利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

摘要

我们描述了一种从环境病毒群落中有效分离单链DNA、双链DNA和RNA分子的方法。该方法利用含磷酸盐缓冲液浓度递增的羟基磷灰石色谱对核酸进行分级分离。此方法可实现从环境样品中分离出所有类型的病毒核酸。

摘要

病毒，尤其是噬菌体（phages），是地球上数量最多的生物实体^1,2。病毒可调节宿主细胞的丰度和多样性，参与营养物质的循环，改变宿主细胞的表型，并通过基因的水平转移影响宿主细胞和病毒群落的进化³。大量研究已揭示了病毒在多种自然环境中惊人的遗传多样性及其功能潜力。

宏基因组学技术已被用于研究包含单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA基因型的复杂病毒群落的分类多样性及其功能潜力^4-9。目前用于研究环境样本中含DNA或含RNA病毒的文库构建方案，通常需要进行初始的核酸酶处理，以去除非目标模板¹⁰。然而，要全面理解病毒群落的整体基因组成及其多样性，必须掌握所有成员的信息，而不论其基因组组成如何。对纯化的核酸亚型进行分级分离，为研究病毒群落提供了一种有效的方法，同时避免了部分群落遗传特征的丢失。

自20世纪60年代以来，羟基磷灰石（一种结晶态的磷酸钙）已被用于核酸、蛋白质及微生物的分离¹¹。通过利用羟基磷灰石中带正电荷的Ca²⁺离子与核酸亚型中带负电荷的磷酸骨架之间的电荷相互作用，可实现不同核酸亚型的独立洗脱。我们近期应用该策略，在DNA测序前独立分离含有单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA病毒的基因组¹²。本文中，我们介绍一种利用羟基磷灰石层析法从混合病毒群落中分离并回收ssDNA、dsDNA和RNA病毒核酸的方法。

方案

1. 溶液的配制

在进行羟基磷灰石柱层析之前，必须配制磷酸盐缓冲液，并对羟基磷灰石进行充分水化处理。

1. 1 M 磷酸盐溶液，pH 6.8：在1 L烧瓶中，将119.98 g一水合磷酸二氢钠溶于1 L无菌、经DEPC处理的H₂O中₂O. 在1L容量瓶中，将141.96 g磷酸氢二钠溶于1L无菌DEPC处理的H₂O中，配制1M磷酸氢二钠溶液。₂O. 按1:1比例混合单体和二聚体溶液。将烧瓶置于搅拌器上，使用磁力搅拌子进行混合。通过添加氢氧化钠（提高pH）或磷酸（降低pH）将pH调节至6.8。
2. 0.12 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml烧瓶中，加入30 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的DEPC处理水至225 ml。调节pH至6.8。再用无菌的DEPC处理水定容至250 ml。高压灭菌。
3. 0.18 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml 锥形瓶中，加入45 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的、经DEPC处理的H₂O定容至500 ml。₂O 至 225 ml。调节 pH 至 6.8。加入无菌的 DEPC 处理过的 H₂O 至 250 ml。高压灭菌。
4. 0.20 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的、经DEPC处理的H₂O定容至500 ml。₂加水定容至225 ml，调节pH至6.8。加入无菌的DEPC处理过的H₂O 至 250 ml。高压灭菌。
5. 0.40 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml烧瓶中，加入100 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的DEPC处理过的H₂O定容至500 ml。₂O至225 ml。调节pH至6.8。加入无菌的DEPC处理过的H₂O 至 250 ml。高压灭菌。
6. “1.00 M 磷酸盐缓冲液”（该溶液中磷酸盐的实际浓度为 0.91 M）：在 500 ml 锥形瓶中，加入 30 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的 DEPC 处理水至终体积为 225 ml。调节 pH 至 6.8。加入无菌的 DEPC 处理水₂O 至 250 ml。高压灭菌。
7. 羟基磷灰石水化：称取1 g羟基磷灰石，加入50 ml离心管中。加入6 ml 0.12 M磷酸盐缓冲液至羟基磷灰石中，颠倒混匀。使用前将温度升至 60°C 并充分混匀。长期储存于 4°C.
8. 使用前，将所有磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石平衡至 60°C.

