分离单链DNA，双链DNA和RNA病毒使用羟基磷灰石色谱从环境社区

摘要

我们描述了独立于环境病毒社区的单链DNA，双链DNA和RNA分子的有效方法。核酸是分次使用含有磷酸盐缓冲液浓度的增加羟基磷灰石色谱。这种方法允许所有病毒从环境样品中的核酸类型的隔离。

摘要

病毒，尤其是噬菌体（噬菌体），是地球^上 1,2数量最多的生物实体。病毒调节宿主细胞的丰富性和多样性，促进养分循环，改变宿主细胞的表型，影响宿主细胞和病毒通过基因的^横向转移3社区的演变。大量的研究有突出的病毒和它们在各种自然环境的功能潜力惊人的遗传多样性。

宏基因组技术已被用于研究生物分类的多样性和复杂的病毒，其成员中含有单链DNA（单链DNA），双链DNA（dsDNA）的和RNA ^的基因型4-9的组合功能的潜力。当前协议，用于研究环境的DNA含有或RNA含有病毒库的建设需要一个初始的核酸治疗，为了消除非定^标模板10。然而，一个全面的了解病毒的社会和病毒的多样性集体的基因补充，需要所有成员的知识，不论基因组组成。分馏纯化核酸亚型提供了一个有效的机制来研究不牺牲社会的基因特征的一个子集的病毒组合。

羟基磷灰石，磷酸三钙的结晶形式，已受聘于核酸的分离，以及蛋白质和微生物，自1960年^以来 11 。通过利用带正电荷的^钙 2的电荷相互作用的羟基离子和带负电荷的核酸亚型的磷酸骨架，它是可以优先洗脱每个独立于其他的核酸亚型。我们最近采用这一战略的独立分馏，准备DNA ^测序 12单链DNA，双链DNA和RNA含有病毒的基因组。在这里，我们提出了一种单链DNA，双链DNA和RNA病毒核酸病毒混合组合使用羟基磷灰石chromotography分馏和恢复的方法。

方案

1。制备解决方案

在执行羟基磷灰石色谱之前，必须准备和磷酸盐缓冲液必须正确水合羟基磷灰石。

1. 1M磷酸溶液，pH为6.8:溶解在1L容量瓶119.98克磷酸二氢钠，在1L无菌DEPC _处理的H 2 O准备在1L容量瓶一个1M钠磷酸氢二钠溶液溶解在1L无菌DEPC处理的H ₂ O磷酸钠二元141.96克在以1:1的比例，结合单和DI -解决方案。将烧瓶上不小的轰动板和混合使用磁力搅拌棒。调节pH值至6.8，加入氢氧化钠（增加pH值）或磷酸（以降低pH值）。
2. 0.12M磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升30毫升。添加无菌DEPC处理水的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理水至250ml。高压灭菌。
3. 0.18M磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升45毫升。添加无菌DEPC处理的H ₂ O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H ₂ O至250ml 。高压灭菌。
4. 020的磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升50毫升。添加无菌DEPC处理的H ₂ O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H ₂ O至250ml 。高压灭菌。
5. 0.40 M磷酸缓冲液:在500ml烧瓶中，100毫升2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升结合起来。添加无菌DEPC处理的H ₂ O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H ₂ O至250ml 。高压灭菌。
6. "1.00M磷酸缓冲液"（实际浓度的磷酸盐，在这个解决方案是91万）:在500ml烧瓶中，结合30毫升1M磷酸溶液，pH6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），2.5毫升，5ml的0.5M EDTA。添加无菌DEPC处理水的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H ₂ O至250ml 。高压灭菌。
7. 羟基磷灰石水化:重出1克的羟基磷灰石，并添加至50ml管。 6毫升的0.12M磷酸盐缓冲液添加羟基磷灰石和颠倒混合。之前使用带来的温度为60℃，调匀。长时间储存​​在4 ° C
8. 在使用之前，在60 ° C平衡所有的磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石

2。经济柱的制备

1. 关闭活塞。与去离子H _{2 O}冲洗多次反相柱和调迁列多次。
2. 从经济型列删除活塞和高压灭菌消毒列。
3. 更换和关闭活塞。添加Sigmacote1毫升无菌的Econo列和大衣所有的玻璃表面。打开活塞和倒出。
4. 列循环水浴，设定温度为60 ° C。 einsure跨列列的包装，如铝箔或泡沫保温管，绝缘剂的热损失量最少的是建议。
5. 冲洗两次的Econo列无菌，无RNase H _{2 O，}然后两次无菌，无RNase 0.12M磷酸缓冲液。

