一种三维克隆形成实验方法，可使类似胰腺的前体细胞分化为表达胰岛素的克隆集落。该方法利用含有甲基纤维素、Matrigel 和生长因子的半固体培养基，使单个前体细胞在其中增殖并分化。 体外，从而实现对群体中功能性前体细胞数量的定量分析。
本文内容
摘要
摘要
胰腺干细胞与前体细胞生物学领域的发展一直受到缺乏特异性标记物的阻碍 体外 功能性和定量分析方法，可用于单细胞分析。对单个前体细胞的分析至关重要，因为这些分析能够明确无误地证实各个前体细胞的谱系分化潜能。尽管已有方法可在悬浮培养条件下由单细胞生成“胰腺类球体”（pancreatospheres），但仍存在若干局限性。首先，对大量细胞进行单细胞接种操作耗时较长，同时需要大量培养基和培养空间。其次，对所形成的胰腺类球体进行计数十分费力，尤其是在启动类球体形成的前体细胞频率较低时。第三，胰腺类球体实验难以在同一个培养孔中有效支持胰腺前体细胞的增殖与分化，从而限制了该实验方法的应用价值。
为了克服这些局限性，本研究报告了一种基于半固体培养基的胰腺前体细胞克隆形成实验方法。该方法借鉴了造血细胞克隆形成实验中的现有概念，即利用甲基纤维素增加培养基的黏度，使前体细胞在增殖和分化过程中能够保持在三维空间中。为了从异质性细胞群体中富集表达胰岛素的克隆形成前体细胞，我们采用了表达神经源性基因3（Ngn3）的细胞，Ngn3是胰腺内分泌前体细胞的标志物。我们分离了由小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化而来的、携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的Ngn3表达细胞，并将多达25,000个细胞接种至低吸附性的24孔培养板中。每孔含有500 μL半固体培养基，其主要成分为：甲基纤维素、Matrigel、烟酰胺、艾塞那肽-4、激活素βB以及从小鼠胚胎干细胞分化而来的类胰腺细胞收集的条件培养基。经过8至12天的培养后，形成了具有典型形态的表达胰岛素的细胞克隆，可进一步通过定量RT-PCR和免疫荧光染色分析其胰腺相关基因表达，以确定每个克隆的谱系组成。
综上所述，我们的集落形成实验可对异质细胞群体中的功能性前体细胞进行简便的检测与定量。此外，半固体培养基的形式可使细胞外基质组分和生长因子均匀地作用于细胞，从而支持前体细胞在体外增殖和分化。in vitro。该集落形成实验为在单细胞水平上深入研究胰腺前体细胞的分子机制提供了独特的机会。
方案
1. 小鼠胚胎干细胞向胰腺样细胞的分化 体外 用于集落形成实验的条件培养基（CM）的制备
小鼠胚胎干细胞的维持、在悬浮培养中形成拟胚体（EB）以及进一步分化的贴壁培养步骤此前已有描述1-3，并非本报告的重点。我们所用分化方案中涉及步骤的示意图见图1。
为了获得高质量的条件培养基，首先需要制备培养6天的拟胚体（EB），其中至少30-40%的EB直径应达到150 μm或以上。在光学显微镜下，较大的EB应可见深色斑点，提示其分化程度增强（图2）。选择高质量的胎牛血清（FCS）对于生成此类EB至关重要。高质量FCS批次的筛选依据是其在后续阶段（第18-20天）支持EB向胰岛素1、胰高血糖素及淀粉酶2A基因表达分化的潜力，该潜力通过RT-PCR分析检测确定。此外，当将第6天的EB从悬浮培养转移至贴壁培养时（每孔约80-100个EB，使用6孔板），应轻柔地旋转培养板，使第6天的EB聚集于孔的中央。原因尚不明确，但可增强细胞间接触的操作有助于在后续贴壁培养阶段由EB更有效地发育为类胰腺样细胞。
- 在培养第13天，将贴壁培养基（DMEM/F-12 (1:1)，15% 去除血清替代物，2 mM L-谷氨酰胺，50 U/mL 青霉素，50 μg/mL 链霉素）更换为新鲜的含有10 mM 烟酰胺、0.1 nM 艾塞那肽-4 和 10 ng/mL 人重组激活素ßB 的贴壁培养基（所有浓度均为终浓度）。