2. Econo-Column 的制备

1. 关闭活塞。用去离子水反复冲洗层析柱数次。₂通过反复倒置柱子并倾倒来完成。
2. 从 Econo 柱上取下旋塞，并对柱体进行高压灭菌以实现灭菌。
3. 更换并关闭活塞。向无菌Econo柱中加入1 ml Sigmacote，润湿所有玻璃表面。打开活塞，倾倒去除。
4. 将色谱柱连接至循环水浴，并将温度设定为 60°C为尽量减少柱体的热量散失，建议使用铝箔或泡沫管绝缘材料等隔热剂对柱体进行包裹。
5. 用无菌、无RNase的H冲洗Econo柱两次₂然后用无菌、无RN酶的0.12 M磷酸盐缓冲液洗涤两次。

3. 羟基磷灰石层析

1. 确保旋塞处于关闭状态，使用无菌的 2ml 血清移液管将 2ml 预先配制并重悬的羟基磷灰石缓慢加入 Econo 层析柱底部。
2. 让羟基磷灰石在重力作用下自然沉降 30 分钟。
3. 排出层析柱中的缓冲液并关闭旋塞。将核酸与 0.12M 磷酸盐缓冲液混合至终体积为 500 μl，并在加热块或水浴中 60°C 孵育 10 分钟。
4. 使用 2ml 血清移液管将用 0.12M 磷酸盐缓冲液配制的核酸快速加至羟基磷灰石上，注意不要扰动柱床。
5. 让核酸与羟基磷灰石结合 30 分钟。
6. 在层析柱下方放置一个 15ml 离心管，打开旋塞，收集含有单链 DNA 的初始流出液，然后关闭旋塞。
7. 向羟基磷灰石中加入 6ml 0.12M 磷酸盐缓冲液，注意不要扰动柱床，打开旋塞，从上一步的 15ml 管中收集单链 DNA，然后关闭旋塞。
8. 向收集的管中加入 1 体积的酚:氯仿:异戊醇（25:25:1 v/v/v）溶液，剧烈混匀后在 3500 × g 离心 15 分钟。将含有单链 DNA 的上清液转移至新的 15ml 离心管中。
9. 使用 6ml 0.20M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以从柱中洗脱并纯化 RNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。
10. 使用 6ml 0.40M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以从柱中洗脱并纯化双链 DNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。
11. 使用 6ml 1.00M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以彻底洗脱柱中残留的任何双链 DNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。

4. 核酸样品脱盐

1. 将4-5 ml样品转移至配备30,000分子量截留超滤膜（Ultracel膜）的Amicon Ultra-4离心过滤装置中。
2. 在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。
3. 将剩余样品加入Amicon Ultra-4离心过滤装置中，并用无RNase的1× TE缓冲液补加体积至4-5 ml。
4. 在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。
5. 向Amicon Ultra-4离心过滤装置中加入4-5 ml无RNase的1× TE缓冲液。在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。
6. 重复步骤5共额外5次，以彻底去除核酸样品中的盐分。
7. 将剩余样品转移至无菌的1.7 ml离心管中。加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 7.0）、两倍体积的100%乙醇以及1 μl Glycoblue。充分涡旋混匀。
8. 在28,000 × g、4°C条件下离心60分钟。小心倾去上清液，避免扰动沉淀。加入300 μl 70%乙醇，在28,000 × g、室温下离心10分钟。倾去乙醇，干燥后将各组分重悬于适量体积的无RNase TE缓冲液中。

5. 代表性结果：

图1总结了利用羟基磷灰石层析从混合病毒群中分离单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA核酸的方法。该方法利用核酸中带负电荷的磷酸骨架与羟基磷灰石中带正电荷的Ca²⁺离子之间的电荷相互作用，通过逐步提高磷酸盐缓冲液浓度，可有效分离不同类型的核酸（ssDNA、dsDNA和RNA）¹²。

羟基磷灰石分级分离 体外 已知的单链DNA（M13mp18）、双链DNA（lambda）以及RNA（MS2和phi6）病毒基因组组成的“群落”如图2所示。这些核酸以相等浓度混合后上样至羟基磷灰石柱，并采用浓度递增的磷酸盐缓冲液进行洗脱。每种核酸亚型均独立洗脱，相邻组分间的残留转移少于9%。

该技术应用于从切萨皮克湾采集的病毒群落中分离的核酸的示例如下所示 图3. 将从纯化病毒中提取的总核酸产量上样至羟基磷灰石柱。单链DNA（ssDNA）、RNA和双链DNA（dsDNA）的基因组物质分别用0.12 M、0.20 M和0.40 M/1.00 M浓度的磷酸盐缓冲液独立洗脱。双链DNA在0.40 M和1.00 M磷酸盐浓度下被洗脱，在本例中其含量相较于单链DNA和RNA基因型在病毒群落中占主导地位。该结果与海洋及河口环境中病毒群落组成的预期一致，此类环境中可回收的核酸大部分为双链DNA。 ¹³.

