$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1。微观一个RT反应
- 在执行与RT反应的微观，RT反应所需的温度平衡的微混合器。
- 将微混合器内的37 ° C（或由RT供应商建议的温度）RT反应发病前至少1小时的孵化器。
- 根据逆转录供应商设置的RT组合（例如，自Qiagen Omniscript自Promega MMTV - RT）的说明，除了使用单细胞的金额，输入的总RNA（例如0.1-1pg/μl），而不是毫微微克供应商建议的数额。
- 我们使用标准的无菌，无核酸200μL薄壁PCR管。
- 位置RT管牢固地进入微混合器尽快搅拌。 RT反应时间应保持37℃孵化器内的微混合器。
- 选择适当的频率和幅度的微观混合。在这个例子中，我们使用150Hz的。
- 开关的微混合器，离开它为整个工期的RT反应（60分钟）。
- 开关的微混合器和采取的RT管RT反应完成后。
- 放在冰RT管，并进行进一步的应用，如定量聚合酶链反应（定量PCR或实时PCR）为正常。
2。代表性的成果:
在逆转录反应中的微观的好处是在使用时，其他的混合方法（如摇晃，震荡或trituration）cDNA的产量相对增加。可以看出，例如，随后的cDNA用定量聚合酶链反应（定量PCR或实时PCR）分析后。图2a给出了第5分钟的微观效应（蓝色，"micromixed5"）或整个60分钟（红色，"micromixed60"）与RT反应trituration前夕的RT孵化（黑色，"trituration相比" ）。在这种情况下，前面的RT反应体积为25μL，它包含2.5pg的总RNA。如上图所示，使用的引物设计到检测的cDNA代表Nurr - 1的mRNA的qPCR的痕迹和手段±周期，以达到在3重复这同样的实验50％的最大荧光中小企业绘制如下。星号表示差异有统计学意义（单向方差分析与杜克多重比较）。注意，前面的RT反应的前5分钟的微观生产比trituration非显着改善，而整个60分钟前RT反应的微观产生了显着的改善超过trituration，幅度约相当于15的qPCR周期，平均。
对微观混合的好处，也可以看出，在随后的qPCR产品获得熔解曲线分析。在图2b所示的实验，为整个60分钟前RT反应的微观导致在重复样本的qPCR信号（图2BA，2个红色的痕迹），而第5分钟，或只产生不一致的qPCR trituration的微观痕迹（图2BA，2个蓝色的痕迹和2个黑色的痕迹，分别）。灰色的痕迹，阴性对照组（"南德"）在其中的cDNA的qPCR反应。当从本实验的qPCR产品，通过提高他们的温度（即熔解曲线分析），它是明显的变性，适当的PCR产物（即是相同的，当浓度高得多的mRNA反转录和定量PCR扩增获得的扩增，数据未显示），目前只有以下RT，已为60分钟（图2BB，2个红色的痕迹）micromixed的反应。所有其他人（即micromixed5，trituration阴性对照）所产生的替代扩增产品（如引物二聚体）。
图1。申请的微观标准实验室RT反应的协议的流量图。涉及的物理原理，在微混合器，以及如何建立一个内部的微混合器提供更详细的描述中引用13,14
图2代表的qPCR数据显示的微观应用到前面的逆转录反应，包括在其他标准的实验室逆转录反应的单细胞的mRNA数量的好处 。一个比方的qPCR检测的cDNA代表Nurr - 1基因的mRNA编码的痕迹。前面的RT反应在25μL体积的总RNA中包含2.5pg，并在37℃，60分钟，在一个孵化器。逆转录反应混合的R triturationT组合前潜伏期（黑的痕迹，"trituration"），micromixed RT反应（蓝色的痕迹，"micromixed5"）在第5分钟，或为整个60分钟的RT反应micromixed的（红色的痕迹，"micromixed60" ）。平均值±中小企业的数量要求达到50％，最大荧光定量PCR周期曲线所示为n = 3的重复这个实验。星号表示显着性差异（单程与杜克多重比较方差分析）。 乙另一个qPCR的实验研究Nurr - 1基因的产品，这个时候包含在一个体积25μL25pg总RNA逆转录反应。 qPCR的痕迹（一）以及熔解曲线分析定量PCR获得的产品（B）所示为不同的搅拌条件下。还包括在没有基因包含在前面的RT反应的阴性对照（灰色的痕迹，"负"）。浓度高得多的mRNA RT反应也和生产micromixed60（二）（红色痕迹）样品相同熔解曲线峰（数据未显示）。