- 在培养第16天，收集步骤1.1中的培养基，并通过0.2 μm 聚醚砜膜过滤。从此步骤起，所收集的培养基称为条件培养基（CM）。将CM分装至15 mL Falcon离心管中，并在半固体培养前（见下文第3节）保存于-80°C。
2. 使用荧光激活细胞分选仪获得单细胞悬液中的胰腺样前体细胞
一种敲入型小鼠胚胎干细胞系4，命名为 Ngn3-EGFP，其中 EGFP 报告基因取代了 Ngn3 基因座的一个等位基因，其分化过程如前所述2。Ngn3 是一种含碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结构域的转录因子，在胚胎发育过程中由胰腺内分泌前体细胞表达5。通常在第16天对培养物进行分选，以获得已分化的 Ngn3-EGFP+ 和 Ngn3-EGFP- 细胞1,2。
- 将分化细胞解离为单细胞悬液。
- 用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 孵育第 16 天的培养物（3 分钟，37°C），使细胞从培养孔中脱落。
- 加入 10% 胎牛血清（FCS）以终止胰蛋白酶活性。
- 用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的无镁无钙磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将细胞团块与 4 mg/mL 胶原酶 B 和 2000 U/mL 脱氧核糖核酸酶（DNase）I 在 37°C 下孵育 30 分钟，以获得单细胞悬液。每 10 分钟使用 1000 μL 移液器吹打细胞沉淀，以加速解离过程。
- 用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤细胞，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于含 0.1% BSA 的 PBS 中。
- 分选前细胞准备。
- 每毫升细胞悬液中加入 2 μL DNase I（1 MU/mL），防止细胞在分选过程中重新聚集。
- 将单细胞悬液通过 40 至 70 μm 的滤网，以去除大的细胞聚集体。
- 向单细胞悬液中加入 DAPI（终浓度 1 μg/mL）。
- 在细胞分选仪上获取流式细胞术数据。本报告使用 MoFlo MLS（Beckman Coulter）细胞分选仪。
- 分选时细胞群体的设门策略。首先根据前向散射光与侧向散射光（图 3A）对 Ngn3-EGFP+ 和 Ngn3-EGFP- 细胞进行设门，随后为 DAPI 与侧向散射光（图 3B）、脉冲宽度与侧向散射光（图 3C），最后为 FL1 与自发荧光（图 3D）。为了在分选过程中减少 Ngn3-EGFP- 细胞的污染，Ngn3-EGFP+ 细胞的最终分选门有意右移（图 3E；箭头所示）。作为阴性对照设门，可使用 Ngn3-EGFP ES 系的第 6 天拟胚体，或非转基因系（如 TL1 ES 细胞）在相同发育阶段（第 16 天）的培养物（图 3D，左图）。
- 分选 Ngn3-EGFP+ 和 Ngn3-EGFP- 细胞。
3. 将分选后的细胞接种至半固体培养基
- Matrigel 准备。
- 将 Matrigel 分装为每管 1 mL，并在使用前储存于 -20°C。
- 冷冻分装物应在使用前置于 4°C 过夜，或置于冰上 3 小时以充分解冻。解冻后的分装物在半固体培养基制备过程中必须始终保持在冰上，以防止重新凝固。
- 甲基纤维素溶液（3.3%）的制备。