图1. 羟基磷灰石色谱法分离核酸的流程示意图。将单链DNA、双链DNA和RNA的混合物溶于0.12 M磷酸盐缓冲液中，加热至60°C，然后上样至羟基磷灰石柱，柱温通过循环水浴维持在恒定的60°C。通过逐步增加含磷酸盐缓冲液的浓度，将核酸（单链DNA、RNA和双链DNA）从羟基磷灰石上洗脱下来。该图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）¹²。

图2. 使用羟基磷灰石层析分离已知病毒核酸。将等浓度的M13mp18单链DNA、MS2单链RNA、phi6双链RNA和lambda双链DNA（分别为第2–5泳道）混合后上样至羟基磷灰石柱（第6泳道）。单链DNA（M13mp18）、RNA（MS2/phi6）和双链DNA（lambda）分别用0.12 M（第8泳道）、0.18 M（第9泳道）和0.40 M/1.00 M（第10泳道）进行洗脱。使用1 kb DNA ladder（第1和第7泳道）确认基因组大小。该图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）¹²。

图3. 从切萨皮克湾某一微生物群落中分离出的病毒核酸。核酸经提取后上样至羟基磷灰石柱，分别使用0.12 M、0.20 M和0.40 M/1.00 M的磷酸盐缓冲液，依次洗脱出ssDNA（泳道0.12M）、RNA（泳道0.20M）和dsDNA（泳道0.40M/1.0M）。使用Hi Mass DNA Ladder（泳道L1）和1kb Ladder（泳道L2）对核酸的大致分子量和质量进行直观确认。本图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）¹²。

讨论

本文介绍的羟基磷灰石色谱方法是一种高效且稳健的技术，适用于在研究群落的总核酸组成时，从混合病毒群组中分离核酸。通常情况下，单链DNA（ssDNA）、RNA和双链DNA（dsDNA）将分别在磷酸盐缓冲液浓度高于约˜ 0 M、0 M和0.40 M时从色谱柱中洗脱出来。然而，每批羟基磷灰石的组成和洗脱特性可能略有差异，因此使用已知的核酸（例如来自可培养病毒制备物）对每批材料进行测试至关重要。这将使操作者能够确定洗脱目标核酸所需的含磷酸盐缓冲液的具体浓度。

该技术的一个限制因素是羟基磷灰石中可用于结合核酸磷酸骨架的可用 Ca²⁺ 离子数量。柱中羟基磷灰石的载样量可根据水夹套柱的尺寸和所用羟基磷灰石的量进行放大或缩小，洗脱缓冲液体积也可相应调整，以适应极少量或极大量的输入核酸，但最终受限于水夹套柱的尺寸。

此外，一种将核酸、羟基磷灰石和含磷酸盐缓冲液在离心管中混合，然后低速离心的批量处理方法，也可用于分离目标核酸。该策略在某些情况下可能具有优势，但其可靠性不如色谱法，后者更为准确，并能实现更好的核...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
经济型层析柱	Bio-Rad	737-0717	0.7cm 内径，每包/2 根
羟基磷灰石	Bio-Rad	130-0520	DNA 级 Bio-Gel HTP 凝胶，100g/td>
磷酸二氢钠	VWR international	VW1497-01	一水合物，晶体，500g
磷酸氢二钠	VWR international	VW1496-01	无水，粉末，500g
DEPC 处理水	Invitrogen	AM9922	1L
10% SDS 溶液	Invitrogen	24730-020	超纯级，1L
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9262	pH 8.0，1L
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
2ml 血清移液管	VWR international	89130-884	聚苯乙烯，无菌
BD Falcon 离心管	VWR international	21008-936	15ml，无菌
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1 v/v/v)	Invitrogen	15593-031	超纯级，100ml
Amicon Ultra-4 离心浓缩装置	EMD Millipore	UFC803024	Ultracel-30 膜
20X TE 缓冲液，RNase free	Invitrogen	T11493	100ml
蓝色糖原（Glycoblue）	Invitrogen	AM9516	15mg/ml