我们介绍一种新方法，可在标准实验室逆转录反应中，从单细胞数量级的 mRNA 获得更高产量的 cDNA。该方法的创新之处在于使用微混匀仪，利用声学微流现象，在微升级别上实现比振荡、涡旋或吹打更为有效的液体混匀。
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摘要
摘要
将基因表达与细胞行为相关联，最理想的是在单细胞水平上进行。然而，这很难实现，因为单个细胞中仅含有极少量且不稳定的mRNA（每个细胞总RNA为1-50皮克，其中mRNA占1-5%，即0.01-2.5皮克），这些mRNA在能够被逆转录为稳定的cDNA拷贝之前大多已经降解1。例如，使用标准实验室试剂和设备，每个细胞只能对少数基因进行定性评估2。提高标准实验室逆转录（RT）反应效率的一种方法——即在微升级体积中加入单细胞量级的mRNA——是更快速地混合试剂，以便在mRNA降解前将其转化为cDNA。然而，这并不容易，因为在微升级尺度下液体流动呈层流状态，目前常用的混合方法（如振荡、涡旋和吹打）无法产生足够的湍流来有效混合试剂。为解决这一问题，必须采用微尺度混合技术3,4。已有多种基于微流控的混合技术被开发出来，并成功提高了RT反应的cDNA产量5-8。但微流控技术需要专用设备，成本相对较高，尚未广泛普及。因此，人们更希望获得一种价格更低、使用更便捷的解决方案。本研究的主要目标是展示：将一种新型“微混合”技术应用于含有单细胞级别mRNA的标准实验室RT反应，可显著提高其cDNA产量。我们发现cDNA产量提高了约10至100倍，从而实现了：（1）每个细胞可分析的基因数量显著增加；（2）对基因表达进行更精确的定量分析；（3）在单细胞中更有效地检测低丰度基因。该微混合技术基于声学微流效应9-12，这是一种声波在小障碍物周围传播时在障碍物附近产生平均流动的现象。我们开发了一种基于声学微流效应的装置（“微混合器”），其关键简化在于：只要系统具有曲率半径较小的液-气界面，即可在音频频率下实现声学微流效应13。试管中微升级溶液的弯月面即可提供足够小的曲率半径。使用音频频率意味着硬件成本低廉且用途广泛13，同时不会像使用标准实验室超声波破碎仪那样损伤核酸及其他生化试剂。
方案
1. 反转录反应的微量混合
- 在使用微混匀进行逆转录反应之前，将微混匀仪预热至逆转录反应所需温度。
- 在开始逆转录反应前至少1小时，将微混匀仪放入37°C（或逆转录酶供应商推荐的温度）培养箱中平衡。
- 按照逆转录酶供应商（例如Promega的MMTV-RT、Qiagen的Omniscript）提供的说明配制逆转录反应体系，但使用单细胞量的总RNA作为输入（例如0.1–1 pg/μL），而不是供应商推荐的ng至μg量级。
- 我们使用标准的无菌、无核酸酶的200 μL薄壁PCR管。
- 一旦准备好混合，立即将逆转录反应管牢固地放入微混匀仪中。在整个逆转录反应过程中，微混匀仪应始终保持在37°C培养箱内。
- 选择适当的微混匀频率和振幅。本示例中我们使用150 Hz。
- 启动微混匀仪，并在整个逆转录反应期间（60分钟）保持开启状态。
- 逆转录反应完成后，关闭微混匀仪并取出反应管。
- 将反应管置于冰上，并按常规进行后续操作，如定量聚合酶链式反应（qPCR或实时PCR）。
2. 代表性结果：
在逆转录（RT）反应中，微混合（micromixing）的优势在于与其它混匀方法（如振荡、涡旋或吹打）相比，能够提高cDNA的产量。这一点可以在后续使用定量聚合酶链式反应（qPCR或实时PCR）对cDNA进行分析时观察到。图2A展示了在RT反应开始后的前5分钟内进行微混合（蓝色，“micromixed5”）或在整个60分钟内持续微混合（红色，“micromixed60”）的效果，并与RT孵育前立即进行吹打混匀（黑色，“trituration”）的情况进行了比较。本实验中，RT反应体系总体积为25μL，其中含有2.5pg总RNA。上方显示的是使用特异性引物检测代表Nurr-1 mRNA的cDNA所获得的qPCR扩增曲线，下方则绘制了三次重复实验中达到最大荧光强度50%所需循环数的平均值±标准误（SEM）。星号表示具有统计学显著性差异（采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验）。需要注意的是，在RT反应的前5分钟进行微混合相较于吹打仅产生非显著性的提升；而在整个60分钟RT反应过程中持续微混合则相较于吹打显著提高了cDNA产量，其提升幅度平均相当于约15个qPCR循环。
在获得的后续qPCR产物的熔解曲线分析中，也可以观察到微混合的优势。在图2B所示的实验中，RT反应前60分钟全程进行微混合，所得qPCR信号在重复样本中保持一致（图2Ba，2条红色轨迹），而仅在前5分钟进行微混合或仅进行吹打混匀则产生不一致的qPCR轨迹（图2Ba，分别为2条蓝色轨迹和2条黑色轨迹）。灰色轨迹为阴性对照（“neg.”），即qPCR反应中未加入cDNA。当对该实验的qPCR产物进行升温变性（即熔解曲线分析）时，可以明显看出，只有经过60分钟微混合的RT反应才生成了正确的PCR产物（即与使用高得多的mRNA浓度进行逆转录并经qPCR扩增所获得的扩增子完全相同的产物，数据未显示）（图2Bb，2条红色轨迹）。其余各组（即微混合5分钟、吹打混匀以及阴性对照）均产生了非特异性扩增产物（如引物二聚体）。