甲基纤维素粉末不能进行高压灭菌。为获得无菌的甲基纤维素溶液，在制备过程中应使用洁净的称量舟以及经高压灭菌的搅拌子、烧杯、烧瓶和其他器具。- 在制备甲基纤维素溶液的前一天，将 200 mL 无菌双蒸水置于 4°C 预冷。同时，制备含 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 500 mL 2x DMEM/F12 培养基（通过将 DMEM/F-12 粉末溶解于双蒸水中制得），并储存于 4°C。
- 在制备甲基纤维素溶液当天，将 500 mL 无菌双蒸水加入一个 1000 mL 玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖杯口。加热煮沸至少 30 分钟，以去除水中的气泡。
- 将一个大尺寸搅拌子（长度至少 3 英寸）放入 2000 mL 玻璃烧瓶中。
- 量取 300 mL 沸水并转移至该烧瓶中。
- 将烧瓶置于磁力搅拌器上（不加热）。缓慢搅拌热水，以避免产生气泡。
- 称取 33 克甲基纤维素粉末，并极缓慢地将其加入热水中。使用热水对于有效润湿甲基纤维素粉末并促进其在低温下的后续溶解至关重要。
- 持续搅拌直至温度降至约 40–45°C。
- 向冷却中的甲基纤维素混合液中加入 200 mL 冷的无菌双蒸水。此后应立即观察到溶液逐渐变为透明且黏稠，表明甲基纤维素正在溶于水相。手动轻轻旋转烧瓶，确保溶液充分混匀。
- 加入 500 mL 冷的 2x DMEM/F12 培养基。继续手动旋转混匀。
- 将烧瓶置于低温室内的磁力搅拌器上，缓慢搅拌甲基纤维素溶液 24–48 小时。
- 将溶液分装至每瓶 125 mL 的储存瓶中，并于 -20°C 保存。应取少量溶液接种于无菌培养皿中，置于 37°C 培养箱内检测无菌性。解冻后的甲基纤维素溶液可在冰箱中保存最多 2 个月。
- 条件培养基的制备。
使用前即刻解冻 CM（见第 1 节）。在半固体培养基制备过程中，始终将 CM 置于冰上。 - 准备以下生长因子：1.0 M 烟酰胺、0.1 μM 艾塞那肽-4、10 μg/mL 重组人激活素 βB 和 10 μg/mL VEGF-A。将烟酰胺和艾塞那肽-4 储存于 -20°C，激活素 βB 和 VEGF-A 储存于 -80°C，并在使用前立即解冻。所有半固体培养基组分在铺板过程中均应保持在冰上。需注意，后续研究发现添加 VEGF-A 对克隆形成并非必需。2
- 胎牛血清的制备。使用前应对 FCS 进行热灭活。将 FCS 在 56°C 水浴中孵育 30 分钟，以灭活补体蛋白。若初始 FCS 原液体积超过 500 mL，应分装为每瓶 125 mL。增大表面积有助于整个体积受热均匀且彻底。在储存至 -20°C 前，让瓶子在室温下冷却至少 1 小时。解冻后的 FCS 在使用前需经 0.2 μm 滤膜过滤。
- 将分选后的细胞与培养组分混合。
在整个制备过程中，始终将细胞和所有半固体培养基组分置于冰上，以防止 Matrigel 提前凝固。所有接触 Matrigel 的耗材，包括移液枪头、注射器和针头，均应预冷。这些耗材应在使用前至少半小时置于 -20°C。- 确定在 24 孔板中每孔接种的细胞数量。每孔最多可接种 25,000 个细胞。在初始实验中可进行细胞密度梯度测试，以确定最佳接种细胞数。
- 按照表 1 所列顺序，将培养组分加入带螺帽的 5 mL 聚苯乙烯管中（注意：细胞最后加入，以避免过早刺激）。先加入 3.3% 甲基纤维素溶液，最后加入分选后的细胞。需注意，3.3% 甲基纤维素溶液应使用 16½ 号针头和带有明确刻度的注射器吸取并加入聚苯乙烯管中。通常，为准确量取黏稠溶液（如 3.3% 甲基纤维素溶液及最终培养混合液）的体积，应先在注射器内吸入部分溶液，然后立即推出以排出空气。若 3.3% 甲基纤维素溶液难以吸取，可将其短暂升温至室温。但加入聚苯乙烯管后、添加 Matrigel 前，必须将其重新冷却至冰上。