3。 Hydroxypaptite Chromotography

1. 确保活塞是封闭的，慢慢加入事先准备好的，悬浮羟基磷灰石2毫升的Econo柱底部使用无菌2毫升血清吸管。
2. 允许羟基磷灰石重力下为30分钟解决。
3. 排列，并关闭活塞的缓冲。 0.12M磷酸盐缓冲液核酸结合在一个终体积为500μL孵育在60 ° C时在加热块或水浴10分钟。
4. 快速申请准备在0.12M磷酸盐缓冲液中的羟基磷灰石（使用2毫升血清吸管，确保不打扰列）的核酸。
5. 允许核酸绑定到30分钟的羟基磷灰石。
6. 列下放置一个15毫升管，打开活塞，收集初始样本含有单链DNA。关闭活塞。
7. 0.12M磷酸盐缓冲液添加6毫升一定不要去打扰列，打开活塞，并在上一步15毫升管收集的单链DNA的羟基磷灰石。关闭活塞。
8. 加入1体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:25:1，V / V / V）溶液管，混合大力离心15分钟，并在3500 XG。上清含有单链DNA转移到一个新的15毫升管。
9. 重复使用020磷酸盐缓冲至E6毫升3.76和3.87琵琶和列净化RNA一定要使用一个新的15毫升管收集。
10. 使用6毫升的0.40M磷酸盐缓冲液洗脱和净化一定要使用一个新的15毫升管收集的列的双链DNA重复3.76和3.87。
11. 重复使用1.00M磷酸盐缓冲地带的任何残余的双链DNA一定要使用一个新的15毫升管收集列的6毫升3.76和3.87。

4。脱盐核酸酸样品

1. 传输样品45毫升一个Amicon超4离心过滤设备与装备切断Ultracel膜的重量为30,000分子。
2. 集中样品<500μL纺纱6000 XG，30℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。
3. 其余样品（S）的Amicon Ultra - 4的离心式过滤装置，并带来了量高达45毫升用RNase免费1X TE缓冲液。
4. 集中样品<500μL纺纱6000 XG，30℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。
5. 45毫升的RNase免费1X TE缓冲液添加的Amicon Ultra - 4的离心过滤设备。 6000 XG，30离心浓缩样品<500μL℃，5分钟（或直到集中量达到）在一个固定角度转子。丢弃流量通过。
6. 重复步骤4.5一个额外的5倍，完全淡化核酸样品（S）。
7. 将剩余的样本（S）1.7毫升无菌Eppendorf管。新增的十分之一体积3M醋酸钠，pH值7.0，两卷100％的乙醇，Glycoblue加入1μl。由涡旋混合。
8. 28000 XG，4℃，60分钟离心。倒出作出一定不要去打扰颗粒。 70％的乙醇添加300μL。自旋为28,000 XG，室温为10分钟。倒出，干燥，​​并在适当体积的无RNase的TE缓冲液重悬每个分数。

5。代表性的成果:

图1总结了从混合病毒组合使用羟基磷灰石色谱分馏的单链DNA，双链DNA和RNA的核酸提出的方法。这种方法是利用电荷相互作用之间的核酸带负电荷的磷酸骨架和带正电的^{CA 2} +离子目前在羟基磷灰石和核酸亚型的有效分离（单链DNA，双链DNA和RNA），允许用磷酸盐缓冲液浓度增加^12。

在体外的"社区"已知的单链DNA（M13mp18），双链DNA（λ）和RNA的羟基磷灰石的分离（MS2和phi6）病毒的基因组如图2所示。核酸结合在平等的浓度，适用于羟基磷灰石柱和洗脱使用的磷酸盐缓冲液浓度的增加。每个核酸亚型洗脱独立于其他与低于9％，从一小部分结转下。

这项技术的应用从切萨皮克湾收集到了病毒社会的孤立的核酸如图 3所示。羟基磷灰石柱分离纯化病毒总核酸产量。独立的单链DNA，RNA和双链DNA组成的基因材料与0.12M，020和0.40M/1.00M的磷酸盐缓冲液浓度分别洗脱。双链DNA洗脱0.40M和1.00M磷酸盐浓度，在这种情况下，占主导地位这一病毒的社区相比，单链DNA和RNA的基因型。这个观察是符合预期的海洋病毒群落组成和河口环境大多数可收回核酸双链^13。

