分离单链DNA，双链DNA和RNA病毒使用羟基磷灰石色谱从环境社区

摘要

我们描述了独立于环境病毒社区的单链DNA，双链DNA和RNA分子的有效方法。核酸是分次使用含有磷酸盐缓冲液浓度的增加羟基磷灰石色谱。这种方法允许所有病毒从环境样品中的核酸类型的隔离。

摘要

病毒，尤其是噬菌体（噬菌体），是地球^上 1,2数量最多的生物实体。病毒调节宿主细胞的丰富性和多样性，促进养分循环，改变宿主细胞的表型，影响宿主细胞和病毒通过基因的^横向转移3社区的演变。大量的研究有突出的病毒和它们在各种自然环境的功能潜力惊人的遗传多样性。

宏基因组技术已被用于研究生物分类的多样性和复杂的病毒，其成员中含有单链DNA（单链DNA），双链DNA（dsDNA）的和RNA ^的基因型4-9的组合功能的潜力。当前协议，用于研究环境的DNA含有或RNA含有病毒库的建设需要一个初始的核酸治疗，为了消除非定^标模板10。然而，一个全面的了解病毒的社会和病毒的多样性集体的基因补充，需要所有成员的知识，不论基因组组成。分馏纯化核酸亚型提供了一个有效的机制来研究不牺牲社会的基因特征的一个子集的病毒组合。

羟基磷灰石，磷酸三钙的结晶形式，已受聘于核酸的分离，以及蛋白质和微生物，自1960年^以来 11 。通过利用带正电荷的^钙 2的电荷相互作用的羟基离子和带负电荷的核酸亚型的磷酸骨架，它是可以优先洗脱每个独立于其他的核酸亚型。我们最近采用这一战略的独立分馏，准备DNA ^测序 12单链DNA，双链DNA和RNA含有病毒的基因组。在这里，我们提出了一种单链DNA，双链DNA和RNA病毒核酸病毒混合组合使用羟基磷灰石chromotography分馏和恢复的方法。

方案

1。制备解决方案

在执行羟基磷灰石色谱之前，必须准备和磷酸盐缓冲液必须正确水合羟基磷灰石。

1. 1M磷酸溶液，pH为6.8:溶解在1L容量瓶119.98克磷酸二氢钠，在1L无菌DEPC _处理的H 2 O准备在1L容量瓶一个1M钠磷酸氢二钠溶液溶解在1L无菌DEPC处理的H ₂ O磷酸钠二元141.96克在以1:1的比例，结合单和DI -解决方案。将烧瓶上不小的轰动板和混合使用磁力搅拌棒。调节pH值至6.8，加入氢氧化钠（增加pH值）或磷酸（以降低pH值）。
2. 0.12M磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升30毫升。添加无菌DEPC处理水的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理水至250ml。高压灭菌。
3. 0.18M磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0.5M EDTA5毫升45毫升。添加无菌DEPC处理的H ₂ O的225毫升量。调节pH值至6.8。添加无菌DEPC处理的H ₂ O至250ml 。高压灭菌。
4. 020的磷酸盐缓冲液:在500ml烧瓶中，结合2.5毫升，pH值6.8，10％的十二烷基硫酸钠（SDS），1M磷酸溶液，0....

讨论

羟基磷灰石色谱这里介绍的方法是核酸病毒混合的组合，当目标是研究社会的总核酸组成的分馏的高效和强大的工具。一般来说，单链DNA，RNA和双链DNA列PHO磷酸盐缓冲液浓度比约〜0and 0.40M分别洗脱。然而，每一个羟基磷灰石的制备可以有一个稍微不同的组成和流出曲线，所以重要的是测试每个准备使用已知的核酸（例如，从耕地的病毒编写）。这将允许用户以确定具体含有磷酸盐缓冲液洗脱所需的核酸浓度。

该技术的限制因素是可用数量的Ca ^{2 +}离子在羟基磷灰石，可以结合核酸的磷酸骨架。 capacityamount的列中的羟基磷灰石可以扩大或下降到列（水套列，并用羟基磷灰石量的大小决定），洗脱使用的缓冲区数量可以扩展，以容纳很小或大量输入的核酸，但最终是有限的水套列的大小。

此外，一批技术，核酸，羟基磷灰石，并含有磷酸盐缓冲液在管，混相结合，并在低速离心是一个有针对性的核酸分离的另一种方式。这种策略可能是有益的，但​​在某些情况下，是不是更准确和提供更好的分馏核酸的色谱方法的可靠。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料名称	公司	目录编号	目录编号
柱的Econo -	Bio - Rad公司	737-0717	0.7厘米编号封装/ 2
羟基磷灰石	Bio - Rad公司	130-0520	DNA的二级生物凝胶HTP凝胶，100g/td>
磷酸钠，二氢	VWR	VW1497 - 01	一水，水晶500克
磷酸三钠，磷酸氢二铵	VWR	VW1496 - 01	无水，粉末500克
DEPC处理过的水	Invitrogen公司	AM9922	1L
10％SDS溶液	Invitrogen公司	24730-020	超纯水，1L
0.5M EDTA	Invitrogen公司	AM9262	pH值8.0，1L
Sigmacote	Sigma - Aldrich公司	SL2 - 25ML
2毫升血清pippette	VWR	89130-884	聚苯乙烯，无菌
屋宇署猎鹰离心管	VWR	21008-936	15毫升，无菌
酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，V / V / V）	Invitrogen公司	15593-031	超纯，100毫升
Amicon超4离心设备	Millipore公司	UFC803024	Ultracel - 30膜
20X TE缓冲液，核糖核酸酶自由	Invitrogen公司	T11493	100毫升
Glycoblue	Invitrogen公司	AM9516	15mg/ml