- 接种含分选细胞的半固体培养基。
- 确认聚苯乙烯管盖已拧紧后，用手剧烈而彻底地振荡管子。此过程会产生气泡。
- 将管子置于冰上 5 分钟，或直至小气泡上浮消失。
- 使用 1 mL 注射器配 16½ 或 18½ 号针头吸取管内液体。参照第 3.6.2 节建议，准确吸取黏稠溶液并避免注射器内混入空气。
- 缓慢向每个 24 孔板的孔中加入 500 μL 培养基。仅使用低吸附 24 孔板。将培养基直接加至孔中央。半固体培养基会自动在孔内铺展。为获得具有统计学意义的结果，每个实验样本通常设四个重复孔。仅使用水平放置的 24 孔板中最内侧的 4 列孔进行培养。其余孔中加入无菌水，以维持含细胞培养环境的湿度。
- 将细胞置于 37°C、5% CO2 条件下培养。
- 生长因子的延迟添加。可在培养开始后添加生长因子。此类操作可用于研究特定生长因子对细胞存活的影响。每孔最多可使用 1 mL 注射器配 26 G 3/8 针头滴加 100 μL 生长因子溶液，并使其自然扩散进入半固体培养基。
4. 在光学显微镜下观察菌落形成
铺板后应立即观察细胞，以确保单个细胞在孔中随机且均匀分布。如果大多数细胞或形成的克隆聚集在孔的边缘，则表明将半固体培养基加入孔中时力度过大（参见第3.7.4节）。由于弯月面效应，培养孔边缘区域的克隆密度可能高于中心区域。
- 菌落数量的定量。由于培养基具有三维特性，菌落会出现在不同的焦平面上。因此，在光学显微镜下观察时，可能需要针对每个菌落调整焦距。计数时，在24孔板下方附上网格，以避免重复计数同一菌落。可通过切割NUNC培养皿（货号：169558）的皿壁制备网格。应使用光学显微镜的10倍物镜观察并计数菌落。
5. 典型结果：
先前的实验表明，起始培养 2.5 × 105 个鼠源 R1 ES 细胞（总体积为 50 mL 培养基）时，预计可在第 6 天生成约 5000 个大小合适的拟胚体（EB）。Ngn3-EGFP ES 细胞的效率较低，需要使用 4 倍数量的细胞才能在第 6 天获得相似大小的拟胚体。由于 25 个第 6 天的拟胚体平均含有 1.88 ± 0.67 × 105 个细胞1，因此从 5000 个拟胚体中可获得约 37.6 × 106 个细胞。在贴壁培养过程中，细胞预计扩增 2.72 ± 0.32 倍1。因此，在分选前，5000 个第 6 天的拟胚体可产生约 100 × 106 个第 16 天的细胞。经过设门分析后，Ngn3-EGFP+ 细胞约占第 16 天细胞总数的 10%（方案文本第 2.2.5 节及图 3）。
图4展示了从小鼠ES细胞获得的表达胰岛素的克隆的显微照片示例。这些克隆具有独特的形态特征：呈微小（约60–100 μm）圆形克隆，克隆内的单个细胞体积小、染色深，且不具折光性。在我们先前的研究2中，通过实时RT-PCR以及对单个手工挑选克隆进行双重免疫荧光染色，证实了胰岛素、C肽和胰高血糖素的表达。这些结果表明，单个Ngn3-EGFP+细胞能够分化为同时含有至少两种胰岛激素的细胞，类似于原始的第一波样内分泌细胞。
单细胞集落形成实验可用于研究具有启动增殖与分化能力的前体细胞 体外 （图5）。因此，该检测方法可测量单个前体细胞的内在功能。具有形成胰岛素表达克隆能力的前体细胞被称为胰岛素表达克隆形成单位（ICFUs）（图5）。这一结果与Ngn3标记发育中胰腺内分泌前体细胞的观点一致，5 Ngn3-EGFP+，但不包括 Ngn3-EGFP- 来自mES细胞分化群体的细胞富含ICFUs。2 然而，这些前体细胞的频率仍然较低，约占总Ngn3-EGFP的0.1%至0.6%+ 第16天培养物中分离的细胞群体为ICFUs。2 尽管如此，预计Ngn3-EGFP在集落形成效率上存在明显差异+ 细胞中最高，其次是预分选细胞，然后是 Ngn3-EGFP- 细胞
