圆的形态以及前端气门突起，可与尚未开始化蛹的幼虫相区分。
您将需要：
- 用于收集蛹的画笔
- 培养蛹的湿润培养皿：内衬湿润纸巾并覆盖滤纸的培养皿，滤纸上标记不同收集时间点、基因型或蛹的性别
- 用于清洗蛹的1×磷酸盐缓冲液（PBS）
蛹的收集、培养与分期
- 使用湿润的画笔轻轻将0小时羽化后（APF）的蛹从培养瓶/小管中取出，并放入湿润室的盖子内。
- 用画笔蘸取1×PBS轻轻清洗蛹，以去除蛹壳表面的碎屑。
- 如有必要，可根据性别对蛹进行分选。可通过蛹的生殖腺原基来区分性别。雄性生殖腺原基为一对位于体侧的透明圆盘状结构，透过蛹体表皮在身体约三分之二处清晰可见5；雌性生殖腺原基较小，不易辨认。
- 将蛹放置于湿润室中标记合适的位置，并放回恒温环境中。培养至相应发育时间点。
2. 第2天：解剖、固定和一抗孵育
开始前：
您需要：
- 解剖体视显微镜
- 外科镊子
- 带11号刀片的外科手术刀
- 两个九孔玻璃凹面培养皿（Corning 产品编号 # 7220-85）
- 将其中一个培养皿的孔中加入1X PBS：用于清洗解剖后的蛹，作为冲洗皿
- 将第二个培养皿的孔中加入固定缓冲液
- 抗体孵育用湿盒。我们使用内衬湿润纸巾的塑料密封三明治盒。
- 固定缓冲液：1x PBS、4% 多聚甲醛、0.2% 脱氧胆酸（用于通透）
- 解剖平台：载玻片表面粘附一段双面胶
- 1X PBS
- p100 或 p200 移液器
解剖
- 用镊子轻轻逐个取出蛹，并将其放置在解剖平台上，使蛹的前端朝向胶带最宽的部分。若蛹表面过于湿润，应先用纸巾轻轻吸干。
- 在蛹尚未完全粘附于胶带前，使用画笔将其调整至合适位置。
- 让蛹自然风干并牢固粘附在胶带上（5–10 分钟）。
- 使用手术刀对每个蛹进行双侧解剖。最佳操作方式是从蛹的前端向后端快速完成一次切割。若操作正确，切口应同时穿过前部和后部的两对气门。每次解剖不超过10个蛹，以便能够迅速清洗样品，防止组织发生蛋白水解损伤。
- 用画笔将少量1X PBS转移至每个已解剖的蛹上，以使其从胶带上松动。
清洗、固定和一抗孵育
- 用一对手术镊夹住一只蛹的半个体，在显微镜载物台上将解剖平台替换为清洗皿，并立即将其浸入清洗皿的一个孔中。蛹壳应保留在样本上，直至处理完成并准备封片。
- 在仍用镊子夹持蛹半体的同时，使用移液器轻轻冲洗掉腹部的内部组织。清洗时压力过大可能导致上皮细胞丢失。
- 立即将清洗干净的蛹半体转移至室温的固定液中，并以相同方式处理其余蛹半体。经过练习后，20个蛹半体的解剖和清洗过程应在5分钟内完成。
- 让蛹在室温的固定液中孵育1小时。
- 用1× PBS缓冲液对固定后的蛹进行3次清洗，每次5分钟。
- 样本可立即进行免疫组织化学处理，或在-20°C条件下保存于100%乙醇中长达3个月，而不会导致细胞丢失或抗原表位活性下降。
- 如需保存样本，应在转移至100%乙醇前，于室温下依次经过PBS:EtOH（3:1、1:1、1:3）的梯度溶液平衡，每种比例溶液中平衡20分钟。
- 在进行免疫组织化学处理前，必须通过相反的梯度系列将样本重新平衡至PBS缓冲液中。
- 在加入一抗之前，将样本在1× PBS（添加2%牛血清白蛋白）中封闭1小时。
- 将一抗用1× PBS稀释至适当浓度后，在4°C条件下避光孵育过夜。
3. 第3天：二抗孵育、封片与成像
开始之前：
您将需要：
- 两把手术镊
- 封片介质（甘油、Vectashield [Vector Labs] 或 Slowfade Gold [Invitrogen]）
- 凹孔载玻片（0.8 mm）
- 盖玻片（24 × 40 mm）
二抗孵育与封片：