图1。核酸分馏的羟基磷灰石色谱法的流程图。在0.12M磷酸盐缓冲液制备的单链DNA，双链DNA和RNA的混合物加热至60 ° C，并应用到一个羟基磷灰石柱保持在恒定的60℃使用循环水洗澡。 （单链DNA，RNA和双链DNA）核酸是由羟基磷灰石洗脱与一个含有磷酸盐缓冲浓度的增加。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年^12。

图2。使用羟基磷灰石色谱已知的病毒核酸的分离。平等浓度M13mp18单链DNA，MS2的ssRNA，phi6双链RNA和lambda双链DNA（泳道2-5分别）相结合（6车道），并应用到羟基磷灰石柱。 SINGLE -双链DNA（M13mp18），RNA（MS2/phi6）和双链DNA（λ）分别独立使用0.12M（8车道），0.18M（9巷）和0.40M/1.00M（10巷）羟基​​磷灰石柱洗脱从。一个1KB的阶梯（1车道，7）是用来确定基因组大小。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年^12。

图3:从社会孤立的切萨皮克湾内的病毒核酸的分离。核酸分离并应用到羟基磷灰石柱。单链DNA（巷0.12M），RNA（020道）和双链DNA（车道0.40M/1.0M）独立使用0.12M，020万和0.40M/1.00M的磷酸盐缓冲液浓度，分别洗脱。您好地下DNA梯状条带（巷L1）和1KB梯（车道二级），用于直观地确认近似分子量和核酸的质量。由美国微生物学协会的许可，这个数字已被复制，最初是在安德鲁斯- Pfannkoch等功能。 2010年^12。

讨论

羟基磷灰石色谱这里介绍的方法是核酸病毒混合的组合，当目标是研究社会的总核酸组成的分馏的高效和强大的工具。一般来说，单链DNA，RNA和双链DNA列PHO磷酸盐缓冲液浓度比约〜0and 0.40M分别洗脱。然而，每一个羟基磷灰石的制备可以有一个稍微不同的组成和流出曲线，所以重要的是测试每个准备使用已知的核酸（例如，从耕地的病毒编写）。这将允许用户以确定具体含有磷酸盐缓冲液洗脱所需的核酸浓度。

该技术的限制因素是可用数量的Ca ^{2 +}离子在羟基磷灰石，可以结合核酸的磷酸骨架。 capacityamount的列中的羟基磷灰石可以扩大或下降到列（水套列，并用羟基磷灰石量的大小决定），洗脱使用的缓冲区数量可以扩展，以容纳很小或大量输入的核酸，但最终是有限的水套列的大小。

此外，一批技术，核酸，羟基磷灰石，并含有磷酸盐缓冲液在管，混相结合，并在低速离心是一个有针对性的核酸分离的另一种方式。这种策略可能是有益的，但​​在某些情况下，是不是更准确和提供更好的分馏核酸的色谱方法的可靠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称	公司	目录编号	目录编号
柱的Econo -	Bio - Rad公司	737-0717	0.7厘米编号封装/ 2
羟基磷灰石	Bio - Rad公司	130-0520	DNA的二级生物凝胶HTP凝胶，100g/td>
磷酸钠，二氢	VWR	VW1497 - 01	一水，水晶500克
磷酸三钠，磷酸氢二铵	VWR	VW1496 - 01	无水，粉末500克
DEPC处理过的水	Invitrogen公司	AM9922	1L
10％SDS溶液	Invitrogen公司	24730-020	超纯水，1L
0.5M EDTA	Invitrogen公司	AM9262	pH值8.0，1L
Sigmacote	Sigma - Aldrich公司	SL2 - 25ML
2毫升血清pippette	VWR	89130-884	聚苯乙烯，无菌
屋宇署猎鹰离心管	VWR	21008-936	15毫升，无菌
酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，V / V / V）	Invitrogen公司	15593-031	超纯，100毫升
Amicon超4离心设备	Millipore公司	UFC803024	Ultracel - 30膜
20X TE缓冲液，核糖核酸酶自由	Invitrogen公司	T11493	100毫升
Glycoblue	Invitrogen公司	AM9516	15mg/ml