图1. 时间线 体外 小鼠ES细胞向胰腺样细胞的分化。条件培养基（CM）的制备：小鼠ES细胞在含15% FCS的培养液中悬浮培养前六天，同时逐步降低单硫甘油（6.0 × 10⁻⁴ mol/L至1.5 × 10⁻⁴ mol/L）的浓度。-3 M 的前两天以及 6.0 x 10-4 在接下来的四天中）以生成拟胚体（EBs）。将第6天的拟胚体（每孔80–100个）转移至含15% knockout血清替代物的贴壁6孔板中。在培养的第6至第10天之间可添加5% FCS以促进拟胚体的贴壁。随后在培养第13天向培养基中加入烟酰胺、exendin-4和人重组activin βB（见第1.1节）。在培养第16天收集培养基，此时培养基已成为条件培养基。将第16天的细胞进行分选后接种至半固体培养基中进行集落形成实验。
图 2. 从小鼠胚胎干细胞衍生的第6天大胚状体的代表性显微照片。理想的第6天胚状体直径至少为150 μm，且具有变暗的中心区域（箭头所示）。这些胚状体中早期胰腺前体细胞标志物（如Pdx-1和Sox9）的表达增强（数据未显示）。3
图3. mES细胞来源的第16天Ngn3-EGFP表达细胞的分选门控。（A）前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）门控分别反映细胞大小和颗粒度，用于排除非细胞碎片。（B）使用DAPI鉴定死细胞，其在405-413 nm激发后，通过450/40滤光片检测发射光时呈阳性染色。（C）脉冲宽度（即前向散射电子信号脉冲的宽度）可识别双联体，此类细胞应在通过荧光激活细胞分选仪前予以排除。（D）利用对照亲本细胞系（如TL1）的第16天细胞，通过EGFP（FL1通道）与自发荧光的门控（左图），确定真实荧光信号，从而界定Ngn3-EGFP+细胞群体（右图）。（E）红色箭头显示在分选前手动向右移动EGFP+门以增强对假阳性细胞的分离效果。（D）和（E）中的事件均基于（A-C）中所示区域（R1 - R3）进行门控。
图 4. 半固体培养中表达胰岛素的克隆的代表性显微照片。克隆随机分布，呈小的深色、非反光性细胞簇。各个克隆后续可用于基因和蛋白质表达分析，分别通过 RT-PCR 和免疫组织化学方法检测（未展示；参见视频）。
图 5. 一种可用于对单个前体细胞进行功能性和定量评估的集落形成实验。通过计数形成的集落数量，可计算出接种细胞中前体细胞的频率。每个集落内的细胞组成反映了起始前体细胞的谱系分化潜能。利用该实验方法，我们发现从小鼠胚胎干细胞获得的 Ngn3-EGFP+ 细胞富集了能够表达胰岛素的集落形成单位（ICFUs），即具有分化为表达胰岛素集落能力的前体细胞。2
表 1. 半固体培养基组分及添加顺序。
讨论
迄今为止，可用于对单个胰腺前体细胞进行定量和功能性评估的克隆形成实验仍十分有限，这极大地阻碍了胰腺干细胞及前体细胞生物学研究的进展。克隆形成实验的核心在于，它能够检测前体细胞的内在潜能，而不仅仅是其表型，从而可观察前体细胞的功能活性及其谱系分化潜能。此外，这也是一种定量工具，可用于确定特定细胞群体中前体细胞的数量。在造血干细胞研究领域，克隆形成实验在细胞鉴定以及解析这些细胞的生长因子需求、相互作用和谱系定向调控机制方面发挥了重要作用6。在胰腺前体细胞生物学领域，研究人员已开发出胰腺类器官7,8或群体培养系统9-13，然而这些实验方法无法在单细胞水平上回答生物学问题。若缺乏单细胞水平的分析，就无法明确证实多潜能胰腺干细胞/前体细胞的存在14。