图1. 将微混匀技术应用于标准实验室RT反应的流程图。有关所涉及物理原理、微混匀器以及如何自制微混匀器的更详细描述见参考文献13,14
图2. 典型qPCR数据，展示在标准实验室逆转录（RT）反应中，对单细胞量mRNA应用微混合技术所带来的优势。A 检测代表Nurr-1基因mRNA的cDNA的qPCR扩增曲线示例。之前的RT反应体系中包含2.5 pg总RNA，反应体积为25 μL，在37°C孵育60分钟。RT反应在孵育前通过吹打混匀（黑色曲线，“吹打”）、在RT反应前5分钟进行微混合（蓝色曲线，“微混合5”）或在整个60分钟RT反应期间持续微混合（红色曲线，“微混合60”）。下方图示为本实验重复3次（n=3）后，达到50%最大荧光强度所需qPCR循环数的均值±标准误（SEM）。星号表示存在显著差异（单因素方差分析，Tukey多重比较检验）。B 另一项qPCR实验，检测Nurr-1基因cDNA产物，此次RT反应中包含25 pg总RNA，反应体积为25 μL。展示了不同混匀条件下获得的qPCR扩增曲线(a)以及qPCR产物的熔解曲线分析结果(b)。同时包括未在RT反应中加入cDNA的阴性对照（灰色曲线，“neg.”）。还进行了更高mRNA浓度的RT反应，其熔解曲线峰（数据未显示）与“微混合60”（红色曲线）样本在(b)中的峰完全一致。
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讨论
本文所述将微混合技术应用于标准实验室逆转录（RT）反应的方法，当然可以涉及通过任何方法（例如细胞裂解、激光捕获显微切割）提取的mRNA。该方法也可包含任何品牌或类型的逆转录试剂、任何温度（在微混合器材料耐受范围内）以及任意反应时间。例如，我们已观察到，使用随机六聚体引物或寡聚dT引物进行的逆转录反应，其cDNA产量有所提高。该技术还可应用于其他符合以下限制条件的生化转化过程（例如DNA杂交15）。当前技术的主要限制在于，反应必须发生于形成弯曲液-气界面（例如弯月面）的微升体积液滴内。我们常规在200μL薄壁PCR管中使用10或25μL的反应体积，分别产生曲率半径为4.7或6.9 mm的弯月面。这是在液滴内建立涡流所普遍要求的条件，该涡流可拉长不同溶液之间的界面，从而使扩散在更短的时间尺度上完成。因此，这一限制适用于所有可能使用微混合技术的情形。实际上，使用小体积可能具有优势，因为输入材料（例如RNA、DNA）的量通常有限，同时还能显著节省其他试剂。在提高逆转录反应产量的具体情境下，反应中还必须包含限量的mRNA。我们已证明，在输入RNA为单细胞量级的情况下，对标准实验室逆转录反应进行微混合，其cDNA产量比标准混合...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（项目资助号：6288480）和斯科比与克莱尔·麦金农信托基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 从快速冷冻的急性制备成年小鼠中脑切片中提取总RNA | |||
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | Arcturus Bioscience | KIT0204 | 该试剂盒现可从 Applied Biosystems 购得 |
| 无DNA的DNase处理与去除试剂 | Ambion | AM1906M | |
| 随机六聚体引物 | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP 混合物 | Promega公司 | U1240 | |
| RNasin 核糖核酸酶抑制剂 | 普洛麦格公司 | N2111 | |
| 无核酸酶水 | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR 绿色 PCR 预混液 | 应用生物系统公司 | 4309155 | |
| Hprt 前向引物（20mer）：CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt 反向引物（20mer）：TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 正向引物（23mer）：CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 反向引物（23mer）：GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | 科贝特生命科学 | Corbett生命科学公司于2008年7月被QIAGEN收购 |
参考文献
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重印与许可