- 用 1× PBS 每次 10 分钟，洗涤样本 3 次。
- 在添加二抗前，将样本置于含 2% 牛血清白蛋白的 1× PBS 中封闭 1 小时。
- 将二抗用 1× PBS 稀释至适当浓度，在室温避光条件下孵育样本 3 小时，不摇动。
- 用 1× PBS 每次 10 分钟，洗涤样本 3 次。
- 如需要，可对蛹进行复染（例如，用 PBS 稀释的 DAPI [4',6-二脒基-2-苯基吲哚] 染色 10 分钟以标记细胞核）。
- 封片前，将样本在适当的封片介质中平衡至少 30 分钟。
- 准备样品载玻片。由于蛹的形态特点，无法进行平展封片。应将样本置于凹孔载玻片（滴片）的凹孔内进行成像。在凹孔内加入 75–100 µL 封片介质。单个载玻片可同时封载多个样本。
- 封片前必须将蛹壳从样本上去除。用镊子夹住单个蛹壳的前端，注意避免夹到内部的蛹膜。
- 用另一把镊子轻轻夹住头部区域的内部蛹膜，并将其从蛹壳中取出。
- 立即将样本转移至凹孔内，并继续处理其他样本。
- 使用探针或镊子将样本在凹孔内整齐摆放，使侧面向上。如有气泡，可用探针去除。
- 轻轻将盖玻片盖在样本上，注意避免产生气泡。
4. 代表性结果：
采用本方案制备的样品可保留成年腹部的整体形态。图像序列可投影生成二维图像，或进行三维重建以研究腹部拓扑结构。
图1. 分节基因产物在 果蝇 蛹 在蛹形成后26小时，使用小鼠抗Wg抗体（4D4：Iowa Hybridoma Bank）和抗GFP抗体对Wingless蛋白和Engrailed表达（En-gal4:uas-GFP）进行可视化。10倍放大，前部在左侧，背侧在上方。细胞核用DAPI复染。
投影了约50层图像（切片间的ΔZ为2.5μm）。
讨论
本视频中介绍的技术可用于制备不同发育时间点的黑腹果蝇（Drosophila）蛹。在羽化后24小时至32小时（APF）期间处理的蛹，其上皮细胞最容易发生脱落。在长时间孵育步骤中使用去垢剂（如Triton X-100和Tween-20）会增加细胞脱落的风险，因此不推荐使用。相反，在初始固定步骤中使用脱氧胆酸作为去垢剂。所有后续步骤均在1X PBS中进行，不添加去垢剂。此外，在长时间孵育过程中对样品进行振荡也会加剧细胞脱落，应予以避免。
可以使用共聚焦显微镜技术对样品进行成像。然而，按照上述方法处理的黑腹果蝇（Drosophila）蛹也可利用结构照明显微镜系统进行成像，所得图像质量可与共聚焦技术相媲美。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会的资助项目支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖体视显微镜 | |||
| 外科镊子 | |||
| 带11号刀片的外科手术刀 | |||
| 九孔玻璃凹面培养皿 | Corning | 7220-85 | |
| 蛹培养用湿室 | |||
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| 11号外科手术刀 | |||
| 双面胶带 | |||
| 固定缓冲液：1× PBS，4% 多聚甲醛，0.2% 脱氧胆酸（用于通透） | |||
| p100 或 p200 移液器 | |||
| 凹面载玻片（0.8 mm） |
参考文献
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
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