本文展示了可利用含Matrigel的三维半固体培养系统来检测表达胰岛素的集落形成前体细胞。尽管已有悬浮培养系统15,16被开发出来，可使单个成年胰腺前体细胞增殖并分化为“胰腺球”（pancreatospheres），但我们的集落检测方法具有额外优势。首先，我们的半固体培养基系统允许每24孔板中每个500 μL培养体系接种多达25,000个分选细胞，同时使形成的集落数量保持在线性范围内2。相比之下，悬浮培养的胰腺球检测需依赖细胞分选仪的单细胞沉积技术以实现单细胞分析，因此需要更大体积的培养基和更多的培养箱空间。因此，当需要同时比较大量不同类型细胞的前体细胞活性时，我们的集落检测方法相对更简便且成本较低。其次，我们的半固体培养基可实现细胞外基质成分和生长因子的均匀分布，从而使增殖和分化过程可在同一孔中发生。相比之下，在悬浮培养中为细胞提供此类环境（尤其是基质环境）更为困难。我们认识到，使用本方法尚无法明确证明每个集落均来源于单个细胞，因为两个前体细胞可能随机靠近并共同形成一个集落。然而，该问题可通过单细胞操作技术进行二次分析加以克服。通过直接手工挑取分选后的单个细胞，可明确证实每个集落的单细胞来源。
总之，本文所述在半固体培养基中前体细胞形成表达胰岛素的克隆活性，为在单细胞水平上研究胰腺前体细胞的机制提供了独特的机会。例如，在先前的一项报告中我们发现，将基质胶（Matrigel，一种细胞外基质蛋白的粗提混合物）添加到培养基中，是Ngn3-EGFP+细胞形成表达胰岛素克隆所必需的条件2，这提示细胞外基质对这些前体细胞具有重要作用。利用该克隆形成实验，现在可进一步剖析并明确此类活性对特定基质的具体需求。除了研究来源于小鼠胚胎干细胞的前体细胞外，我们目前正在探究该体外（in vitro）实验体系是否也支持来自围产期及成年小鼠胰腺和肝脏，以及无胰岛的人类尸体胰腺组织中其他不同类型克隆的形成。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者感谢Klaus Kaestner博士惠赠小鼠Ngn3-EGFP胚胎干细胞系，感谢Lucy Brown女士及分析细胞计量核心实验室在细胞分选方面的协助。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）授予H.T.K.的R21DK069997和R01DK081587基金资助，以及由加州再生医学研究所（CIRM）授予M.W.和L.S.的培训基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X DMEM/F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| 胎牛血清 | Tissue Culture Biologicals | 201 | 参见第1.1节 |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5% |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | 低生长因子 |
| 甲基纤维素 | Sinetsu Chemical | 1,500 厘泊（高黏度） | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 人重组 Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| 人重组 VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24孔板 | Costar | 3473 | 超低 黏附 |
| 带网格的60 mm培养皿 | Nalge Nunc international | 169558 |
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